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Genetics

Estudo da Expressão de Genes Reguladores do Ciclo Celular por dois Protocolos Complementares de Sincronização Celular

Published: June 06, 2017
doi:
10.3791/55745
, ,
1Department of Cell Biology and Histology,University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology,University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease,University of Zurich

Summary

Relatamos dois protocolos de sincronização de células que fornecem um contexto para estudar eventos relacionados a fases específicas do ciclo celular. Mostramos que essa abordagem é útil para analisar a regulação de genes específicos em um ciclo celular não perturbado ou após a exposição a agentes que afetam o ciclo celular.

Abstract

O programa de expressão gênica do ciclo celular representa um passo crítico para a compreensão dos processos dependentes do ciclo celular e seu papel em doenças como o câncer. A análise de expressão de genes regulada pelo ciclo celular depende da sincronização celular em fases específicas. Aqui descrevemos um método que utiliza dois protocolos de sincronização complementares que é comumente usado para estudar a variação periódica da expressão gênica durante o ciclo celular. Ambos os procedimentos são baseados no bloqueio transitório do ciclo celular em um ponto definido. O protocolo de sincronização pelo tratamento com hidroxiureia (HU) leva à prisão celular na fase final G1 / início da S e a liberação da prisão mediada por HU fornece uma população celular progredindo uniformemente através de S e G2 / M. O protocolo de sincronização pelo tratamento com timidina e nocodazol (Thy-Noc) bloqueia as células na mitosis precoce e a liberação da prisão mediada por Thy-Noc fornece uma população celular sincronizada adequada para a fase G1 e a fase S-enTente estudos. A aplicação de ambos os procedimentos requer o monitoramento dos perfis de distribuição do ciclo celular, que normalmente é realizado após a coloração do iodeto de propídio (PI) das células e a análise mediada por citometria de fluxo do conteúdo de DNA. Mostramos que o uso combinado de dois protocolos de sincronização é uma abordagem robusta para determinar claramente os perfis transcricionais de genes que são diferencialmente regulados no ciclo celular ( ie E2F1 e E2F7) e, conseqüentemente, ter uma melhor compreensão de seu papel no ciclo celular Processos. Além disso, mostramos que essa abordagem é útil para o estudo de mecanismos subjacentes a terapias baseadas em drogas ( ou seja, mitomicina C, um agente anticancerígeno), porque permite discriminar genes que respondem ao agente genotóxico daqueles que são exclusivamente afetados por perturbações do ciclo celular Imposto pelo agente.

Introduction

A transição através de todas as fases do ciclo celular é acoplada a um programa de expressão de genes bem regulado. Este coordenado "ligado e desligado" da transcrição de genes ao longo do ciclo celular acredita estar sob o controle de sistemas regulatórios transcricionais complexos, regulando não apenas o tempo, mas também os níveis de expressão gênica. É sabido que a desregulamentação dos principais componentes do ciclo celular contribui para o desenvolvimento de várias doenças e é uma marca bem estabelecida da tumorigênese 1 , 2 . As análises transcriptômicas do genoma realizadas em células de leveduras e mamíferos revelaram que um grande número de genes exibem padrões periódicos de expressão gênica no ciclo celular, sugerindo que a flutuação da transcrição durante o ciclo celular é um reflexo do requisito temporal de um determinado produto de gene Em uma fase precisa 3 , 4 , </suP> 5 .

Uma tarefa importante no estudo da expressão de genes regulados pelo ciclo celular é a sincronização de células em fases específicas do ciclo celular. A sincronização celular ajuda a interpretar a associação de um padrão de expressão genética a uma transição de fase específica do ciclo celular e levou a uma melhor compreensão da regulação e função de vários genes. A sincronização celular também é importante para estudar o mecanismo de ação de fármacos anticancerígenos, já que os agentes quimioterapêuticos afetam tanto a expressão gênica como a cinética do ciclo celular 6 , 7 . No entanto, muitas vezes é difícil determinar se as diferenças de expressão gênica resultantes do tratamento com esses agentes são uma resposta direta ao tratamento ou são apenas a conseqüência de mudanças nos perfis do ciclo celular. Para distinguir entre essas possibilidades, a expressão gênica deve ser analisada em células que foram sE sincronizado antes da adição do medicamento quimioterapêutico.

Com a exceção de algumas células primárias, como células linfóides recém-isoladas – que constituem uma população de células homogêneas sincronizadas em G0 8 -, as linhas celulares estabelecidas in vitro crescem de forma assíncrona em cultura. Sob condições de crescimento regulares, essas células de ciclagem assíncrona são encontradas em todas as fases do ciclo celular, mas preferencialmente em G1 9 . Portanto, esse contexto não fornece um cenário ótimo para análises de expressão funcional ou genética em uma fase específica do ciclo celular ( por exemplo , G1, S, etc.). As linhas celulares imortalizadas não transformadas ( por exemplo, fibroblastos) podem ser sincronizadas com os chamados métodos fisiológicos 10 . Esses métodos são baseados nos recursos de células primárias retidos das células não transformadas, como a inibição do contato celular e a dependência do fator de crescimento para continuar a andar de bicicleta. RemoçãoDe soro em combinação com inibição de contato torna as células não transformadas presas em G0 / G1. No entanto, a entrada e progressão sincronizada do ciclo celular muitas vezes requer subcultura, o que também envolve o desprendimento artificial das células e re-chapeamento 10 . Mais importante ainda, este método não é adequado para a sincronização de linhas celulares transformadas, a grande maioria das linhas celulares estabelecidas atualmente em uso, caracterizada por falta de inibição do crescimento mediada por contato celular ou resposta à retirada do fator de crescimento. Assim, é claro que são necessários métodos alternativos para a sincronização celular eficiente em fases específicas do ciclo celular. Em termos gerais, os métodos de sincronização mais utilizados são baseados em inibição química ou farmacológica transitória de um ponto definido do ciclo celular, tipicamente síntese de DNA ou formação de fuso mitótico. A inibição da síntese do DNA sincroniza as células prendendo-as no final da fase G1 ou inicial S. Isso pode ser achiEvitado pela adição de compostos como a mimosina, um inibidor da biossíntese de nucleótidos 11 , 12 , a afidicolina, um inibidor das polimerases de ADN 13 , 14 , a hidroxiureia, um inibidor da ribonucleótido redutase 15 , 16 ou por quantidades excessivas de timidina 17 , 18 . Por outro lado, os inibidores da polimerização de microtúbulos, como a colchicina ou o nocodazol, são capazes de bloquear a formação de fuso mitótico, levando à sincronização celular no início da fase M 19 , 20 , 21 .

Neste trabalho descrevemos um método envolvendo dois protocolos de sincronização complementares baseados na inibição química transitória para estudar a expressão de genes regulados pelo ciclo celular no mRNAnível. Este método é fundamental para definir o papel dos genes do ciclo celular em processos específicos do ciclo celular. Além disso, fornece um quadro geral para estudar o impacto de tratamentos anticancerígenos, a fim de detectar com precisão os genes sensíveis a drogas e minimizar as interpretações erradas derivadas de perturbações na progressão do ciclo celular gerada por esses medicamentos.

Protocol

1. Sincronização, liberação e monitoramento celular da progressão do ciclo celular Timidina e nocodazol (Thy-Noc) sincronização e liberação de células U2OS da mitose Prepare o meio de cultura celular necessário. As células U2OS são cultivadas rotineiramente em meio DMEM-Glutamina complementado com 10% (vol / vol) de FBS (opcional: 1% de penicilina / estreptomicina). Execute toda a preparação e manipulação do meio em condições estéreis e aquecer o meio complementad…

Representative Results

Representação esquemática dos protocolos Thy-Noc e HU para sincronização celular. A Figura 1 resume as etapas necessárias para a sincronização de células U2OS e posterior coleta de amostras, a fim de verificar a progressão através do ciclo celular e realizar análises de expressão gênica. A coloração de Phospho-H3 e PI são bons parâmetros…

Discussion

A análise de genes regulados por ajuste fino envolvidos em papéis temporários e temporários no ciclo celular requer uma população celular uniforme. Muitos pesquisadores usam rotineiramente linhas de células tumorais estabelecidas há muito tempo para esses propósitos e uma variedade de métodos foram desenvolvidos para obter populações celulares síncronas (ou parcialmente síncronas), com o objetivo de acumular o maior número possível de células em fases definidas do ciclo celular. Além disso, esforços i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos aos membros dos laboratórios Zubiaga e Altmeyer por discussões úteis e suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por doações do Ministério espanhol (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), do governo basco (IT634-13 e KK-2015/89) e da Universidade do País Basco UPV / EHU ( UFI11 / 20).

Materials

DMEM, high glucose, GutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 61965-059
FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin Thermo Fisher Scientific 10270-106
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
0.25% Trypsin-EDTA (1X), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200-072
Thymidine SIGMA T1895-5G Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine.
Nocodazole SIGMA M-1404 Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots
Hydroxyurea SIGMA H8627 Freshly prepared
Mitomycin C from Streptomyces caespitosus SIGMA M4287 1.5mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4ºC
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
Propidium iodide SIGMA P4170 Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4º C protected from light.
PBS pH 7.6 Home made
Ethanol PANREAC A3678,2500
Chloroform SIGMA C2432
Sodium Citrate PANREAC 131655
Triton X-100 SIGMA T8787
RNAse A Thermo Fisher Scientific EN0531
TRIzol Reagent LifeTechnologies 15596018
RNeasy Mini kit QIAGEN 74106
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific 4368814
Anti-Cyclin E1 antibody Cell Signaling 4129 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-Cyclin B1 antibody Cell Signaling 4135 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-β-actin SIGMA A-5441 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antiboty Millipore 06-570 Specified in the protocol
Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody Invitrogen R37116 Specified in the protocol
Secondary anti-mouse-HRP antibody Santa Cruz Biotechnology sc-3697 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Forward E2F1 antibody (human)                    TGACATCACCAACGTCCTTGA Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F1 antibody (human)                    CTGTGCGAGGTCCTGGGTC Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward E2F7 antibody (human)                    GGAAAGGCAACAGCAAACTCT Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F7 antibody (human)                    TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 antibody (human)                    AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 antibody (human)                    TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP antibody (human) reference gene                     Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse TBP antibody (human)                     Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L antibody (human) reference gene   CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                  Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L  antibody (human)    CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                 Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4368702
FACS Tubes  Sarstedt 551578
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific N8010560
Corning 100mm TC-Treated Culture Dish Corning
Corning Costar cell culture plates 6 well Corning 3506
Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge Eppendorf 5415 R
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12 Jouan 743205604
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Scientific ND-LITE-PR
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Bioscience
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific A28567
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References

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Apraiz, A., Mitxelena, J., Zubiaga, A. Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols. J. Vis. Exp. (124), e55745, doi:10.3791/55745 (2017).
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