Summary
이 프로토콜은 non-adherent / mesenchymal 유방 상피 세포에서 세포 외 소포 (EVs) / 엑소 좀을 정화, 정량화 및 특성화하고 유선 형성능을 내유성 상피 세포로 전달하는 방법을 설명합니다. 줄기 모양의 유방 상피 세포로부터 유래 된 EVs / 엑소 좀은이 세포 특성을 EVs / 엑소 좀을 섭취하는 세포로 전달할 수있다.
Abstract
세포는 단백질, 지질 및 핵산을 포함하는 ~ 100-nm 세포 외 소포 (EVs) 인 엑소 좀을 통해 전달할 수 있습니다. Non-adherent / mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC) 유래 세포 외 소포는 차별적 인 초 원심 분리를 통해 NAMEC 배지에서 분리 할 수 있습니다. 밀도에 따라 EV는 110,000 x g에서 초 원심 분리를 통해 정제 할 수 있습니다. 초 원심 분리로 얻은 EV 준비물은 가용성 단백질에 의한 오염을 방지하기 위해 연속 밀도 구배를 사용하여 더욱 분리 할 수 있습니다. 그런 다음 정화 된 EVs는 나노 입자 추적 분석을 사용하여 추가로 평가할 수 있으며, 이는 준비 과정에서 소포의 크기와 수를 측정합니다. 50 내지 150 nm 범위의 세포 외 소포가 엑소 좀이다. NAMEC에서 추출한 EVs / exosomes는 유선 상피 세포에서 섭취 할 수 있는데, 이는 유동 세포 계측법과 공 촛점 현미경으로 측정 할 수 있습니다. 일부 유방 줄기 세포 특성 ( 예 : 유선 형성 능력)은줄기 모양의 NAMEC에서 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀을 통해 유방 상피 세포로 전달 될 수있다. 격리 된 일차 성 EpCAM hi / CD49f lo 내시경 상피 세포는 마우스 지방 패드에 이식 된 후 유방 땀샘을 형성 할 수 없으며, EpCAM lo / CD49f hi 기저 유방 상피 세포는 이식 후 유방 땀샘을 형성합니다. EpCAM hi / CD49f lo luminal mammary 상피 세포에 의한 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀의 섭취는 지방 패드에 이식 된 후 유방 땀샘을 생성하게한다. 줄기 모양의 유방 상피 세포로부터 유래 된 EVs / 엑소 좀은 유방 내 형성 능력을 EpCAM hi / CD49f lo 내강 유방 상피 세포로 전달한다.
Introduction
Exosomes는 막과 세포질 단백질, 지질 및 RNA를 세포간에 전달하여 세포 간 통신을 매개 할 수 있습니다 1 . Exosome-mediated communication은 많은 생리 학적 및 병리학 적 과정 ( 즉, 항원 제시, 내성 2 의 발달 및 종양 진행 3 )에 관여하는 것으로 입증되었습니다. 엑소 좀은 종종 그것들을 방출하는 원천 세포와 비슷한 내용을 가지고있다. 따라서, exosomes은 소스 세포에서 특정 세포 속성을 수행하고 4 그들을 섭취 세포 에이 특성을 전송할 수 있습니다.
Exosomes는 50 ~ 150 nm의 이중층 멤브레인 베 시클이며 특정 마커 ( 예 : CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix 및 TSG101)를 나타냅니다. 따라서, 엑소 좀은 다양한 측면에 대한 다양한 방법으로 특징 지어 져야한다. 투과 전자 현미경으로 막 소포를 시각화 할 수 있습니다.엑소 좀 4 , 5 와 같은 나노 입자 추적 분석 (NTA)과 동적 광산란 분석 (DLS)은 정제 된 엑소 좀의 크기와 수를 측정하는 데 사용됩니다 4 . 엑소 좀의 지질막 함량은 밀도 구배로 확인할 수 있습니다. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix 및 TSG101 6 , 7 같은 엑소 좀 마커는 웨스턴 블 랏팅으로 측정 할 수 있습니다.
유방 기저 세포는 유방 패드에 이식 될 때 유선을 생성 할 수있는 능력이 있지만 luminal 세포는 8 , 9 , 10 일 수 없습니다. 따라서, 유방 기초 세포는 유방 재 분산 단위라고도합니다. 유방 기저 세포 및 내강 세포의 모델을 사용하여 EVs / 엑소 좀이 다른 세포 집단간에 세포 특성을 전달하는 능력을 검사 할 수 있습니다. 이 일유방 기초 상피 세포에서 유래 한 EVs / exosomes를 이용하여 유방 기초 상피 세포에서 유방 내피 세포로 유선 형성능을 전달하는 방법을 보여줍니다. 근위 유방 상피 세포는 기저 세포에서 분비 된 EV / 엑소 좀을 섭취 한 후 기저 세포 특성을 획득하고 유방 땀 샘을 형성 할 수 있습니다 4 .
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Protocol
동물과 관련된 모든 연구는 동물 관리위원회 (Institutional Animal Care Committee)가 승인 한 의정서를 준수했습니다.
1. 세포 외 소포 / 엑소 좀 격리 및 검증
- 문화 유방 상피 기저 세포, NAMECs, 500 mL의 MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL의 중탄산 나트륨 (0.2438 %)을 함유 한 DMEM / F12로 제조 된 신선한 무 혈청 배지; EGF (5 ng / mL); hydrocoritisone (0.5 μg / mL); 인슐린 (5 μg / mL); 소 뇌하수체 추출물 (BPE; 35㎍ / mL); 및 GW627368X (1 μg / mL)를 15 cm 접시에 넣었다.
- hemocytometer로 세포를 계산 후 4 일 동안 0 일째에 15cm dish 당 12mL의 배지에 1.2x10 6 세포를 사육한다.
- 배양 4 일 후 탁상용 원심 분리기를 사용하여 300 xg에서 5 분간 원심 분리한다. 상등액을 원추형 튜브 ( 그림 1 )로 옮긴다.
- 상등액을 원심 분리한다.탁상용 원심 분리기에서 2,000 xg에서 20 분간. 뜨는 원심 분리기 튜브에 뜨는를 전송하고 죽은 세포와 세포 잔해를 남겨주세요 ( 그림 1 ).
- 4 ℃에서 30 분 동안 10,000 xg에서 상층 액을 원심 분리한다. 상등액을 새로운 초 원심 분리기 튜브 ( 그림 1 )로 옮긴다.
- 4 ℃에서 60 분 동안 110,000 xg에서 상층 액을 원심 분리한다. 뜨는을 제거하고 PBS ( 그림 1 )에서 EV / exosome 펠렛을 resuspend.
- 4 ℃에서 60 분 동안 110,000 xg에서 상층 액을 원심 분리한다. 뜨는을 제거합니다. PBS에 EV / exosome 펠렛을 Resuspend ( 그림 1 ). 100 μL에서 NAMEC - 조건 매체 240-480 ML에서 격리 된 펠렛을 Resuspend.
- BCA 단백질 분석으로 EV 현탁액의 단백질 농도를 측정하십시오. 농도가 20-40 μg / 100 μL 정도인지 확인하십시오. -20 ℃에서 보관추가 분석.
- 이전에 Gardiner 등이 설명한 것처럼 나노 입자 추적 분석 (NTA)을 통해 EVs / exosomes의 농도와 크기를 측정하십시오 . 11 . NTA 분석을 위해 PBS로 EVs / exosomes (20 μg / 100 μL)를 10,000 배로 희석합니다.
참고 : NTA 분석의 결과는 분석 된 소포의 수와 크기를 반영합니다. - 린 (Lin) 등 4 에 의해 이전에 기술 된 바와 같이, 투과 전자 현미경 (TEM)으로 EVs / 엑소 좀을 이미지화한다.
2. 밀도 구배를 이용한 Exosome 정제
- PBS (2 mL) 중 40 % (w / v) iodixanol에서 1.7 단계의 110,000 g 펠렛을 재현 탁한다. Ultracentrifuge 튜브에 밀도 기울기를 형성하기 위해 PBS (각각 2 mL)에 30 %, 20 %, 10 % 및 5 % (w / v) iodixanol의 분량으로 혼합물을 중첩하십시오.
- 4 ° C에서 8 시간 동안 200,000 xg에서 혼합물을 원심 분리하십시오.
- 각 그래디언트 분율 (10도 프랙털ons; 1 mL / 분획)을 피펫으로 튜브의 꼭대기에서 꺼냈다.
- SDS-PAGE 12 및 Western blot으로 각 분획에서 exosome marker ( 예 : CD81, CD9, CD63 및 Tsg101)의 존재를 분석합니다. 0.1 % (w / v) SDS를 포함하는 10 % 겔에 각 분획의 50 μL 현탁액을 적재하고 겔 전기 영동으로 분획으로 단백질을 분리한다.
- 단백질을 겔에서 PVDF 막으로 옮기고 exosome 마커 ( 예 : CD81, CD9, CD63 및 Tsg101)에 대한 항체와 멤브레인을 4 ℃에서 하룻밤 동안 보관하십시오 (재료 표 ).
참고 : 결과는 exosomes를 포함하는 분획을 식별합니다.
3. 세포 외 소포 / 엑소 좀 표지
- 엑소 솜 단백질 20 μg / 100 μL에서 10 μM carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester (CFSE)에 1.7 단계에서 얻은 EVs / exosomes를 정지시킨다. 병렬 샘플 공동 작성동일한 방식으로 처리 된 CFSE 및 PBS만이 나중에 EV / 엑소 좀 섭취 검정에 대한 음성 대조군으로 사용된다. 30 분 동안 37 ° C에서 혼합물을 둡니다.
- EV 50 분의 PBS에서 EVs / exosomes를 일시 중지하고 4에서 60 분 동안 110,000 xg에서 현탁액을 원심 분리하십시오 ° C. 뜨는를 제거하고 PBS에 EV / exosome 펠렛을 resuspend. 한 번 단계 3.2를 반복하십시오.
- exosomal 단백질 / 100 μL 20 μg의 농도에서 PBS에 EVs / exosomes을 일시 중지하고 세포에 EVs / exosomes를 추가하기 전에 0.22 μm의 세포막을 통해 EVs / exosomes를 필터링합니다.
4. 세포 외 소포 / 엑소 좀 흡수 분석법
- 배양 배지를 만들기 위해 MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL의 DMEM / F12를 중탄산 나트륨 (0.2438 %)과 혼합한다. EGF (5 ng / mL); hydrocoritisone (0.5 μg / mL); 인슐린 (5 μg / mL); 및 BPE (35 μg / mL) 4 . 6 잘 접시에 인간 mammary 상피 HMLE 세포를 플레이트 (1 × 10 6 </ sup> 세포 / 웰) EV / 엑소 좀 처리 하루 전에. 2-6 H 조 HMLE 세포의 문화 매체에 단계 3.3에서 얻은 2 μg / ML CFSE 형광 라벨 EVS / exosome을 추가합니다. 단계 3.1에서 설명한 병렬 준비와 함께 부정적인 제어 그룹의 HMLE 세포를 처리합니다.
- 2-6 시간 배양 후 실온에서 PBS 4 mL로 세포를 두 번 씻어 낸다.
- 10 분 0.25 % 트립신으로 세포를 분리하고 0.2 % FBS를 포함하는 PBS에 세포를 다시 일시 중지합니다. 형광 셀 분석기 4 를 사용하여 세포의 형광 강도에서 EV / exosome 이해를 측정합니다. 공 촛점 현미경을 사용하여 EVs / exosomes 또는 부정적인 컨트롤로 치료 세포를 이미지.
참고 : 세포의 녹색 형광은 EV / exosome 섭취로 인해 발생합니다. 현미경 설정에 대해서는 그림 6 의 범례를 참조하십시오.
5. 일차 마우스 유방 상피 세포의 분리
- 가위를 사용하여 12 주 된 처녀 암컷 C57BL / 6 마우스에서 2, 3, 4, 5 번 유방 땀샘 ( 그림 2 )을 해부하고 면도기를 사용하여 작은 조각 (2mm 2 )으로 땀샘을 자릅니다.
- 추가로 0.2 % 콜라게나 제 타입 IV, 0.2 % 트립신, 5 % FBS, 5 μg / ML gentamycin을 포함하는 DMEM / F12 50 ML와 37 ° C, 120 rpm의 교반에서 60 분 (10 생쥐) 유방 땀샘의 해리 , 1x pen-strep.
- 10 분 동안 350 XG에서 원심 분리하여 혼합물에서 상피 organoids를 펠렛.
- 상온에서 5 분 동안 0.1 MG / ML DNase I와 DMEM / F12의 4 ML에 상피 organoids를 중단. 최종 6 ML의 DMEM / F12를 추가10 mL의 부피.
- 현탁액을 실온에서 10 분 동안 400 xg에서 원심 분리하고 상등액을 버린다.
- 10 ML의 DMEM / F12에 펠렛을 Resuspend. 서스펜션을 원심 분리하지만 속도가 400 x g에 도달하면 브레이크를 맞 춥니 다. 뜨는 물을 버린다.
참고 : 브레이크를 치면, 상피 organoids 신속하게 pelleted, fibroblasts, 하나의 세포로, 여전히 뜨는에 머물러 있습니다. - 5.6 단계와 5.7 단계를 5-7 회 반복하십시오. hemocytometer에 정지 현탁액을 추가하고 원심 분리 ( 그림 3 ) 각 라운드 후 현미경하에 organoid 혼합물에서 fibroblasts의 정리를 확인하십시오.
- 1x ITS, 5 % FBS, 50㎍ / mL gentamycin, 10ng / mL EGF 및 1x 펜 - 스트렙토닌을 함유하는 DMEM / F12로 단계 5.1에서 얻은 젤라틴 코팅 된 접시에 유기체를 플레이트한다.
- 48 시간 후, FBS없이 새로운 배지로 배지를 교체하여 배양 물에서 부유 세포를 제거한다1 x ITS, 50 μg / mL gentamycin, 10 ng / mL EGF 및 1x pen-strep를 함유하는 DMEM / F12).
- 유방 상피 세포의 단일 층이 3 일 안에 부착 된 상피 기관 종에서 이동 및 성장한다는 것을 확인하십시오.
6. 일차 마우스 기초 / Luminal 유방 상피 세포의 분리
- 3 일 배양 후, 단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소 활성을 갖는 천연 효소 혼합물을 마우스 기본 유방 세포에서 20 분 동안 분리한다. PBS에서 5 % FBS로 효소 활성을 중성화하십시오.
- 현탁액을 실온에서 10 분간 450 xg으로 원심 분리하고 상등액을 버린다. 20 분 동안 5 MG / ML dispase에 세포 펠렛을 Resuspend. PBS에서 5 % FBS로 효소 활성을 중성화하십시오.
- 현탁액을 실온에서 10 분간 450 xg으로 원심 분리하고 상등액을 버린다.
- 희석과 10 7 세포 / ML의 농도 0.2 % FBS와 100 μL PBS에 세포를 다시 정지항 -CD49f 및 항 -EpCAM 항체를 얼음에서 1 시간 동안 어둠 속에서 처리 하였다.
- PBS로 세포를 씻어 낸 다음 어둠 속에서 30 분 동안 얼음 위에 형광 물질이 결합 된 2 차 항체로 세포를 부화시킵니다.
- 0.2 % FBS로 PBS에서 세포를 세척하고 재현 탁한다.
- EpCAM hi / CD49f lo luminal mammary 상피 세포를 세포 분류기 4로 분류하십시오.
7. 세포 외 소포 / 엑소 좀 처리
- 젤라틴 코팅 6 잘 요리 (2 X 10 5 세포 / 음)에 단계 6.7에서 정렬 EpCAM 안녕 / CD49f lo luminal mammary 상피 세포 씨앗 후 PBS 또는 2 μg / ML NAMEC 파생 EVs / exosomes로 그들을 치료 1.7 단계에서 얻은
- 장기간의 배양 처리에서 EV / 엑소 좀의 생물학적 효능을 보장하기 위해 PBS 또는 2 μg / mL NAMEC 파생 EVs / 엑소 좀을 함유하는 새로운 배지로 세포 배양 배지를 교체하십시오. 마우스 prima를 분할하지 마라.10 일간의 치료 중 luminal cell을 관찰 하였다.
유방 상피 세포의 지방 패드 주입
- 3 주된 여성 C57BL / 6 마우스를 isofluorane 2-3 % 흡입제로 마취하십시오.
- 마취 된 마우스를 뒤쪽에 놓습니다. 중년 복부 면도기 / 모발 크림을 사용하여 모피를 제거하고 70 % 알콜 및 포비돈 요오드 3 회 교대로 수술 부위를 닦으십시오.
- 가위로 복부 흉부 - 사타구니 부위를 따라 피부를 통해 1.5 cm 수직 절개를하고 오른쪽 및 왼쪽 4 번째 유방 지방 패드를 교대로 노출시킵니다.
- 유선 실질을 가위로 제거하여 지방 패드를 모두 지 웁니다. 지방 패드에서 림프절을 찾은 다음 림프절 아래의 전체 샘 실질을 제거하십시오.
참고 : 지방 패드의 3 분의 2는 그대로 두어야합니다. - 단계 7.2에서 얻은 세포를 천연 효소 혼합물 ( 물질 표 참조)로 단백질 분해성 a콜라겐 분해 효소 활성 10 분. PBS에서 5 % FBS로 효소 활성을 중성화하십시오.
- 현탁액을 실온에서 10 분간 450 xg으로 원심 분리하고 상등액을 버린다. hemocytometer로 세포를 세고 15 μL에 원하는 세포 복용량 (10 4 -10 2 세포 / 패드)이 포함 된 농도의 PBS에 세포를 정지시킵니다.
- 27G 바늘에 부착 된 100 μL 유리 주사기를 사용하여 지방 패드에 유방 상피 세포 현탁액의 15 μL를 주입.
- 다른 쪽의 지방 패드에 대해 8.4-8.7 단계를 반복하십시오.
- 상처 클립으로 피부를 닫으십시오.
9. 유선 전체 마운트
- 세포 주입 후 8 주째에 이산화탄소와 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사하십시오 (단계 8.7).
- 가위를 사용하여 흉부 영역에서 사타구니 영역으로 피부 레이어를 통해 수직 절개를 만들고 오른쪽과 왼쪽 모두를 노출 4 분ammary 지방 패드. 네 번째 유방 땀샘을 제거하십시오 ( 그림 2 ).
- 유리 현미경 슬라이드에 지방 패드를 퍼지하고 하룻밤 실온에서 Kahle의 고정액 (4 % 포름 알데히드, 30 % EtOH 및 2 % 빙초산)로 지방 패드를 고정합니다.
주의 : Kahle의 정착액은 자극제입니다. 화학 물질 후드에서이 단계를 수행하십시오. - 지방 패드를 50 분간 70 % EtOH 250 mL에 넣고 15 분 동안 씻은 다음 5 분 동안 250 mL의 dH 2 O에서 씻으십시오. 살찐 명반을 실온에서 하룻밤 동안 밤새 카민의 명반 (카민 1g과 황산 칼륨 2.5g을 dH 2 O 500mL에 넣음)으로 염색합니다.
- 지방 패드를 15 분 동안 250 mL의 70 % EtOH, 15 분 동안 95 % EtOH 250 mL 및 15 분 동안 100 % EtOH 250 mL로 씻으십시오.
- 뚱뚱한 패드가 투명하게 될 때 일 동안 자일 렌에있는 뚱뚱한 패드를 청소하고 자일 렌 부화를 멈추십시오.
주의 : 크실렌은 자극제입니다. 화학 물질 후드에서이 단계를 수행하십시오. - 슬라이드 마운트하기디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 지방 패드의 이미지 (2,400 dpi)를 촬영합니다.
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Representative Results
PGE 2 / EP 4 신호 전달을 막음으로써 유방 기초 형 줄기 세포 4 에서 EV / 엑소 좀 방출을 유발한다는 것이 보여지기 때문에,이 연구는 유방 상피 기저 세포 (NAMEC) 배양으로부터 유도 된 EVs / 엑소 좀을 분리하는 방법을 제시한다. NAMEC은 혈청이없는 배지에서 배양되기 때문에 혈청에서 유래 된 EV / 엑소 좀은 존재하지 않는다. 혈청 함유 배지에서 배양 된 세포의 경우, 배지의 선재 exosomes는 EVs / exosomes 5 의 수집을위한 소스 세포를 배양하기 위해 배지가 사용되기 전에 110,000 xg에서 초 원심 분리에 의해 미리 세척되어야합니다. 4 일 유도 된 NAMEC 조건화 배지의 EVs / 엑소 좀은 그림 1 에서와 같이 차동 초 원심 분리에 의해 110,000 xg 펠렛으로부터 분리 할 수 있습니다. 격리 된 소포의 수와 크기는 110,000 xg pellet는 나노 입자 추적 분석 (NTA)을 사용하여 측정 할 수 있습니다. 차별적 인 초 원심 분리에 의해 분리 된 110,000g 펠렛 분획은 주로 ~ 100nm 소포를 함유한다 ( 도 4A ); 이것은 문헌에보고 된 엑소 좀 (50 ~ 150 nm)의 크기와 일치한다. 또한, TEM 분석은 NAMEC 조건화 된 배지의 110,000g 분획이 풍부한 막 소포를 함유 함을 보였다 ( 도 4B ). 차별화 된 초 원심 분리가 합리적으로 순수한 엑소 좀을 생성 할 수 있지만, 밀도 구배를 사용한 다음의 정제 단계는 오염물 ( 예 : 단백질 응집물)을 더 제거합니다 5 . 밀도 구배에서, exosomes는 vesicle의 지질 함량 때문에 그라데이션에 떠 다니는 반면, 단백질 응집체는 그라디언트의 맨 아래에 머물러 있습니다. 그라디언트의 각 부분은 exosome 제조사 ( 예 : CD81, CD63, CD9 및 TSG101)의 검출을 위해 수집됩니다 , 7 )을 Western blotting으로 분석 하였다. Exosome 마커는 ~ 20 % iodixanol을 갖는 분획에서 검출 될 수 있습니다 ( 그림 5 ). 엑소 좀을 포함한 분획을 PBS로 희석하고 200,000 xg 초 원심 분리하여 엑소 좀을 분리 할 수 있습니다. 분리 된 exosome pellet은 PBS에서 한 번 세척 한 다음 PBS에 재현 탁하고 추가 분석을 위해 -20 ° C에 보관합니다.
유방 상피 세포 인 HMLE 세포의 non-stem counterpart에 의한 NAMEC 유래 EVs / exosomes의 섭취를 측정하기 전에 EVs / exosome을 형광 염료 ( 예 : carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE))로 표지해야합니다. CFSE 만 포함하고 EV / exosome은 포함하지 않는 평행 시료는 동일한 표지 절차로 처리됩니다. 이 샘플은 미량의 잔류 자유 CFS의 효과를 반영하기 위해 다음 EV / 엑소 좀 섭취 분석에 사용 된 음성 대조군입니다E 염료. HMLE 세포는 CFSE - 라벨, NAMEC 파생 EVs / exosomes 또는 2-6 H에 대한 부정적인 컨트롤과 함께 배양하고 다음 유동 세포 계측법을 받게됩니다. 미처리 된 HMLE 세포와 비교하여, 음성 대조군과 배양 된 HMLE 세포는 약간 더 높은 수준의 CFSE 신호를 나타내며 ( 그림 6A , 빨간색 선 대 주황색 선), 남아있는 자유 CFSE로 인한 CFSE 신호의 배경 수준을 반영합니다 EV / 엑소 좀 라벨링 과정. 또한, 네거티브 컨트롤 - 처리 HMLE 세포와 비교하여, CFSE- 표지 된 NAMEC- 유도 된 엑소 좀으로 배양 된 HMLE 세포는 특이 적 흡수에 기인 한 10 배 더 높은 CFSE 신호를 나타낸다 ( 도 6A , 청색 라인 대 적색 라인) CFSE로 표지 된 EVs / 엑소 좀. HMLE 세포에 의한 CFSE- 표지 된 NAMEC- 유도 된 EVs / 엑소 좀의 흡수는 또한 공 초점 현미경에 의해 관찰 될 수있다. 음성 대조군 처리 된 HMLE 세포는 CFSE 신호를 나타내지 않지만, NA의 흡수HMLE 세포에 의한 MEC 유래 EVs / exosomes는 CFSE- 표지 된 EV / exosome- 처리 세포에서 공 촛점 현미경 하에서 CFSE 신호로 관찰 할 수있다 ( 도 6B ).
NAMEC 유래 EVs / exosomes가 줄기 유래 기저 세포에서 유방 내강 세포로 유선 형성능을 옮길 수 있는지 평가하기 위해 마우스 유방 내강 세포를 먼저 분리하여 마우스에서 유선 형성을 분석 할 수 있습니다. 마우스 유방 상피 세포는 12 주 된 쥐에게서 분리됩니다. 유선은 작은 조각으로 절단되고 콜라게나 제와 트립신으로 더 해체됩니다. 해리 된 상피 기관 체 및 섬유 아세포는 단계 5.7 및 5.8에서 기술 된 바와 같이 차동 원심 분리에 의해 분리 될 수있다. 원심 분리의 각 라운드에서, 튜브의 바닥에있는 펠렛은 주로 상피 organoids을 포함해야하며, 섬유 아 세포와 단일 세포 supernatan에 떠 있어야한다티. 차등 원심 분리 ( 그림 3 , 상단 패널) 전에 상피 organoids과 섬유 아 세포 모두를 포함하는 혼합물에 비해, 원심 분리의 여섯 라운드는 혼합물 ( 그림 3 , 하단 패널)에서 대부분의 섬유 아 세포와 단일 세포를 취소합니다.
상피 organoids의 mammary 상피 세포 ( 그림 7 )는 proteolytic 및 콜라겐 분해 효소 활동과 자연의 효소 혼합물을 사용하여 추가 dissociated 및 처분에 단일 세포를 생성 dispase. 단일 세포 현탁액을 세포 표면 CD49f 및 EpCAM의 발현으로 분류하면 유방 내강 세포 (EpCAM hi / CD49f lo ), 유방 기초 세포 (EpCAM lo / CD49f hi ) 및 비 - 상피 세포 (EpCAM - )를 분리 할 수있다 ( Figure 8 ).
hi / CD49f lo 관강 내유 상피 세포를 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀과 함께 10 일 동안 배양하고 신선한 EVs / 엑소 좀과 배지를 2 일마다 교체한다. EV / exosome 치료 후, 유방 내강 세포는 생쥐의 4 번째 유방 지방 패드 ( 그림 2 )에 이식됩니다. 8 주 후 지방 패드를 분리하고 유선 형성 분석을 위해 염색합니다 ( 그림 9 ). 유도 된 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀으로 치료하면 내강 세포가 유선 형성능을 획득 할 수 있습니다 4 . NAMEC에서 추출한 EV / exosome으로 처리 한 유방 내강 세포는 마우스 지방 패드에서 유선을 형성합니다 ( 그림 9 ).
그림 1 : Extracellula의 그림Differential Ultracentrifugation에 의한 세포 배양 배지에서의 소포 / 엑소 좀 정화 방법. 각 원심 분리의 속도와 길이가 표시됩니다. 처음 3 회의 원심 분리 한 후에 상층 액은 다음 단계를 위해 보관됩니다. 110,000 × g 원심 분리 후, 펠릿을 보관하고 상등액을 버렸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 마우스 유선 조직. 마우스는 피부 밑에있는 지방 패드 (적색)에 1-5라는 숫자로 표시된 5 쌍의 유선을 가지고 있습니다. th의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.숫자입니다.
그림 3 : 상피 organoids와 지방 패드의 세포의 이미지의 차동 원심 분리 전후. hemocytometer에서 추출한 차동 원심 분리 전후의 분리 된 지방 패드 세포 혼합물의 Bright-field 이미지. 화살촉 : 상피 조직 체. 화살표 : 섬유 아 세포 및 단일 세포. 눈금 막대 = 0.5 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : NAMEC110,000 xg Pellet Fraction의 소포 크기와 농도 분석. NAMEC 배지의 110,000g 펠렛 분획은 컬럼 ( A ) 나노 입자 추적 분석 (NTA) 및 ( B ) 투과 전자 현미경 (TEM)을 거친다. 눈금 막대 = 1 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 밀도 구배의 분율로 Exosomes 검출. 엑소 솜 마커 CD81, CD9, CD63 및 Tsg101 및 하우스 키핑 유전자 GAPDH의 웨스턴 블롯 분석은 엑소 좀을 함유하는 20 % 요오드 크라 fraction 분획을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 6 : 유동 세포 계측법과 공 촛점 현미경으로 Extracellular Vesicle / Exosome Uptake 검출. EV / 엑소 좀 섭취가 HMLE 세포에서 측정되었다. CFSE- 표지 된 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀 및 음성 대조군을 지시 된 배양 물에 6 시간 동안 첨가 하였다. 배양 후, 세포는 ( A ) 유동 세포 계측법 및 ( B ) 공 촛점 현미경 검사. CFSE (녹색, 여기 / 방출 (nm) : 492/517, 현미경 레이저 라인 : 488) 형광 세기는 EV / 엑소 좀 섭취를 반영합니다. 세포핵을 DAPI (청색, 여기 / 방출 (nm) : 358/461, 현미경 레이저 라인 : 405)로 염색하고, 원핵 세포막을 원형질막 얼룩 (적색, 여기 / 방출 (nm) : 649/666; 현미경 레이저 라인 : 633, 재료 표 참조). 공 초점 대물 렌즈 : HCX PL APO 63x / 1.40-0.60 오일. 스케일 바 = 20 μm.ad / 55736 / 55736fig6large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 첨부 된 상피 organoids의 이미지. 첨부 된 상피 조직 체에서 이동하고 성장하는 세포에 의해 형성된 유방 상피 세포의 밝은 영역 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : 표면 EpCAM 및 CD49f에 의한 원발성 유방 상피 세포의 분류. 12 주된 생쥐의 지방 패드로부터 분리 된 마우스 유방 상피 세포를 세포 분류 하였다ing. 마우스 유방 내강 세포는 파란색 동그라미로 표시된 EpCAM hi / CD49f lo 집단에서 풍부하게된다. 염색체로 표시된 EpCAM lo / CD49f hi 모집단에서 기저 세포가 풍부 해졌다. 비 - 상피 세포는 플롯에서 블랙 박스로 표시되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 9 : 1 차적인 쥐의 Luminal 유방 세포 에의 한 유선 형성. 1 차 마우스 EpCAM hi / CD49f lo 내강 세포를 10 일 동안 PBS 또는 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀으로 처리하고 3 주된 마우스의 깨끗한 지방 패드에 이식한다. 마우스를 안락사시키고 유선 형태를 분석하기 위해 8 주 후에 부검 하였다ation. 눈금 막대 = 0.75cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 백분율 | EpCAM의 MFI | CD49f의 MFI | |
| 유방 내강 세포 | 0.437 | 4.57 x 10 4 | 8183 |
| (EpCAM hi / CD49f lo ) | |||
| 유방 기초 세포 | 0.09 | 5452 | 2.23 x 10 4 |
| (EpCAM lo / CD49f hi ) | |||
| 비상피세포 (EpCAM - ) | 0.309 | 53 | 4619 |
표 1 : 그림 8에 설명 된 개체군의 백분율 및 평균 형광 강도 (MFI).
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Discussion
엑소 좀은 종종 그것들을 방출 한 세포의 특성을 가지고 있으며 방출 된 엑소 좀의 양은 자극 4 에 의해 유도 될 수있다. 세포의 배양 배지를 수집하여 EV / exosome 수집을위한 차동 초 원심 분리 (differential centrifuge)에 적용 할 수 있습니다 ( 그림 1 ). 현재 EVs / exosomes를 분리하는 이상적인 방법에 대한 일반적인 합의는 없다. 여기에서 사용 된 최적의 방법은 다운 스트림 어플리케이션 (14) 에 의해 결정된다. 초 원심 분리는 EVs / exosomes의 생물학적 활성을 보존 할 수있는 EVs / exosomes의 분리를위한 상대적으로 빠른 방법입니다. 그러나, 초 원심 분리에 의해 분리 된 소포는 일반적으로 엔도 솜 구획을 통해 생성 된 엑소 좀 및 / 또는 세포막으로부터 새싹을 통해 생성 된 소포를 함유하는 EVs의 혼합물을 함유한다.
NTA로 소포 크기를 분석함으로써 ( 그림 4A
차별화 된 초 원심 분리가 엑소 좀을 정제하는데 사용될 수 있지만 110,000 xg의 분리 분획 5 에서 exosome vesicles로부터 단백질 응집체의 오염을 더 제거하기 위해 밀도 구배를 사용해야한다. 예 : CD81 , CD63, CD9 및 TSG101 6 , 7 )를 발현합니다. 밀도 구배의 분수에서 exosome 마커의 존재를 분석함으로써, ~ 20 % iodixanol ( 그림 5 )와 분율의 exosomes를 식별하는 것이 가능합니다. exosomes의 각 모집단은 서로 다른 exosome 마커를 표현할 수 있기 때문에 여러 exosome 마커는 밀도 그라디언트에서 exosomes을 식별하기 위해 검사해야합니다 16 .
세포에 의한 EVs / exosomes의 흡수는 형광 염료로 표지 된 EV / 엑소 좀을 사용하여 측정 할 수 있습니다. 표지 된 EVs / exosomes를 섭취하는 세포의 수는 유동 세포 계측법 (flow cytometry)으로 측정 할 수 있습니다 ( 그림 6A ). 플루 오가세포로부터의 발광은 표지 된 EVs / 엑소 좀의 흡수로 얻어 지지만 유리 염료로부터의 형광으로 인한 것은 아니므로 형광 패턴을 현미경을 사용하여 세포에서 조사 하였다. 공 촛점 현미경은 EV / 엑소 좀 처리 세포의 형광 패턴이 점 점 (punctate)임을 보여줍니다 ( 그림 6B 오른쪽 패널). 구두 신호는 자유 형광이 아닌 표지 된 EV / 엑소 좀으로 인해 나타날 수 있습니다. 세포의 점 신호는 85 nm 4 , 17 에서 가장 높은 해상도를 갖는 구조화 된 조명 수퍼 - 해상도 현미경으로 더 분석 될 수 있습니다. 수퍼 - 해상도 현미경 검사는 점액 신호가 exosomes 4 와 유사한 ~ 100-nm 중공 vesicles에서 있는지 확인할 수 있습니다. 이러한 결과는 NAMEC 유래의 엑소 좀이 배양 된 유방 상피 세포에 의해 섭취 될 수 있음을 시사한다.
NAMEC에서 추출한 EV / 엑소 좀은 종종 분자 ( 예 : 단백질과 miRNAs) 특정 세포의 특성에 필수 1 . 이것은 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀이 NAMEC ( 예 : 유선 형성 능력)의 특성을 상피 세포 대응 물로 전달할 수 있음을 시사한다. 인간의 유방 상피 세포는 마우스 지방 패드 18 , 19 에서 유방 내 젤을 이원 적으로 형성 할 수 없기 때문에 마우스 형성 원발성 상피 세포를 사용하여 글 랜드 형성 능력의 전달을 검사 할 수 있습니다. 유방 땀샘을 형성하지 않는 마우스의 일차 유방 EpCAM hi / CD49f lo 내강 세포는 6 주된 생쥐에서 분리 될 수 있습니다 ( 그림 7 및 그림 8 ). 마우스 뚱뚱한 패드에서 격리 된 세포가 르네를 검토하여 세 그룹 ( 즉, EpCAM hi / CD49f lo luminal 세포, EpCAM lo / CD49f hi basal 세포, EpCAM - 비 상피 세포)으로 나눌 수 있습니다표면 EpCAM 및 CD49f의 세포 ( 도 8 ). EpCAM lo / CD49f hi 기저 세포는 지방 패드에 이식 될 때 유행하는 유행에서 유방 땀샘을 형성 할 수 있지만 EpCAM hi / CD49f lo 내강 세포는 그렇지 못합니다. 따라서, EpCAM hi / CD49f lo 내강 세포 집단은 유선 기능을 전달하는 유도 된 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀의 능력을 조사하는데 사용될 수있다. 분리 된 EpCAM hi / CD49f lo 내강 세포는 EV / exosome 치료 4 에서 7-10 일 동안 배양 물에 보관할 수 있습니다. 초기 유방 상피 세포 를 생체 외에서 오래 보관하면 세포의 생존력을 약화시킬 수 있습니다.
EV / 엑소 좀으로 처리 된 유방 내강 세포를 유방 패드에 이식하여 유선 형성능을 분석 할 수 있습니다. 이식에 사용 된 쥐의 지방 패드는 3 주령에 제거해야합니다. 에이3 주령의 유방 상피 세포는 젖꼭지와 뚱뚱한 림프 림프 사이의 영역에 국한되어 있습니다. 지방 패드의 유방 상피는 3 주령에 젖꼭지와 림프 사이의 영역을 제거하여 제거 할 수 있습니다. 유방 내막 세포는 지방 패드를 제거한 직후에 이식되며, 이식 된 세포의 글 랜드 형성은 이식 후 8 주에 분석 할 수 있습니다. NAMEC 유래 EVs / exosomes의 유방 내막 형성 능력을 유방 내막 세포로 전이시키는 효과는 내강 세포 및 EV / 엑소 좀 처리 luminal 세포의 형성으로 평가할 수 있습니다 ( 그림 9 ). NAMEC에서 유도 된 EVs / exosome은 유방 기초 상피 세포의 성질을 지니고있다 - 암 형성능 - 그리고 NAMEC로부터 유도 된 EV / 엑소 좀을 섭취하는 내강 세포는 EV / 엑소 좀을 통해 NAMEC로부터 성질을 얻을 수있다. 이 연구는 EV / exosome-media를 담당하는 분자들이유선 형성 능력의 변화는 EVs / exosomes의 지질 뗏목에 존재한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 보건 연구원 (05A1-CSPP16-014, HJL)과 과학 기술부 (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL)의 연구비 지원에 의해 뒷받침되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K ultracentrifuge | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | for nanoparticle tracking analysis (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). |
| CD81 antibody | GeneTex | GTX101766 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD9 antibody | GeneTex | GTX100912 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD63 antibody | Abcam | Ab59479 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| TSG101 antibody | GeneTex | GTX118736 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | fluorescence cell analyzer | |
| collagenase Type IV | Thermo | 17104019 | |
| trypsin | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite |
| accutase | ebioscience | 00-4555-56 | a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity |
| dispase | STEMCELL | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL |
| anti-CD49f antibody | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anti-EpCAM antibody | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs) | gifts from Dr. Robert Weinberg | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| sodium bicarbonate | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (bovine pituitary extract) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15 cm culture dish | Falcon | 353025 | |
| table-top centrifuge | Eppendrof | Centrifuge 3415R | |
| ultracentrifuge tube | Beckman | 344058 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | HT7700 | |
| gelatin | STEMCELL | 7903 | |
| 10 cm culture dish | Falcon | 353003 | |
| 6-well culture dish | Corning | 3516 | |
| female C57BL/6 mice | NLAC (National Laboratory Animal Center | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | BioWest | S01520 | |
| gentamycin | Thermo Fisher Scientific | 15710072 | |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| isofluorane | Halocarbon | NPC12164-002-25 | |
| formaldehyde | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Ethanol) | J.T. Baker | 800605 | |
| glacial acetic acid | Panreac | 131008.1611 | |
| aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Xylene | Leica | 3803665 | |
| 0.22 μm membranes | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Wound Clip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C10046 | plasma membrane stain |
References
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