Summary
Detta protokoll beskriver metoder för att rena, kvantifiera och karakterisera extracellulära vesiklar (EVs) / exosomer från icke-vidhäftande / mesenkymala bröstpitelceller och för att använda dem för att överföra bröstkörtelbildande förmåga till luminala bröstpitelceller. EVs / exosomer härledda från stamliknande bröstpitelceller kan överföra denna cellegenskap till celler som intager EV / exosomer.
Abstract
Celler kan kommunicera via exosomer, ~ 100 nm extracellulära vesiklar (EVs) som innehåller proteiner, lipider och nukleinsyror. Non-adherent / mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC) -derivat extracellulära vesiklar kan isoleras från NAMEC-medium via differential ultracentrifugering. Baserat på dens densitet kan EVs renas via ultracentrifugering vid 110 000 x g. EV-beredningen från ultracentrifugering kan separeras ytterligare med användning av en kontinuerlig densitetsgradient för att förhindra kontaminering med lösliga proteiner. De renade EV-värdena kan sedan utvärderas ytterligare med hjälp av nanopartikel-spårningsanalys som mäter storleken och antalet blåsor i preparatet. De extracellulära vesiklarna med en storlek som sträcker sig från 50 till 150 nm är exosomer. NAMEC-härledda EV / exosomer kan intas av bröstpitelceller, som kan mätas genom flödescytometri och konfokalmikroskopi. Vissa bröstceller i stamceller ( t ex bröstkörtelbildande förmåga) kanÖverföras från de stamliknande NAMEC till bröstpitelceller via NAMEC-härledda EV / exosomer. Isolerade primära EpCAM hi / CD49f lo luminala bröstpitelceller kan inte bilda bröstkörtlar efter transplantation i musfettkuddar, medan EpCAM lo / CD49f hi basala bröstpitelceller bildar bröstkörtlar efter transplantation. Upptag av NAMEC-härledda EVs / exosomer av EpCAM hi / CD49f lo luminala bröstpitelceller låter dem generera bröstkörtlar efter transplantering i fettkuddar. De EV / exosomer som härrör från stamliknande bröstpitelceller överför bröstkörtelbildande förmåga till EpCAM hi / CD49f luminala bröstpitelceller.
Introduction
Exosomer kan mediera cellulär kommunikation genom att överföra membran och cytosoliska proteiner, lipider och RNA mellan cellerna 1 . Exosomedierad kommunikation har visat sig vara involverad i många fysiologiska och patologiska processer ( dvs. antigenpresentation, utveckling av tolerans 2 och tumörprogression 3 ). Exosomer har ofta innehåll liknande de hos källcellerna som frigör dem. Exosomerna kan således bära specifika cellegenskaper från källcellerna och överföra dessa egenskaper till cellerna som tar dem 4 .
Exosomer är 50-till 150 nm dubbla lager membranvesiklar och nuvarande specifika markörer ( t.ex. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix och TSG101). Exosomer måste således präglas av olika metoder för olika aspekter. Transmissionselektronmikroskopi kan användas för att visualisera membranvesiklarSåsom exosomer 4 , 5 . Nanopartikelspårningsanalys (NTA) och dynamisk ljusspridningsanalys (DLS) används för mätning av storlek och antal renade exosomer 4 . Lipidmembranhalten i exosomer kan verifieras med densitetsgradient. Exosomala markörer, såsom CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix och TSG101 6 , 7 , kan mätas genom Western blotting.
Mammarbasala celler har förmågan att generera bröstkörtlar när de implanteras i fettkuddar, medan luminala celler inte kan 8 , 9 , 10 . Således hänvisas även basala celler i bröst till återuppbyggande enheter för bröst. Genom att använda modellen av basala och luminala celler i bröstet kan evnen hos EV / exosomer att överföra cellegenskaper mellan olika cellpopulationer undersökas. Detta jobbDemonstrerar förfarandet för att överföra körtelbildande förmåga från basala epitelceller till bröstkorg hos bröstkorgs luminala epitelceller genom att använda EV / exosomer härledda från basala epitelceller från bröstmjölk. Luminala bröstpitelceller förvärvade basalcellegenskaper efter intag av EV / exosomer utsöndrade från basala celler och kan sedan bilda bröstkörtlar 4 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning som involverade djur uppfyllde protokoll godkända av Institutionskommittén för djurvård.
1. Extracellulär vesikel / exosomisolering och validering
- Culturmammepitelbasala celler, NAMEC 4 , med färskt, serumfritt medium framställt av 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 med natriumbikarbonat (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hydrokoriton (0,5 | ig / ml); Insulin (5 | ig / ml); Bovint hypofysextrakt (BPE; 35 | ig / ml); Och GW627368X (1 | ig / ml) i 15 cm rätter.
- Efter räkning av cellerna med en hemocytometer, frö 1,2 x 106 celler i 12 ml medium per 15 cm maträtt på dag 0 i 4 dagar 4 .
- Efter 4 dagar i odling centrifugeras odlingsmediet vid 300 xg under 5 minuter med användning av en bordscentrifug. Överför supernatanten till ett koniskt rör ( Figur 1 ).
- Centrifugera supernatantenVid 2000 xg i 20 minuter i en bordscentrifug. Överför supernatanten till ett ultracentrifugrör och lämna de döda cellerna och cellresterna ( Figur 1 ).
- Centrifugera supernatanten vid 10 000 xg i 30 min vid 4 ° C. Överför supernatanten till ett nytt ultracentrifugrör ( Figur 1 ).
- Centrifugera supernatanten vid 110 000 xg under 60 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten och resuspendera EV / exosompelleten i PBS ( Figur 1 ).
- Centrifugera supernatanten vid 110 000 xg under 60 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten. Resuspendera EV / exosompelleten i PBS ( Figur 1 ). Resuspendera pelleten isolerad från 240-480 ml NAMEC-konditionerat medium i 100 pl.
- Mät proteinkoncentrationen av EV-suspensionen med BCA-proteinanalysen. Se till att koncentrationen är ca 20-40 μg / 100 μL. Förvaras vid -20 ° C förvidare analys.
- Mät koncentrationen och storleken på EV / exosomer genom nanopartikelspårningsanalys (NTA), såsom beskrivits tidigare av Gardiner et al. 11 . Späd EVE / exosomer (20 μg / 100 μL) med PBS till 10 000 gånger för NTA-analys.
OBS: Resultatet av NTA-analysen återspeglar antal och storlek på de analyserade vesiklarna. - Bild EV / exosomer med transmissionselektronmikroskopi (TEM), som beskrivits tidigare av Lin et al 4 .
2. Exosomrening med hjälp av en densitetsgradient
- Resuspendera 110 000 g pelleten från steg 1,7 i 40% (vikt / volym) iodixanol i PBS (2 ml). Överlagra blandningen i följd med alikvoter av 30%, 20%, 10% och 5% (vikt / volym) jodixanol i PBS (2 ml vardera) för att bilda en densitetsgradient i ett ultracentrifugrör.
- Centrifugera blandningen vid 200 000 xg under 8 h vid 4 ° C.
- Samla varje gradientfraktion (10 fractions; 1 ml / fraktion) med en pipett från toppen av röret.
- Analysera förekomsten av exosommarkörer ( t.ex. CD81, CD9, CD63 och Tsg101) i varje fraktion med SDS-PAGE 12 och Western blot. Ladda 50 μl suspensioner av varje fraktion på en 10% gel innehållande 0,1% (vikt / volym) SDS och separera proteinerna i fraktioner med gelelektrofores.
- Överför proteinerna från en gel till ett PVDF-membran och inkubera membranet med antikroppar mot exosommarkörerna ( t.ex. CD81, CD9, CD63 och Tsg101) och hushållsprotein GAPDH över natten ( tabell av material ) vid 4 ° C.
OBS: Resultatet identifierar fraktionen som innehåller exosomer.
3. Extracellulär Vesikel / Exosommärkning
- Suspendera EVs / exosomer, erhållna i steg 1.7, i 10 | iM karboxifluoresceinsuccinimidyldiacetatester (CFSE) vid 20 | ig exosomalt protein / 100 | il. Förbered ett parallellt prov coErhållande av endast CFSE och PBS, bearbetad på samma sätt som en negativ kontroll för de senare EV / exosomupptagningsanalyserna. Låt blandningarna ligga vid 37 ° C i 30 minuter.
- Suspendera EV / exosomer i 50x volym PBS och centrifugera suspensionen vid 110.000 xg under 60 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten och resuspendera EV / exosompelleten i PBS. Upprepa steg 3.2 en gång.
- Suspendera EV / Exosomes i PBS i en koncentration av 20 μg exosomalt protein / 100 μL och filtrera sedan EV / exosomer genom 0,22 μm membran innan de adderar EV / exosomerna till cellerna.
4. Extracellulär Vesikel / Exosomupptagningsanalys
- För att bilda odlingsmedium blanda 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 med natriumbikarbonat (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hydrokoriton (0,5 | ig / ml); Insulin (5 | ig / ml); Och BPE (35 | ig / ml) 4 . Placera HMLE-cellerna i humant bröstpitel i 6-brunnsrätter (1 x 10 6 </ Sup> celler / brunn) en dag före EV / exosombehandling. Tillsätt 2 μg / ml CFSE-fluorescensmärkta EV / exosom, erhållen i steg 3.3, till odlingsmediet i HMLE-cellerna i 2-6 timmar. Behandla HMLE-cellerna i den negativa kontrollgruppen med den parallella beredningen, som beskrivs i steg 3.1.
- Efter 2- till 6-timmars inkubation tvätta cellerna två gånger med 4 ml PBS vid rumstemperatur.
- Lossa cellerna med 0,25% trypsin i 10 minuter och suspendera cellerna i PBS innehållande 0,2% FBS. Mät EV / exosomupptaget från fluorescensintensiteten i cellerna med hjälp av en fluorescenscellanalysator 4 . Bild cellerna som behandlats med EV / exosomer eller den negativa kontrollen med hjälp av konfokal mikroskopi.
OBS: Den gröna fluorescensen i cellerna orsakas av EV / exosomupptaget. Se legenden om Figur 6 för mikroskopinställningarna.
5. Isolering av primära musmammar-epitelceller
- Dissektera 2, 3, 4 och 5 bröstkörtlarna ( Figur 2 ) från 12 veckor gamla jungfru C57BL / 6-möss med sax och skär körtlarna i små bitar (2 mm 2 ) med hjälp av en rakhyvel.
- Ytterligare dissociera uppslamningen av bröstkörtlar (från 10 möss) under 60 minuter vid 37 ° C, 120 rpm omrörning med 50 ml DMEM / F12 innehållande 0,2% kollagenas typ IV, 0,2% trypsin, 5% FBS, 5 | ig / ml gentamycin , Och 1x penna strep.
- Pellla ner epitelorganoiderna från blandningen genom centrifugering vid 350 xg under 10 minuter.
- Suspendera epitelorganoiderna i 4 ml DMEM / F12 med 0,1 mg / ml DNas I i 5 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt 6 ml DMEM / F12 till en slutligVolym av 10 ml.
- Centrifugera suspensionen vid 400 xg i 10 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Resuspendera pelleten i 10 ml DMEM / F12. Centrifugera suspensionen, men slå bromsen när hastigheten når 400 x g. Kassera supernatanten.
OBS: Genom att slå bromsen pelleteras epitelorganoider snabbt, medan fibroblaster, som enskilda celler, fortfarande ligger i supernatanten. - Upprepa steg 5.6 och 5.7 5-7 gånger. Tillsätt en suspension av suspensionen till en hemocytometer och kontrollera sedan clearance av fibroblaster från organoidblandningen under mikroskopi efter varje centrifugeringsrunda ( Figur 3 ).
- Placera organoiderna i den gelatinbelagda skålen, erhållen i steg 5.1, under 48 timmar med DMEM / F12 innehållande 1x ITS, 5% FBS, 50 | ig / ml gentamycin, 10 ng / ml EGF och 1x penna strep.
- Efter 48 h avlägsnas de flytande cellerna i odlingen genom att ersätta mediet med färskt odlingsmedium utan FBS (DMEM / F12 innehållande 1x ITS, 50 | ig / ml gentamycin, 10 ng / ml EGF och 1x pen-strep).
- Bekräfta att ett monoskikt av bröstpitelceller migrerar och växer ut från de bifogade epitelorganoiderna inom 3 dagar.
6. Separation av primära musbasala / luminala mammaryt-epitelceller
- Efter den 3-dagars odlingen avlägsnas primära mammaceller från mus med en naturlig enzymblandning med proteolytisk och kollagenolytisk enzymaktivitet under 20 minuter. Neutralisera enzymaktiviteten med 5% FBS i PBS.
- Centrifugera suspensionen vid 450 xg i 10 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten. Resuspendera cellpelleten i 5 mg / ml dispas i 20 minuter. Neutralisera enzymaktiviteten med 5% FBS i PBS.
- Centrifugera suspensionen vid 450 xg i 10 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Re-suspenderade cellerna i 100 pl PBS med 0,2% FBS vid en koncentration av 10 7 celler / ml med utspäddAnti-CD49f och anti-EpCAM antikroppar på is under 1 h i mörkret.
- Tvätta cellerna med PBS och inkubera sedan cellerna med fluoroforkonjugerad sekundär antikropp på is under 30 minuter i mörkret.
- Tvätta och suspendera cellerna i PBS med 0,2% FBS.
- Sortera EpCAM hi / CD49f lo luminala bröstpitelceller på en cell sorterare 4 .
7. Extracellulär vesikel / exosombehandling
- Seed den sorterade EpCAM hi / CD49f lo luminala bröstpitelcellerna från steg 6.7 på gelatinbehandlade 6-brunnsrätter (2 x 10 5 celler / brunn) och behandla dem sedan med PBS eller de 2 μg / ml NAMEC-härledda EV / exosomerna Erhållen i steg 1.7.
- För att säkerställa den biologiska effekten av EV / exosomer vid långvarig odlingsbehandling, ersätt cellodlingsmediet med färskt medium innehållande PBS eller 2 ug / ml NAMEC-härledda EV / exosomer varannan dag. Dela inte musen braRy luminala celler under 10-dagars behandling.
8. Fettpumpinsprutning av mamma-epitelceller
- Bedöva en 3 veckors gammal C57BL / 6-möss med isofluoran 2-3% inhalerande medel.
- Placera den bedövade musen på ryggen. Ta bort pälsen i mitten av buken med en rakhyvel / hårkräm och rengör operationsplatsen med tre alternerande cykler av 70% alkohol och povidon-jod.
- Gör ett 1,5 cm vertikalt snitt genom huden längs den ventrala bröstkorgsområdet med sax och exponera sedan växelvis de högra och vänstra 4 : e bröstmuskulaturen.
- Rensa varje fettkudde genom att avlägsna körtelparenchyma med sax. Lokalisera lymfkörden i fettkudden och ta sedan bort hela körtelparenchymen under lymfkörteln.
OBS: Två tredjedelar av fettkudden ska förbli på plats. - Lossa cellerna som erhållits från steg 7.2 med en naturlig enzymblandning (se materialet ) med proteolytisk aNd kollagenolytisk enzymaktivitet under 10 min. Neutralisera enzymaktiviteten med 5% FBS i PBS.
- Centrifugera suspensionen vid 450 xg i 10 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten. Räkna cellerna med en hemocytometer och suspendera cellerna i PBS i en koncentration så att 15 μl innehåller den önskade celldosen (10 4 -10 2 cell / pad).
- Injicera 15 | il av epithelialcellsuspension i mitten i en fettkudde med en 100 μl glas spruta fäst vid en 27G nål.
- Upprepa steg 8.4-8.7 för fettkudden på andra sidan.
- Stäng huden med sårklämmor.
9. Mammary Gland Whole Mount
- Euthanize musen med CO 2 plus cervikal dislokation vid 8 veckor efter cellinjektionen (Steg 8.7).
- Gör ett vertikalt snitt genom hudskiktet från bröstregionen till inguinalområdet med hjälp av sax och exponera sedan både höger och vänster 4 : e mAmmary fettkuddar. Ta bort de 4 : e bröstkörtlarna ( Figur 2 ).
- Sprid fettkuddarna på glasmikroskopskivor och fixa fettkuddarna med Kahles fixativ (4% formaldehyd, 30% EtOH och 2% isättiksyra) vid rumstemperatur över natten.
Varning: Kahle fixativ är en irriterande. Gör detta steg i en kemisk huva. - Tvätta fettkuddarna i 250 ml 70% EtOH i 15 minuter och sedan i 250 ml dH20 i 5 minuter. Stänk fettkuddarna med karminaluminium (1 g karmin och 2,5 g aluminiumkaliumsulfat i 500 ml dH2O) vid rumstemperatur över natten.
- Tvätta fettkuddarna med 250 ml 70% EtOH under 15 minuter, 250 ml 95% EtOH under 15 minuter och 250 ml 100% EtOH under 15 minuter.
- Rengör fettkuddarna i xylen i dagar och stoppa xyleninkubationen när fettkuddarna blir transparenta.
Varning: Xylen är en irriterande. Gör detta steg i en kemisk huva. - Montera diabilderna wiMonteringsmediet och ta bilder (2.400 dpi) av fettkuddarna med en digital bildskanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eftersom det har visat sig att blockering av PGE2 / EP4-signaleringen utlöser EV / exosomfrisättning från basaliknande stamceller från bröstmjölk 4, presenterar detta arbete ett sätt att isolera de inducerade EVs / exosomen från mammalepithelial basalcell (NAMEC) -kultur. Eftersom NAMEC odlas i serumfritt medium finns det inga existerande EV / exosomer härledda från serum 13 . För celler odlade i serumhaltigt medium måste existerande exosomer i mediet förrensas genom ultracentrifugering vid 110 000 xg innan mediet används för att odla källcellerna för uppsamling av EV / exosomer 5 . EV / exosomer från det 4 dagars inducerade NAMEC-konditionerade mediet kan isoleras från 110 000 xg pelleten genom differentiell ultracentrifugering, såsom visas i figur 1 . Antalet och storleken på de isolerade vesiklarna i 110 000 xg pellEt kan mätas med hjälp av nanopartikelspårningsanalys (NTA). 110 000 g pelletsfraktionen isolerad genom differential ultracentrifugering innehåller huvudsakligen ~ 100 nm vesiklar ( Figur 4A ); Detta motsvarar storleken på exosomer (50-150 nm) som rapporterats i litteraturen. Dessutom visade TEM-analys att 110 000 g fraktioner av NAMEC-konditionerat medium innehåller rikliga membranvesiklar ( Figur 4B ). Fastän differential ultracentrifugering kan generera rimligt rena exosomer eliminerar följande reningssteg med användning av en densitetsgradient ytterligare föroreningar ( t.ex. proteinaggregat) 5 . I densitetsgradienten flyter exosomerna i gradienten på grund av lipidhalten i vesikeln, medan proteinaggregat, om några, ligger i botten av gradienten. Varje fraktion av gradienten uppsamlas för detektering av exosomtillverkare ( t.ex. CD81, CD63, CD9 och TSG101 , 7 ) genom Western blotting. Exosommarkörer kan detekteras i fraktionen med ~ 20% iodixanol ( Figur 5 ). Fraktionen innehållande exosomer kan spädas med PBS och utsättas för 200 000 xg ultracentrifugering för att isolera exosomerna. Den isolerade exosompelleten tvättas en gång i PBS och resuspenderas sedan i PBS och lagras vid -20 ° C för vidare analys.
Före mätning av upptag av NAMEC-härledda EV / exosomer av den icke-stamaktiga motparten av bröstpitelceller-HMLE-celler, måste EVs / exosomer märkas med ett fluorescerande färgämne ( t.ex. karboxifluoresceinsuccinimidylester (CFSE)). Ett parallellt prov som innehåller endast CFSE men inget EV / exosom behandlas i samma märkningsprocedur. Detta prov är en negativ kontroll som användes i följande EV / exosomupptagningsanalys för att återspegla effekten av en spårmängd av kvarstående fri CFSE färgämne. HMLE-celler odlas med CFSE-märkta, NAMEC-härledda EVs / exosomer eller den negativa kontrollen i 2-6 h och utsätts därefter för flödescytometri. Jämfört med de obehandlade HMLE-cellerna uttrycker HMLE-cellerna som odlas med den negativa kontrollen en något högre nivå av CFSE-signalen ( Figur 6A , röd linje mot orange linje), vilket återspeglar bakgrundsnivån för CFSE-signalering orsakad av kvarvarande fri CFSE kvar från EV / exosom märkningsprocess. I jämförelse med de negativa kontrollbehandlade HMLE-cellerna uttrycker HMLE-cellerna som odlas med CFSE-märkta, NAMEC-härledda exosomer en 10-faldig högre CFSE-signal ( Figur 6A , blå linje mot röd linje), vilket härrör från den specifika upptagningen Av CFSE-märkta EV / exosomer. Upptaget av CFSE-märkta, NAMEC-härledda EV / exosomer av HMLE-celler kan också observeras med konfokal mikroskopi. Medan de negativa kontrollbehandlade HMLE-cellerna inte uppvisar en CFSE-signal, upptar NA-upptagetMEC-härledda EV / exosomer av HMLE-celler kan observeras med CFSE-signalen under konfokalmikroskopet i CFSE-märkta EV / exosombehandlade celler ( Figur 6B ).
För att utvärdera huruvida NAMEC-härledda EV / exosomer kan överföra bröstkörtelbildande förmåga från stamliknande bröstbasala celler till bröstcellulära celler, isoleras först lammelceller från musbröstet för att möjliggöra analys av bröstkörtelbildning i möss. Musmammepitelceller isoleras från 12 veckor gamla möss. Bröstkörtlarna skärs i små bitar och dissocieras vidare med kollagenas och trypsin. De dissocierade epiteliala organoiderna och fibroblasterna kan separeras genom differentiell centrifugering, såsom beskrivs i steg 5,7 och 5,8. I varje centrifugeringsrunda bör pelleten i botten av rören innehålla huvudsakligen epiteliala organoider, och fibroblasterna och de enskilda cellerna ska flyta i supernatanent. Jämfört med blandningen innehållande både epiteliala organoider och fibroblaster före differentialcentrifugeringen ( Figur 3 , övre paneler), eliminerar de sex centrifugeringsrundorna de flesta fibroblaster och enskilda celler i blandningen ( Figur 3 , bottenpanel).
Bröstepitelcellerna ( Figur 7 ) hos epitelorganoiderna dissocieras vidare med användning av en naturlig enzymblandning med proteolytisk och kollagenolytisk enzymaktivitet och avlägsnas för att alstra enskilda celler i suspension. Sortering av encellsuspensionen genom uttryck av cellyta CD49f och EpCAM kan separera bröstceller från luminala celler (EpCAM hi / CD49f lo ), basalceller från mamma (EpCAM lo / CD49f hi ) och icke-epitelceller (EpCAM - ) ( Figur 8 ).
hi / CD49f lo luminala bröstpitelcellerna odlas med NAMEC-härledda EV / exosomer i 10 dagar, och de fräscha EVs / exosomer och medium ersätts varannan dag. Efter EV / exosombehandling implanteras bröstcellens luminala celler i de 4 : e bröstmjölkfettkuddarna ( figur 2 ) hos möss. Efter 8 veckor isoleras fettkuddarna och färgas för analys av bröstkörtelbildning ( Figur 9 ). Behandlingen med inducerade NAMEC-härledda EV / exosomer gör det möjligt för luminala celler att förvärva bröstkörtelbildande förmåga 4 . De NAMEC-härledda, EV / exosombehandlade bröstcellerna i luminala celler bildar bröstkörtlar i musfettkuddar ( Figur 9 ).
Figur 1: Illustration av extracellulaR Vesikel / Exosom Puri fi cationsmetod från Cell Culture Medium genom Differential Ultracentrifugation. Hastigheten och längden för varje centrifugering anges. Efter var och en av de första tre centrifugeringarna hålls supernatanten för nästa steg. Efter centrifugeringen av 110 000 x g hålles pelleten och supernatanterna kasseras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Muskärlkörtelanatomi. Möss har fem par bröstkörtlar, angivna med siffrorna 1-5, som ligger i fettkuddarna (röda) direkt under huden. Vänligen klicka här för att se en större version av thÄr figur.
Figur 3: Bilder av en blandning av epiteliala organoider och celler av fettkuddar före och efter differentialcentrifugering. Ljusfibrer av de isolerade fettkuddscellblandningarna före och efter differentialcentrifugering, taget från hemocytometern. Arrowhead: epiteliala organoider. Pil: fibroblaster och enskilda celler. Skalstång = 0,5 mm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Vesikelstorlek och koncentrationsanalys av NAMEC110.000 xg pelletsfraktion. 110 000 g pelletsfraktionen av NAMEC-mediet är kol Föreläst och utsatt för ( A ) nano-partikelspårningsanalys (NTA) och ( B ) transmissionselektronmikroskopi (TEM). Skala bar = 1 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Detektion av exosomer i fraktioner av densitetsgradienten. Western blot-analys av exosommarkörer CD81, CD9, CD63 och Tsg101 och hushållsgenen GAPDH avslöjar 20% jodixanolfraktionen innehållande exosomerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
55736fig6.jpg "/>
Figur 6: Detektion av extracellulär vesikel / exosomupptagning med flödescytometri och konfokal mikroskopi. EV / exosomupptagning mättes i HMLE-celler. CFSE-märkta, NAMEC-härledda EV / exosomer och negativ kontroll sättes till de angivna odlingarna under 6 timmar. Efter inkuberingen utsätts cellerna för ( A ) flödescytometri och ( B ) konfokalmikroskopi. CFSE (grön, excitation / emission (nm): 492/517; mikroskoplaserlinje: 488) flödesintensiteter återspeglar EV / exosomupptagningen. Cellkärnor färgas med DAPI (blå, excitation / emission (nm): 358/461; mikroskoplaserlinje: 405) och plasmamembranen färgas med plasmamembranfläckning (röd, excitation / emission (nm): 649/666; Mikroskoplaserlinje: 633; se materialet ). Konfokal objektiv: HCX PL APO 63x / 1,40-0,60 Olja. Skala bar = 20 μm.Ad / 55736 / 55736fig6large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Bilder av bifogade epitelorganoider. Ljusfiberbilder av bröstpitelceller som bildas av cellerna migrerar och växer ut från de bifogade epitelorganoiderna. Skalstång = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Sortering av primärmusmammar-epitelceller genom yt-epCAM och CD49f. Musmammepitelceller isolerade från fettkuddar hos 12 veckor gamla möss utsätts för cellsorteringing. Musmuskulär luminala celler berikas i EpCAM hi / CD49f lo populationen, markerad med den blå cirkeln; Basala celler berikades i EpCAM lo / CD49f hi populationen, markerad med den röda cirkeln. Icke-epitelceller är markerade med den svarta rutan i diagrammet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Mammärkörtelformation av primära mus-luminala mammarceller. Primärmusen EpCAM hi / CD49f lo luminala celler behandlas med PBS eller NAMEC-härledda EV / exosomer i cellodling i 10 dagar och implanteras i de rensade fettkuddarna av 3 veckor gamla möss. Mössen euthaniseras och necropsied efter 8 veckor för att analysera bröstkörtelformenation. Skala bar = 0,75 cm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Procentsats | MFI av EpCAM | MFI av CD49f | |
| Bröstcellscell | 0,437 | 4,57 x 10 4 | 8183 |
| (EpCAM hi / CD49f lo ) | |||
| Basalcell av mamma | 0,09 | 5452 | 2,23 x 10 ^ |
| (EpCAM lo / CD49f hi ) | |||
| Icke-epitelCell (EpCAM-) | 0,309 | 53 | 4619 |
Tabell 1: Procentandel och medelfluorescensintensitet (MFI) hos populationerna beskriven i figur 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Exosomer bär ofta egenskaper hos cellerna som släppte dem, och mängden frigjorda exosomer kan induceras av stimuli 4 . Odlingsmediet av celler kan samlas och utsättas för differential ultracentrifugering för EV / exosomuppsamling ( Figur 1 ). Det finns för närvarande ingen generell överenskommelse om en idealisk metod för att isolera EV / exosomer. Den optimala metoden som användes här har bestämts av nedströmsansökan 14 . Ultracentrifugering är en relativt snabb metod för isolering av EV / exosomer, vilket kan bevara den biologiska aktiviteten hos EV / exosomer. Emellertid innehåller blåsorna isolerade genom ultracentrifugering i allmänhet en blandning av EV, som innehåller exosomer producerade via endosomala fack och / eller blåsor producerade via spirande från cellmembranet.
Genom att analysera storlekarna av blåsor med NTA ( Figur 4A 15 .
Fastän differentiell ultracentrifugering kan användas för att rena exosomer, bör en densitetsgradient användas för att ytterligare avlägsna föroreningen av proteinaggregat från exosomvesiklarna i den isolerade 110 000 xg-fraktionen 5 t ex CD81, CD63, CD9 och TSG101 6 , 7 ). Genom att analysera närvaron av exosommarkörer i fraktionerna i densitetsgradienten är det möjligt att identifiera exosomer i fraktionen med ~ 20% iodixanol ( Figur 5 ). Multipla exosommarkörer bör undersökas för att identifiera exosomer i densitetsgradienten, eftersom varje population av exosomer kan uttrycka olika exosommarkörer 16 .
Upptag av EV / exosomer av celler kan mätas med användning av fluorescerande färgämnesmärkta EV / exosomer. Antalet celler som använder märkta EV / exosomer kan mätas med flödescytometri ( Figur 6A ). För att bekräfta att fluoRescens från cellerna beror på upptag av märkta EVs / exosomer men inte från fritt färgämne undersöktes mönstret av fluorescens i cellerna med användning av mikroskopi. Konfokal mikroskopi visar att mönstret av fluorescens i de EV / exosombehandlade cellerna punkteras ( Figur 6B höger panel). Punktera signaler kommer sannolikt från märkta EV / exosomer, inte från fri fluorescens. Punkteringssignalerna i cellerna kan analyseras vidare med strukturerad belysning med superupplösningsmikroskopi, som har den högsta upplösningen vid 85 nm 4 , 17 . Mikroskopi med superupplösning kan bekräfta att punkteringssignalerna är från ~ 100 nm ihåliga vesiklar, vilka liknar exosomer 4 . Dessa resultat antyder att NAMEC-härledda exosomer kan intas av bröstpitelceller i odling.
NAMEC-härledda EV / exosomer bär ofta molekyler ( t.ex. proteiner och miRNA) som är väsentliga för egenskaperna hos vissa celler 1 . Detta tyder på att NAMEC-härledda EV / exosomer kan överföra egenskaperna hos NAMEC ( t ex bröstkörtelbildande förmåga) till deras epitelceller. Eftersom mänskliga bröstpitelceller inte kan bilda bröstkörtlar xenogent i musfettpads 18 , 19 kan överföringen av körtelbildande förmåga undersökas med användning av musprioritala bröstpitelceller. Muspremiär EpCAM hi / CD49f lo luminala celler, som inte bildar bröstkörtlar, kan isoleras från 6 veckor gamla möss ( Figur 7 och Figur 8 ). De isolerade cellerna från musfettpads kan delas in i tre grupper ( dvs EpCAM hi / CD49f lo luminala celler, EpCAM lo / CD49f hi basala celler och EpCAM - icke-epitelceller) genom att undersöka leSkinn av yta EpCAM och CD49f ( Figur 8 ). EpCAM lo / CD49f höga basala celler kan bilda bröstkörtlar i fettkärl när de transplanteras i fettkuddar, men EpCAM hi / CD49f lo luminala celler kan inte 4 . Således kan EpCAM hi / CD49f lo luminala cellpopulationen användas för att undersöka förmågan hos framkallade NAMEC-härledda EV / exosomer att överföra bröstkörtelbildande förmåga. De isolerade EpCAM hi / CD49flo luminala cellerna kan hållas i odling i 7-10 dagar för EV / exosombehandling 4 . Det bör noteras att förvaring av primära bröstpitelceller in vitro längre kan dämpa cellernas livskraft.
De EV / exosombehandlade bröstcellens luminala celler kan implanteras i rensade fettkuddar för analys av bröstkörtelbildande förmåga. Fettkuddarna hos möss som används för implantation måste rensas vid 3 veckors ålder. enT 3 veckors ålder är bröstpitelcellerna begränsade till området mellan bröstvårtan och lymfen i en fettkudde. Mammarepitel i en fettkudde kan rensas genom att avlägsna regionen mellan bröstvårtan och lymfet vid 3 veckors ålder. Mammary luminala celler implanteras strax efter att fettkudden har rensats, och körtelbildningen av de implanterade cellerna kan analyseras vid 8 veckor efter implantationen. Effekten av NAMEC-härledda EV / exosomer vid överföring av bröstkörtelbildande förmåga till luminala celler i bröstkorg kan utvärderas genom körtelbildning av luminala celler och EV / exosombehandlade luminala celler ( Figur 9 ). De inducerade EV / exosomerna från NAMEC har egenskapen hos basala epitelceller från bröstkörteln - körtelbildande förmåga - och de luminala cellerna som intager de inducerade EV / exosomen från NAMEC kan förvärva egendomen från NAMEC via EV / exosomer. Detta arbete visar bevis som visar att molekyler som ansvarar för EV / exosommediaÖverföring av bröstkörtelbildningsförmåga finns närvarande i lipidflottor av EV / exosomer 4 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Health Research Institutes (05A1-CSPP16-014, HJL) och från ministeriet för vetenskap och teknik (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K ultracentrifuge | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | for nanoparticle tracking analysis (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). |
| CD81 antibody | GeneTex | GTX101766 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD9 antibody | GeneTex | GTX100912 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD63 antibody | Abcam | Ab59479 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| TSG101 antibody | GeneTex | GTX118736 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | fluorescence cell analyzer | |
| collagenase Type IV | Thermo | 17104019 | |
| trypsin | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite |
| accutase | ebioscience | 00-4555-56 | a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity |
| dispase | STEMCELL | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL |
| anti-CD49f antibody | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anti-EpCAM antibody | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs) | gifts from Dr. Robert Weinberg | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| sodium bicarbonate | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (bovine pituitary extract) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15 cm culture dish | Falcon | 353025 | |
| table-top centrifuge | Eppendrof | Centrifuge 3415R | |
| ultracentrifuge tube | Beckman | 344058 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | HT7700 | |
| gelatin | STEMCELL | 7903 | |
| 10 cm culture dish | Falcon | 353003 | |
| 6-well culture dish | Corning | 3516 | |
| female C57BL/6 mice | NLAC (National Laboratory Animal Center | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | BioWest | S01520 | |
| gentamycin | Thermo Fisher Scientific | 15710072 | |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| isofluorane | Halocarbon | NPC12164-002-25 | |
| formaldehyde | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Ethanol) | J.T. Baker | 800605 | |
| glacial acetic acid | Panreac | 131008.1611 | |
| aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Xylene | Leica | 3803665 | |
| 0.22 μm membranes | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Wound Clip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C10046 | plasma membrane stain |
References
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Boelens, M., et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways. Cell. 159 (3), 499-507 (2014).
- Lin, M. C., et al. PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles. Stem Cells. , (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- György, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Olver, C., Vidal, M. Proteomic analysis of secreted exosomes. Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Prater, M. D., et al. Mammary stem cells have myoepithelial cell properties. Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells - a new regulatory pathway. Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
- Outzen, H. C., Custer, R. P. Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
