Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren

Published: July 24, 2017 doi: 10.3791/55755
Automatic Translation
*1, *2,3, 4, 5, 5, 2
1Department of Medicine, University of Virginia, 2Department of Cell Biology, SUNY Downstate Medical Center, 3Neural and Behavioral Science Graduate Program, SUNY Downstate Medical Center, 4Division of Neonatology, University of Virginia, 5Department of Neuroscience and Physiology, New York University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft real-time iontoforese, een methode die fysieke parameters meet van de extracellulaire ruimte (ECS) van de levende hersenen. De diffusie van een inert molecuul dat in de ECS wordt vrijgegeven, wordt gebruikt om de ECS volume fractie en tortuositeit te berekenen. Het is ideaal voor het bestuderen van acute omkeerbare veranderingen in hersen ECS.

Abstract

Deze review beschrijft de basisconcepten en het protocol om de real-time iontoforese (RTI) methode uit te voeren, de gouden standaard om de extracellulaire ruimte (ECS) van de levende hersenen te onderzoeken en te kwantificeren. De ECS omgeeft alle hersencellen en bevat zowel interstitiële vloeistof als extracellulaire matrix. Het transport van veel stoffen die nodig zijn voor hersenactiviteit, inclusief neurotransmitters, hormonen en voedingsstoffen, komt door diffusie door de ECS voor. Veranderingen in het volume en de geometrie van deze ruimte komen voor bij normale hersenprocessen, zoals slaap en pathologische aandoeningen, zoals ischemie. De structuur en de regulering van hersen ECS, vooral in zieke staten, blijft echter grotendeels onontgonnen. De RTI methode meet twee fysieke parameters van het levende brein: volume fractie en tortuositeit. Volume-fractie is het aandeel van het weefselvolume dat door ECS wordt bezet. Tortuosity is een maat voor de relatieve hinder die een stof tegenkomt wanneer het diffundeert door een hersenreactieGion in vergelijking met een medium zonder obstakels. In RTI wordt een inerte molecuul gepulst van een bron microelektrode in de hersenen ECS. Aangezien moleculen van deze bron diffunderen, wordt de veranderende concentratie van het ionen mettertijd gemeten met behulp van een ionen-selectieve micro-elektrode die ongeveer 100 μm is gepositioneerd. Uit de resulterende diffusiecurve kan zowel volumefractie als tortuositeit worden berekend. Deze techniek is gebruikt in hersenschijfjes van meerdere soorten (inclusief mensen) en in vivo om acute en chronische veranderingen in ECS te bestuderen. In tegenstelling tot andere methoden kan RTI zowel in realtime als omkeerbare en onomkeerbare veranderingen in de hersenen ECS worden bekeken.

Introduction

De extracellulaire ruimte (ECS) is het netwerk van door elkaar verbonden kanalen buiten alle hersencellen en bevat zowel interstitiële vloeistof als extracellulaire matrix ( Figuur 1a en Figuur 1b ). De verspreiding van veel stoffen die nodig zijn voor de hersencelfunctie, met inbegrip van voedingsstoffen, hormonen en neurotransmitters, komt door diffusie door de ECS voor. Veranderingen in de fysieke parameters van deze ruimte, met inbegrip van volume, geometrie en extracellulaire matrix, kunnen de diffusie drastisch beïnvloeden door de ECS en de lokale ionconcentraties baden van de hersenen, die een belangrijke invloed hebben op de celfunctie van de hersenencel 1 , 2 .

Real-time iontoforese (RTI) wordt gebruikt om twee structurele kenmerken van een hersengebied te bepalen: volume fractie en tortuositeit 3 , 4 ,"Xref"> 5. Volumefractie ( a ) is het aandeel van weefselvolume dat door de ECS ( V ECS ) wordt bezet ten opzichte van het totale weefselvolume ( V weefsel ) in een representatief elementair volume;

Vergelijking

Tortuosity ( λ ) is de relatieve belemmering die een stof tegenkomt wanneer het diffundeert door een hersengebied in vergelijking met een medium zonder obstructies;

Vergelijking

Waar D * (cm 2 s -1 ) de effectieve diffusiecoëfficiënt van de stof in de hersenen en D (cm 2 s -1 ) is, is de vrije diffusiecoëfficiënt van de stof in een vrij medium, zoals verdunde agarosegel.

Vandaag de meest gebruikte sonde stof voor de RTI methode is het kleine kationtetramethylammonium (TMA). TMA heeft een molecuulgewicht van 74 g / mol, dissocieert volledig in oplossing en heeft één positieve lading. RTI studies met dit ion hebben aangetoond dat α Vergelijking 0,2 en λ Vergelijking 1,6 1 , 2 . Dit betekent dat de ECS ongeveer 20% van het totale hersenvolume bedraagt ​​en dat de diffusie van een klein inert molecuul ongeveer 2,5 keer langzamer voorkomt in de ECS dan in een medium zonder obstakels 3 . Beide α en λ variëren echter met de leeftijd van de hersenen, regio en staat en in pathologische omstandigheden 1 . Wijzigingen van deze parameters zijn gekoppeld aan de ontwikkeling van de hersenen, veroudering, slaap, epilepsie en vele andere fundamentele processen en hersenziekten 1, 6 . Terwijl andere technieken a en λ meeten, kan RTI zowel in gelokaliseerde gebieden van levend weefsel in realtime meten. Om deze reden is RTI een onontbeerlijk instrument geworden voor het onderzoeken van veranderingen in a en λ tijdens acute en omkeerbare uitdagingen.

De theorie ter ondersteuning van RTI werd oorspronkelijk gevalideerd door Nicholson en Phillips, en de techniek is sinds die tijd zeer uitgebreid gebruikt 4 , 7 . Experimenten die RTI gebruiken, beginnen met het vrijkomen van een puls van TMA van een bron-micro-elektrode door iontoforese in een verdunde agarosegel. Eens uitgeworpen diffundeerden de ionen vrij van de puntbron, waarbij ze kiezen uit een potentieel oneindig aantal willekeurige wegen ( Figuur 1d ). De veranderende concentratie van het ionen wordt mettertijd gemeten met behulp van een ionen-selectieve micro-elektrode (ISM) die ruwweg is gepositioneerd100 μm weg ( figuur 1c ). De veranderingen in TMA-concentratie worden getekend en op een curve aangebracht die de berekening van zowel D als het transportnummer van de iontoforese micro-elektrode mogelijk maakt (parameters beschreven in het protocol). Met deze waarden wordt de procedure herhaald in een hersengebied van belang om D * te verkrijgen en zowel α als λ te berekenen. Beheersing van de iontoforese micro-elektrode, dataverzameling, grafieken en montage van de TMA-concentratiecurve en berekening van de experimentele parameters worden doorgaans uitgevoerd door de programma's Wanda en Walter, die speciaal hiervoor zijn ontworpen (de software en hun handleidingen zijn Vrij verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag).

Het protocol gedeelte van deze review beschrijft de basisprocedures die nodig zijn voor het ontwerpen en uitvoeren van RTI in knaagdierbreinzen. De techniek is ook gebruikt in niet-staafEnt modellen, waaronder menselijke hersenen plakjes en in vivo hersenpreparaten 1 , 4 , 6 , 8 , 9 . Het gedeelte Representatieve resultaten biedt zowel ideale als niet-ideale resultaten om nuances in data-interpretatie te markeren. Tenslotte behandelt de discussie sectie probleemoplossingstechnieken, beperkingen van RTI, alternatieve technieken die gebruikt worden om de ECS te bestuderen en toekomstige toepassingen van RTI.

Figuur 1
Figuur 1: Diagrammen van diffusie via ECS. (A) Schema van ECS: Toont de grootte en locatie van het ECS in een typische hersenpreparaat. Geel markeert de ECS tussen de grijze hersencel processen. Het volume van de ECS bedraagt ​​ongeveer 20% van het totale weefsel volume ( dwz volume fractie = 0.2) onder fysiologische omstandigheden. ( B ) vergroot diagram van de ECS: benadrukt fysieke parameters die bijdragen aan tortuositeit, inclusief hersencel geometrie (grijs) en extracellulaire matrix (aangetoond als een netwerk van veelkleurige glycosaminoglycanen en proteoglycanen). ( C ) 3D-diagram van diffusie van een puntbron: Demonstreert de netto beweging van inerte moleculen van een iontoforetische bron naar een ISM. Met uitzondering van diffusiebarrières en cellulaire opname diffundeerden de moleculen in alle richtingen naar buiten, waardoor er een bolvormige concentratievoorzijde ontstaat. Het ISM kwantificeert de lokale concentratie van de inerte moleculen die vrijkomen van de iontoforetische bron. ( D ) Computer simulatie van diffusie in ECS van de hersenen: [Verre links] Instelling voor Monte Carlo simulatie; Groene bollen vertegenwoordigen hersencelprocessen en het rode kruis vertegenwoordigt een puntbron. Deze opstelling modelleren het hersenweefsel diagramma in figuur 1a . [Middenbeelden] 3 en6 moleculen die willekeurige bewegingen verrichten als ze diffunderen door de extracellulaire ruimte van de hersenen, weergegeven in 2 dimensies. [Verre rechts] Willekeurige wandelingen van veel moleculen die uit de puntbron worden vrijgegeven. De netto beweging van alle moleculen uit de puntbron is naar buiten, zoals afgebeeld in figuur 1c . De cumulatieve willekeurige wandelingen schetsen de ruimten tussen de cellen ( dwz de ECS, zie referentie 5 voor verdere uitleg). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierprocedures, die gebruikt werden om weefselmonsters te verkrijgen, waren goedkeuring door de dierethiek commissie bij SUNY Downstate Medical Center.

1. Voorbereiding van oplossingen en uitrusting

  1. Bereid een 150 mM NaCl-opvuloplossing voor de referentiekabel van het ISM. Bewaar het in een 10 ml spuit die is bevestigd aan een 0,22 μm filter (om bacteriën of deeltjes te verwijderen).
  2. Bereid een 150 mM TMA chloride (TMA-Cl) opvullingoplossing voor de microelektroden op. Bewaar het in een 10 ml spuit bevestigd aan een 0,22 μm filter. Bereid de TMA-Cl oplossingen (in dit protocol) uit een 5 M fabrikant voorraadoplossing om de juiste concentratie te waarborgen.
  3. Chlorideer minstens vier zilveren draden voor de fabricage van micro-elektroden door de draden in bleekmiddel (natriumhypochloriet) gedurende tenminste 2 uur te onderdompelen. Verwijder overtollige bleekmiddel met ethanol en laat de draden drogen.
  4. Bereid 50 ml 0,3% agarose in 150 mM NaCl en 0,5 mM TMA-Cl in een bekerEn bedek het. Gebruik agarose die poeder is en redelijk fris om goede diffusiemetingen te waarborgen.
  5. Verhit en meng de agarose-oplossing met een roerbalk om het op te lossen. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Bewaar dit bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week.
  6. Bereid een onverschillige (grond) elektrode uit van 4% agarose in 1 M KCl (richtingen in aanvulling A)
  7. Maak een kleine, poreuze beker die in de experimentele kamer kan passen en dat de elektrische continuïteit tussen de inhoud en de buitenomgeving mogelijk maakt ( figuur 2a ). Plaats een metalen ring op de bodem van deze beker om te voorkomen dat het drijft wanneer het gedeeltelijk ondergedompeld is in water.
  8. Gebruik seriële verdunning van een 5 M TMA-Cl voorraad om vijf 100 ml TMA-Cl oplossingen te maken voor de kalibratie van de ISM's. Oplossingen moeten eindconcentraties hebben van 0,5, 1, 2, 4 en 8 mM TMA-Cl, alles in 150 mM NaCl. Bewaar de kalibratieoplossingen in een afdichtbare beker om verdamping te voorkomen. </ Li>

2. Elektronische instellingen

  1. Sluit de componenten van de RTI experimentele opstelling aan volgens het blokdiagram in figuur 2b ; Een versterker met twee ingangskanalen (waarvan er een zeer hoge impedantie voor het ion selectieve vat van de ISM moet zijn), een laagdoorlaatfilter ingesteld op 10 Hz, een grafische recorder, een A / D + D / A Converter, een iontoforetische eenheid (of een versterker die constante stroomimpulsen kan leveren) en een computer (PC) die de Wanda en Walter programma's uitvoert. Controleer de elektronische instellingen om te bevestigen dat alle aansluitingen op zijn plaats zijn.
  2. Scherm de experimentele opstelling in een geaarde behuizing (zoals een Faraday kooi), indien nodig, aangezien ISM's een hoge weerstand hebben en gevoelig zijn voor artefacten die door nabijgelegen bewegingen worden gecreëerd.
  3. Maak een dedicated ISM-kalibratie station bestaande uit een dubbele ingangsversterker, een kaartrecorder, een passende ISM-houder en een onverschillige grondelektrode. Als dat mogelijk is,Bescherm de behuizing. Sla deze stap over als de ISM's zijn gekalibreerd in de experimentele setup (stap 3.29)

Figuur 2
Figuur 2: Poreuze Experimentele Kop en Elektronische Setup. (A) Poreus experimentele cup: een poreus netwerk wordt gebruikt om een experimentele cup waarmee elektrische continuïteit tussen de agarose (binnen) en de experimentele baden fluïdum (buiten) te creëren. Op de bodem van de beker is een metalen ring aangebracht om te voorkomen dat de beker in de badoplossing drijft. ( B ) Blokdiagram van de RTI setup (stappen 2.1 en 2.2): Een ISM is aangesloten op een versterker (amp). De ISM heeft twee vaten. Eén bevat vloeibare ionenwisselaar (LIX) in de tip en genereert een spanning die evenredig is aan de logaritme van de TMA-concentratie bij de tip samen met de lokale omgevingsspanning; thE signaal pad wordt weergegeven door een rode lijn. Het andere vat van het ISM staat bekend als het referentievat en meet de omgevingsspanning aan het uiteinde van de ISM; Het is verbonden door een blauw signaalpad. De versterker heeft twee zogenaamde hoofdtrappen die verbinding maken met de ISM; Deze eenheden hebben een winst van 1 (x1) en passen de hoge impedantie van de micro-elektrode overeen met de lage impedantie van de rest van de versterkerschakeling. Het hoofdstadium dat verbonden is met het ion selectieve vat moet overeenkomen met een inkomende weerstand van ongeveer 1.000 MΩ, terwijl de weerstand van het referentiekanaal typisch ongeveer 10 MΩ is. Nadat het hoofdstadium is verlaten, wordt de spanning van de referentiekabel omgekeerd en afgetrokken van de spanning op het ion selectieve vat met behulp van een summing versterker (Σ) om de pure ion signaal spanning te verkrijgen. De uitgang van de versterker gaat over naar een signaal conditioning unit die extra versterking en een multipool low-pass filter (≤ 10 Hz, meestal een Bessel fiLter), die geluidsoverlast elimineert en signaal aliasing verhindert bij de analoge naar digitale omzetter (A / D). De uitgangen van het filter worden ook weergegeven op een strip chart recorder. De A / D converter digitaliseert de signalen en stuurt ze naar een pc (pc). De PC genereert ook een digitaal signaal dat wordt omgezet door een digitale-naar-analoge omzetter (D / A) naar een analoge spanningspuls die wordt toegevoerd aan de iontoforese-eenheid, die de spanning omzetten naar een stroomimpuls van constante amplitude en stuurt Naar de iontoforese micro-elektrode. Het iontoforese signaalpad wordt weergegeven door een groene lijn. Het gegevensverzamelings- en iontoforese signaal wordt onder de controle van het Wanda-programma, dat een uitvoerbestand voor elk diffusie-record genereert in de vorm van een spanning versus tijdopname, samen met alle parameters die het experiment definiëren. Een tweede programma, Walter, leest het uitvoerbestand en gebruikt ISM-kalibratiedata om de gedigitaliseerde spanningen om te zetten in concentraties. De concentratie veRsus tijdcurven worden vervolgens in Walter in de juiste oplossing aan de diffusievergelijking aangebracht. D en n t worden geëxtraheerd als het medium agarose is, en A en a worden geëxtraheerd als het medium hersenen is. Analoge signalen zijn solide lijnen; Digitale signalen zijn stippellijnen. Er is ook een onverschillige grondelektrode (niet afgebeeld) in het bad dat de plak bevat. Rode lijnen = ion signaal, blauwe lijnen = referentie signaal, groene lijnen = iontophorese commando, vaste lijnen = analoge, gestippelde lijnen = digitaal. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Bereiding en kalibratie van ion-selectieve microelektroden

  1. Maak een ISM met behulp van het protocol onder een dag voor het experiment. Maak ISM's in batches om ervoor te zorgen dat tenminste twee werk op de dag van het experiment.
    OPMERKING: De meeste ISM's zijn stabiel voor een dag oftwee. ISM fabricage is gevoelig voor vochtigheid en atmosferische omstandigheden. Niet elke micro-elektrode zal met succes kalibreren.
  2. Verwijder ongeveer 0,5 cm glas aan het uiteinde van een van de vaten van een dubbelborde borosilicate glazen capillaire met behulp van een oud paar tang.
  3. Chip een enkel vat aan het tegenoverliggende uiteinde van de capillaire ( afbeelding 3a ). Zorg ervoor dat het septum niet beschadigd is (kritisch). Let op: Draag bril om schade te voorkomen door projectielglas.
  4. Plaats de capillaire in een fles aceton gedurende ten minste 1 uur om verontreinigingen te verwijderen.
  5. Verwijder de capillaire uit het aceton en puls schoon, droog, gecomprimeerd stikstofgas of lucht erdoor om eventuele overmaat aceton te verwijderen. Verwijder alle acetonen in de capillaire, omdat rest aceton kan interfereren met silanisatie (cruciaal).
  6. Maak de tip van de micropipette op een verticale of horizontale trekker. Pas de parameters aan om een ​​pipet te trekken met een lange taps enScherpe punt, ongeveer 1 μm of minder in diameter. Aan het eind van deze stap wordt één capillaire gemaakt in twee pipetten ( figuur 3a ).
  7. Visualiseer een enkele micropipette onder een samengestelde, rechtopstaande microscoop met een 10X-doelstelling. Knip het uiteinde af met een glasmicroscoopdia, zodat de uiteindelijke diameter van de punt ( dwz beide vaten) tussen 2 en 5 μm ligt ( Figuur 3b ). Deze pipet wordt vanaf nu wel aangeduid als een ISM.
  8. Vul het gesneden vat van de ISM met 150 mM NaCl-referentieoplossing door de opening op de gescheurde kant met een 10 ml spuit die is bevestigd aan een 0,22 μm filter en een 28 G, 97 mm naald ( Figuur 3b ). Vul het vat niet meer dan drie vierde de hoogte van het vat.
  9. Vul het niet-gescheurde vat van het ISM met 150 mM TMA-Cl opvulling oplossing. Tik de ISM voorzichtig om luchtbellen uit de oplossing te kloppen. Controleer op bellen onder de microfoonRoscope gebruikt voor het kippen van de punt.
  10. Vlam de achterkant van het ISM met een Bunsen-brander om ervoor te zorgen dat er geen communicatie van de backfill-oplossing plaatsvindt over de septum aan de achterzijde van de ISM. Zorg ervoor dat de top vierde van de ISM droog is na het vlammen.
  11. Voeg een gechloreerde zilverdraad in de referentieoplossing van de ISM en buig de draad uit de capillaire om dit te markeren als referentievat ( Figuur 3c ). Zorg ervoor dat de draad in de backfill oplossing is ondergedompeld en gedurende de duur van het experiment in oplossing blijft.
  12. Schuif een korte lengte polytetrafluorethyleenbuisjes (ongeveer 20 cm lang) over de punt van een 25 G spuitnaald. Plaats het andere uiteinde van de buis in de achterkant van het ion-selectieve vat. Zorg ervoor dat de buis in het vat zit, maar boven de vuloplossing ( Figuur 3c ).
  13. Verhit een stok tandheelkundige was met een Bunsen-brander en sluit de buizen en de silvafel aanDraai ze in hun respectieve vaten ( Figuur 3c ). Zorg ervoor dat er een complete luchtafdichting wordt geproduceerd rond de plastic buis in het ion-selectieve vat (kritisch).
  14. Bereid een kleine, transparante glazen houder (5 ml of minder) van 4% chloortrimethylsilaan in xyleen op. Let op: Xylenen en silanen zijn zeer gevaarlijk voor de gezondheid; Behandel beide chemicaliën in een afzuigkap en verwijder het op een juiste manier.
  15. Plaats de container voor een stereo-dissectiemicroscoop die horizontaal in een afzuigkap is gemonteerd. Bevestig de ISM verticaal over de container met behulp van een micromanipulator ( Figuur 3d ).
  16. Dip de punt van de micro-elektrode in de chlorotrimethylsilaanoplossing.
  17. Bevestig een lege 10 ml spuit aan de 25-gauge naald die leidt naar de ISM. Pas de positieve luchtdruk van de spuit aan tot een bubble TMA-Cl oplossing is gevormd; Deze stap moet worden uitgevoerd onder directe visualisatie via de microscoop.
  18. Tik de houder van de ISM voorzichtig om de bubbel van de tip af te kloppen.
  19. Teken de chlorotrimethylsilaanoplossing tot een hoogte van ongeveer 1.500 μm in de punt van het ISM met behulp van een negatieve druk op de 10 ml spuit.
  20. Maak de chlorotrimethylsilaanoplossing volledig van de top van de ISM totdat een bubble TMA-Cl-oplossing bij de tip is ontstaan ​​( Figuur 3d ).
  21. Herhaal stappen 3.19 en 3.20 vijf keer. Zorg ervoor dat er per keer een even ononderbroken kolom vloeistof wordt getekend. Als er geen oplossing in de punt kan worden getekend, controleer of de buis is geblokkeerd, de luchtdichting onvolledig is of de punt van de ISM is geblokkeerd.
  22. Spoel alle chloortrimethylsilaanoplossing uit de tip tot een bubble van TMA-Cl-oplossing is gecreëerd.
  23. Terwijl u een positieve druk op de spuit vasthoudt, verwijder dan het ISM uit de xyleenoplossing. Zorg ervoor dat alle xyleenoplossing uit de ISM-tip wordt verdreven, aangezien overtollig xyleen de excuus zal ruïnerenHanger kolom gemaakt in de volgende stappen.
  24. Plaats de tip van het ISM in een kleine transparante container (hetzij de uitwisselaar kwam in of een kleine cuvette) met de vloeibare ionenwisselaar (LIX) voor TMA. Voer deze stap uit onder directe visualisatie met behulp van de horizontale microscoopinstelling.
  25. Breng een kleine hoeveelheid negatieve druk aan om een ​​minimale hoeveelheid van de LIX in de punt te trekken ( dus zodra LIX wordt gezien, ga dan de negatieve druk op).
  26. Ontkoppel de 10 ml spuit uit de buis en laat de ISM 5 minuten zitten. In die tijd zal de LIX de gesilaniseerde tip binnengaan totdat het een evenwichtstoestand bereikt.
  27. Verwijder de ISM van de LIX. Trek de buis uit het wisselkozijn (terwijl u zo min mogelijk wax verwijdert). Plaats een gechloreerde zilverdraad in de kleine opening die aan het achterkant van de ISM is gemaakt. Verzegel de draad in de opvulling van het wisselvatvat met gesmolten was.
  28. Laat de ISM toe om te zittenGedurende minstens 30 minuten Bevestig voltooide ISM's aan de binnenrand van een beker met behulp van een pluizige, tijdelijke lijm.
  29. Kalibreer de ISM door de spanning gemeten door de ISM in te nemen in elke kalibratieoplossing die is gemaakt in stap 1.8.
    OPMERKING: Kalibratie kan in een kalibratiestation worden uitgevoerd (zie stap 2.3) of in de experimentele setup. Deze procedure is beschreven in aanvulling B en in Haack et al 10 .
  30. Als de ISM-kalibratie succesvol was voor meerdere ISM's, pauzeer hier tot de dag van het voorgenomen gebruik. Zo niet, maak meer ISM's op.
  31. Op de dag van het experiment, kalibreer de micro-elektrode opnieuw (zie stap 3.29).

Figuur 3
Figuur 3: Bereiding van een ion-selectieve micro-elektrode. (A) ISM na chipping rug van de einden van een capillair en trekken (stappen 3,2-3,6): Eén vat aan beide uiteinden oFa glazen capillaire is afgebroken. Een ISM wordt gegenereerd door een dubbele barrelglaskapilla te trekken om twee micropipetten met fijne tips te genereren. ( B ) ISM na het vullen van beide vaten (stap 3.7-3.9): De punt van een enkele ISM is gesneden tot een diameter van 2-5 μm. Het ion-selectieve vat wordt teruggevuld met TMA-Cl, en het referentievat is teruggevuld met NaCl. ( C ) ISM voorafgaand aan de bekleding met chloortrimethylsilaan (stappen 3.11-3.13): Een gechlorideerde zilverdraad wordt in het referentiekarrel geplaatst. Polytetrafluorethyleen (PTFE) buizen is verbonden met een 25 G-naald en in de ion-selectieve vat geplaatst. Een luchtdichte afdichting bovenop beide vaten is gemaakt met behulp van tandwax. ( D ) Coating een micropipet met chlortrimethylsilaan (stappen 3.15-3.26): [Lage vergroting] Een ISM gesuspendeerd in chloortritimethylsilaan in lijn met een horizontaal gemonteerde stereomicroscoop. [Hoog vergroting] De weergave via een horizontaal gemonteerde stereomicroscOpe van een ISM tip in chlorotrimethylsilane oplossing. Na visualisatie van de tip door middel van een microscoop wordt een kleine hoeveelheid TMA-Cl oplossing uit het ion selectieve vat verwijderd (genoeg om een ​​kleine bubble van TMA-Cl oplossing te genereren). De ISM-houder wordt getikt om een ​​TMA-Cl-oplossingbubble vrij te maken en vervolgens wordt chlorotrimethylsilaan in de punt opgesteld. Deze cyclus wordt meerdere malen herhaald. Nadat alle chlorotrimethylsilanen uit het ISM zijn uitgezet, wordt de ISM in de vloeibare ionenwisselaar (LIX) geplaatst voor TMA en LIX wordt in de punt van het ion selectieve vat getrokken. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Bereiding van Iontophorese Microelektroden

OPMERKING: Iontophorese microelektroden moeten op de dag van het experiment worden vervaardigd.

  1. Trek een dubbelborde borosilicate glazen capillaire op een verticaal of hoHorizontale trekker. Pas de parameters aan om een ​​pipet te trekken die lijkt op de micropipetten die in stap 3.6 zijn getrokken ( figuur 4a ).
  2. Plaats de micropipet onder de samengestelde microscoop die in stap 3.7 gebruikt wordt en snijd de tip af met een glasmicroscoopdia, zodat de resulterende diameter tussen 2 en 5 μm ligt ( Figuur 4a ).
  3. Vul beide vaten met de 150 mM TMA-Cl-vullingsoplossing met een 10 ml spuit aan een 0,22 μm filter en een 28 G, 97 mm naald ( Figuur 4a ).
  4. Tap de micropipette voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de oplossing van beide vaten worden gelaten.
  5. Plaats gechlorideerde zilveren draden in beide vaten van de micropipette. Zorg ervoor dat de kabels diep genoeg zijn in de backfill-oplossingen, zodat ze gedurende de duur van het experiment in contact blijven met de oplossingen.
  6. Zet de draden in de vaten met behulp van heet tandheelkundige was. Sluit voorzichtig t Hij draagt ​​door hen om elkaar te draaien (voltooide micro-elektrode getoond in figuur 4b ).

Figuur 4
Figuur 4: Bereiding van een Iontophorese Microelektrode. (A) Iontoforese microelektrode na opvullen beide lopen (stappen 4,1-4,3): Een micro-elektrode iontoforese wordt getrokken uit een capillaire buis. De punt van de micro-elektrode wordt gesneden tot een diameter van 2-5 μm. Beide vaten van de iontoforese micro-elektrode worden gevuld met TMA-Cl-oplossing. ( B ) Voltooide iontoforese micro-elektrode (stappen 4.5-4.6): Een iontoforese micro-elektrode met twee gechlorideerde zilveren draden die in de vaten worden ingebracht. De vaten van de micro-elektrode worden afgesloten met wax en de zilveren draden zijn aan de achterzijde van de micro-elektrode aan elkaar gedraaid./files/ftp_upload/55755/55755fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

5. Bereiding van Kunstmatige Cerebrospinale Vloeistof- en Knaagdruppelhersenweefselplakken

  1. Bereid 1 liter kunstmatig cerebrospinale vloeistof (ACSF) op met een samenstelling die geschikt is voor het experiment en voeg 0,5 mM TMA-Cl daaraan toe.
    OPMERKING: De TMA-Cl is nodig om een ​​achtergrondconcentratie van TMA tijdens het experiment vast te stellen.
  2. Bereid de plakken van knaagdieren met een dikte van 400 μm volgens de standaardprotocollen 11 , 12 . Gebruik het ACSF dat in stap 5.1 is voorbereid voor de dissectie en het onderhoud van hersenschijfjes.

6. Real-time Iontophorese in Agarose

  1. Zet de computer aan met de Walter- en Wanda-programma's.
    OPMERKING: Deze programma's zijn vrij beschikbaar op aanvraag. Hoewel deze software niet essentieel is, is het soortgelijk programmerenSoftware of het uitvoeren van de analyse met de hand anders zou nodig zijn.
  2. ACSF via de submersiekamer met een passende snelheid uitvoeren ( bijv. 2 ml / min). Stel de temperatuurregelaar in voor de duur van het experiment op een gewenste temperatuur en bel ACSF met 95% O 2 /5% CO 2 (of een ander geschikt gasmengsel).
  3. Monteer een onverschillige (grond) elektrode in een passende houder en dompel de tip in de ACSF door de onderdompelingskamer. Sluit de draad aan op de grond van de opname-instelling.
  4. Vul de poreuze kop (gemaakt in stap 1.7) met de eerder bereide 0.3% agarose en plaats het in de onderlaagkamer. Zorg ervoor dat de oplossing niet over de bovenkant van de beker loopt.
  5. Bevestig een gekalibreerde ISM aan de pipethouder van een micromanipulator en een iontoforese microelektrode naar de tweede. Zet de houders in een hoek die geschikt is voor de instelling ( afbeelding 5a ).
  6. AansluitenDe ISM en de iontoforese micro-elektrode draden naar hun respectieve hoofdfasen van de opnameversterker. Als alternatief kunt u direct op de versterker aansluiten (afhankelijk van de instelling).
  7. Zorg ervoor dat het gewicht / de positie van de verbindingsdraden of clips geen beweging van de microelektroden veroorzaakt, aangezien kleine fluctuaties in positionering de resultaten kunnen beïnvloeden.
  8. Schakel de elektronische instelling in (vanaf stap 2). Start Walter en Wanda in aparte gevallen.
  9. Klik in de Wanda GUI op "Calibreren" ( Figuur 6a ). Vul in de kalibratiebox ( figuur 6b ) de spanningen in die tijdens de ISM-kalibratie zijn gemeten (stap 3.29) en klik op "Pas gegevens op".
    OPMERKING: hiermee kunt u de volgende weergave van de Nicolsky-vergelijking aanpassen (alternatief de equatie op een andere manier passen om M en K te verkrijgen):
    Vergelijking
    HaarE, V is de gemeten spanning (mV), M is de Nicolsky-helling (mV), C is de concentratie van ionen (mM), K is de interferentie (mM) en V 0 is de offset-spanning (mV) 3 .
  10. Klik op 'Accepteren' in het vak Calibreren om automatisch de helling ( M ) en interferentie ( K ) die in stap 6.9 is gegenereerd, automatisch over te dragen naar de hoofd GUI.
    OPMERKING: Hier vertegenwoordigt K de Na-inmenging, die gewoonlijk verwaarloosbaar is.
  11. Controleer aan de linkerkant van de GUI dat alle experimentele parameters in overeenkomstige ingangen zijn ingesteld ( Figuur 6a ).
    1. Stel in de bronmethode de bron in op de iontoforetische bron (standaard), de "Record Duration" op "200 s" (standaard), de "Pulse Begin" naar "10 s" (standaard), de "Pulse End" Naar "60 s" (standaard), de "Bias Current" naar "20 nA" (standaard), de"Hoofdstroom" naar "100 nA" (standaard) en de "Conversiefactor" naar een geschikte waarde.
    2. In de Meet elektrode doos, instel "Bad C" op de concentratie van TMA binnen de badoplossing (uitgedrukt in mM). Stel de 'Total Gain', 'Output Channel', 'ISM Channel' en 'Ref Channel' in op passende waarden voor het gegevensverzamelingssysteem dat in gebruik is.
      OPMERKING: De "Conversion Factor" moet op een geschikte waarde (specifiek voor de iontoforetische eenheid in gebruik) zijn ingesteld. Deze waarde specificeert de hoeveelheid stroom die voor een gegeven toegepaste spanning wordt doorgegeven van de D / A-converter (nA / mV).
  12. Plaats een temperatuursensor in de agarbeker. Noteer de gemeten temperatuur in de "Temperatuur" -toets in het vak "Meet elektrode" van de GUI ( Figuur 6a ).
  13. Zet de subfase-verlichting aan. Draai indien nodig de camera aan op de microfoonRoscope en camera monitor.
  14. Laat de micro-elektroden minstens 1,000 μm diep in de agarose zakken en centraal in de beker ( Figuur 5b ). Visualiseer ze onder de microscoop met behulp van een 10X-doelstelling (waterdichtingsdoel met een lange werkafstand).
  15. Controleer de spanning op de versterker op 0 mV voor zowel referentie- als ISM-kanalen om de in de agarose opgenomen spanning als uitgangspanning te bepalen.
  16. Op de tweekanaalsversterker verplaats de ISM-kanaalschakelaar handmatig naar de spanningsaftrekkingsuitgang om de aftrek 'aan' tussen de referentie- en ISM-kanalen in te stellen.
    OPMERKING: Subtractie zorgt ervoor dat de spanning verandert in het ISM-kanaal alleen de veranderingen in de TMA-concentratie weerspiegelen.
  17. Verplaats de ISM zodat het de tip van de iontophorese micro-elektrode raakt. Centreer de uiteinden op elkaar in alle drie de richtingassen.
  18. Zero de relatieve posities van beide micro-elektroden op deMicromanipulator controleboxen. Zorg ervoor dat de micro-elektroden nauwkeurig en nauwkeurig (kritisch) centraal staan.
  19. Verplaats de ISM 120 μm van de iontoforese micro-elektrode in één as (de linker-rechter as, Figuur 5b ). Voer deze afstand in in het vak 'Meet elektrode' van de GUI ( Figuur 6a ).
  20. Start een opname door op "Acquire" te klikken in de GUI ( Figuur 6a ); Laat het programma toe om een ​​volledige opname op te nemen.
    OPMERKING: De iontophorese microelektrode ontvangt een constante biasstroom. Nadat u op "Acquire" hebt geklikt, is er een korte vertraging voordat de hoofdstroom voor een beperkte duur wordt toegepast.
  21. Herhaal stap 6.20 twee tot drie keer. Wacht tot het TMA-signaal terugkeert naar de basislijn voordat u nieuwe records verwerven; Het programma slaat elk record op voor latere analyse.
  22. Controleer de afstand van de twee microelektroden door de ISM terug te bewegen tO de nulpositie die door de controlebox is opgegeven. Als de microelektroden niet meer gecentreerd zijn, moet u ze opnieuw centreren met dezelfde strategie als in stap 6.17. Noteer wijzigingen in de positie van de elektroden.
    OPMERKING: als de spatie met meer dan ongeveer 2% verandert, kunnen de in stap 6.19 verkregen records niet als accuraat worden beschouwd en moeten er nieuwe worden opgenomen.

Figuur 5
Figuur 5: Opzet voor experimenten in agar. (A) Configuratie voor experimenten in verdunde agar (stappen 6,1-6,5): Een kleine poreuze bak met verdunde agar geplaatst in een lopende perfusiekamer. Een micro-elektrode (ionografische) micro-elektrode (linkszijde) en een ISM (rechtse kant) worden gehouden door micro-elektrodehouders; Microelektrodehouders zijn in de armen van robot micromanipulators aangebracht. Een temperatuursensor wordt in agar gel geplaatst en een onverschillige grondelektrode is plIn de submersiekamer. ( B ) Vergrote weergave van microelektroden in agar: Een iontoforese microelektrode (linkerkant) en een ISM (rechtse kant) worden in agar weergegeven met behulp van een 10x waterdempingsdoel (objectief gedompeld hier in 150 mM NaCl). Microelektroden worden gepositioneerd met behulp van micromanipulatoren tot een diepte van 1000 μm; De afstand tussen microelektroden is 120 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6: Wanda Computer Software Interface. (A) navigeren Wanda grafische gebruikersinterface (GUI): Het scherm dat na het openen van de Wanda software weergegeven. In vak (1) worden de juiste medium, iontoforese molecule en techniek geselecteerd. (2) "Kalibreren" is geklikt om te openenDe Wanda kalibratie doos. Nadat de ISM is gekalibreerd (zie Figuur 6b en Aanvulling B), is de ISM gepositioneerd in agar of hersenen, zoals beschreven in stappen 6 en 8 van het protocol. In vak (6) worden alle passende waarden voor het uitgevoerde experiment ingevoerd. (7) 'Acquire' is geklikt om een ​​opname te maken; Een grafiek van spanning versus tijd verschijnt in het bovenste gedeelte van de Wanda GUI. ( B ) ISM in Wanda kalibreren : Het venster dat opent na het klikken op (2) "Calibreren" in de Wanda GUI. De waarden uit stap 3.29 worden ingevuld in vak (3), en (4) "Fit Data" is geselecteerd. De kalibratiekromme wordt bevestigd lineair te zijn. (5) 'Accept' is geklikt om terug te keren naar de Wanda GUI. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Agarose Data Analysis

  1. Open deWalter programma op de computer (pc). In het menu "0. Records From:" klikt u op de knop "Wanda / VOLTORO" om de records die door Wanda worden gegenereerd te lezen ( Figuur 7a ). Als u wilt dat de uitvoer naar een spreadsheet is vereist, open de juiste software. Klik op "Sheet 1.3" in de "1. Write Excel?" Menu ( figuur 7b ).
  2. Selecteer in het volgende pop-upvenster de (te) record (en) die te lezen en klik op "Openen" ( Figuur 7b ); Let op dat de records automatisch worden gepografeerd. Voer de volgende stappen uit om de montageprocedure te starten.
    1. Klik in het menu '2. Opties' op de knop 'select rec'. In het pop-upvenster " Figuur 2 ", gebruik de muis om de kruispunten te verplaatsen over het eerste record dat moet worden verwerkt ( Figuur 7c ); Druk op de muisknop om het record te kiezen.
    2. Klik op oN "fit curve" in het menu. Selecteer het gewenste aantal iteraties van montage; Gebruik tenminste 20 iteraties van de montage om een ​​correcte pasvorm van de gegevens te verkrijgen.
    3. Selecteer in het menu "alles" om alle data punten te passen en selecteer "doorgaan" Het programma past de weergegeven curve aan. Let op de montageprocedure en vergelijk het experimentele record met de verkregen beste curve.
  3. Selecteer de optie om het resultaat te schrijven in het betreffende spreadsheetprogramma door op "Excel" in het menu "7. Resultaten" te klikken ( Figuur 7d ). Let op (en record) de volgende kritische gegevens die worden gebruikt om de functionaliteit van de iontoforese micro-elektrode te bepalen: ' D (E5) ', ' Reference D (E5) ', ' r_app ', transportnummer ' n t ', ' Apparent N t '.
    OPMERKING: " D (E5) ": Gemeten vrije diffusiecoëfficiënttx 10 5 (cm2 / s); " Referentie D (E5) ": Theoretische vrije diffusiecoëfficiënt x 10 5 (cm 2 / s). Deze waarde wordt geëxtraheerd vanuit een database binnen Walter, gebaseerd op de ionen, het medium en de temperatuurinvoer. " R_app ": schijnbare micro-elektrodeafstand (cm), berekend op basis van de gemeten en referentie D (E5) . " N t ": Transportnummer (dimensieloos). Dit getal bepaalt de fractie van de iontoforese stroom die wordt gebruikt om TMA 4 vrij te geven . " Schijnbaar n t ": Schijnbaar transportnummer (dimensieloos). Dit is een transportnummer berekend vanaf r_app . Dit getal moet dicht bij de gemeten n t liggen .
  4. Herhaal stappen 7.1-7.3 voor elk van de records voor een gekozen paar microelektroden.
  5. Bepaal of de iontoforese microelektrode bruikbaar is door het volgende te doen.
    1. Vergelijk " r_app" met de werkelijke r ( dwz 120 μm); Dit criterium is vervuld indien de gemiddelde waarden van alle proeven binnen 4% van elkaar liggen.
    2. Vergelijk " D (E5)" met de referentie D (E5) ; Dit criterium is vervuld indien de gemiddelde waarden van alle proeven binnen 8% van elkaar liggen.
    3. Vergelijk de " n t " tussen proeven met dezelfde micro-elektrode; Dit criterium is vervuld indien de gemiddelde waarden van alle proeven binnen 10% van elkaar liggen.
  6. Als een van de criteria uit stap 7.5 niet is voldaan, moet u de ionophorese micro-elektrode oplossen of een andere testen.
  7. Als het micro-elektrode van de iontoforese geschikt wordt geacht voor het experiment, record het gemiddelde transportnummer van alle proeven in het veld Transportnummer N in de Wanda GUI ( Figuur 6a ).

jove_content "> Figuur 7
Figuur 7: Walter Computer Software Interface. (A) Het kiezen van het programma voor gegevensverzameling in Walter: De "0. Records From:" menu opent na het starten van de Walter software. De optie om de door Wanda opgeslagen bestanden te laden wordt geselecteerd door op de knop "Wanda / Voltoro" te klikken. ( B ) De data- en data-analyse-uitvoerplaats in Walter selecteren: [Links] Nadat het betreffende spreadsheetprogramma is geopend, wordt "Sheets 1.3" gekozen om alle Walter-data-analyses uit te voeren naar het eerder geopende spreadsheetprogramma. [Rechts] Nadat de data-analyse uitgangslocatie is gekozen, wordt een pop-upvenster geopend waardoor de gebruiker de eerste en laatste opnamen kunt kiezen die door Walter worden gelezen. ( C ) De opname kiezen om te analyseren in Walter: [Rechts] Nadat de bestanden die u wilt lezen gekozen worden, wordt een pop-upvenster geopend met alle geselecteerde records disGespeeld als een grafiek (" figuur 2 "). [Links] In het menu "2.Opties" wordt "select rec" geklikt, en de muis wordt gebruikt om de crosshairs te verplaatsen om de eerste opname voor analyse te identificeren; Of met de muisknop wordt gedrukt om de opname te kiezen. ( D ) Exporteren van de data analyse van Walter naar een spreadsheet: Na het aanpassen van de gegevens verschijnen een pop-upvenster en het menu "7. Resultaten". [Links] Grafiek van de geselecteerde opname (blauw) met de gepaste diffusiecurve die door Walter (rood) wordt gegenereerd. [Rechts] Met het menu "7. Resultaten" kan de gebruiker de gegevens van de analyse naar een spreadsheetprogramma schrijven door op de knop "Excel" te klikken. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Real-time Iontophorese in Brainschijfjes

  1. Plaats een 400 μm dikke hersen sLuizen in de opname kamer, zodat het volledig ondergedompeld is in de vloeiende ACSF. Plaats de plak met een waterverf pensel en beveilig het voorzichtig met een rooster.
  2. Beweeg zowel de iontoforese microelektrode als de ISM boven het veld van belang op de breinschijf. Onderdompelen zowel in de stromende ACSF maar boven de plak.
  3. Controleer de spanning voor zowel de referentie als de ion-sensingskanalen op "0" mV. Wacht tot de spanning in beide kanalen stabiliseert. Markeer de spanning gemeten op het ijzensensiekanaal van de ISM op de kaartrecorder. Gebruik hiervoor de basiswaarde V-parameter in Wanda.
  4. Plaats de ISM en de iontoforese microelektrode 200 μm diep in de plak en 120 μm van elkaar af. Wacht op de stabilisatie van het signaal na het verplaatsen van de micro-elektrode in de hersenschijf.
    OPMERKING: De biasstroom die wordt toegepast op de iontoforese micro-elektrode veroorzaakt een kleine accumulatie van TMA. Het is een gewone fout om ar te nemenOpnemen te vroeg en onderschatten de signaalopbouw.
  5. Merk op de grafische recorder de gestabiliseerde spanning gemeten in de hersenschijf op het ion-sensing kanaal van de ISM. Bereken het spanningsverschil tussen het TMA-signaal gemeten in stap 8.3 en stap 8.4 en voer deze waarde in in het veld "Baseline V (mV)" in de Meet Electrode-box van de Wanda GUI ( Figuur 6a ).
  6. Controleer aan de linkerkant van de GUI dat alle experimentele parameters correct zijn opgenomen / ingevoerd. Stel 'Medium' in 'Brain', 'Transportnummer' op de gemiddelde waarde berekend voor de iontoforese micro-elektrode in stap 7.4, en 'Temperatuur' op de temperatuur van het bad dat het segment bevat.
    OPMERKING: V moet voor elke set metingen worden opgenomen. De basislijn V wordt door Wanda omgezet in de basis C (mM) parameter ( dwz de concentratie van TMA in het hersenweefsel).
  7. Start de opname door op "Acquire" te klikken en laat het een volledige opname maken. Wacht tot het TMA-signaal terugkeert naar de basislijn voordat u een nieuwe opname krijgt.
  8. Neem twee tot drie opeenvolgende opnames voordat u de microelektroden van de gekozen hersenlocatie verwijdert. Voer de temperatuur onmiddellijk voor elke opname in de Wanda-software in.
  9. Beweeg beide microelektroden diagonaal terug naar het oppervlak van de plak. Raak beide naar tenminste 50 μm boven de plak. Bepaal met behulp van de grafische recorder alle veranderingen tussen de V gemeten en de meting van stap 8.3.
  10. Centrum de tips van het ISM en de iontoforetische micro-elektroden in relatie tot elkaar in de x-, y- en z-assen. Verkrijg spatiewijzigingen, indien aanwezig, van het display van de micromanipulator controlebox.

9. Brain Data Analysis

  1. Open een nieuwe spreadsheet voor de analyse-uitvoer.
  2. Herhaal stap 7.1-7.4 in Walter om te analyserenE de opnames uit de hersenen.
  3. Schrijf de gegevens op het spreadsheet programma door op "Excel" in het Walter menu te klikken. Noteer de a , volume fractie van de hersenen ECS; Λ , tortuositeit van de hersenen ECS; En k (s -1 ), niet-specifieke klaring.

10. Transportnummer en ISM-kalibratie controleren

  1. Meet de ISM transportgetal (NT) aan het einde van het experiment via het onderstaande protocol. Alternatief, controleer n t na kritisch onderzoek of bij de meting worden weergegeven abnormaal. Het controleren van n t te vaak kan echter leiden tot trauma aan de breinschijf.
  2. Neem nieuwe opnames in agarose. Zie stappen 6.4, 6.11, 6.12, 6.14, 6.15 en 6.17-6.22.
  3. Herhaal stap 7.1-7.4 in Walter om de n t van de nieuwe agarose opnames te verkrijgen. Controleer de spreadsheet: als de n t is veranderd met meerdan 10% van de n t verkregen vóór de hersenmetingen, de met deze iontoforetische microelektrode gegevens niet betrouwbaar.
  4. Voer een nieuwe kalibratie uit (zie stap 3.29) voor de ISM nadat alle hersendata is verzameld. Gebruik de nieuw verkregen ISM-kalibratiedata als invoer in het Wanda Calibrate-vak (zie stappen 6.9 en 6.10) en controleer of de hellingswaarde met minder dan 10% van de vorige kalibratie verschilt.
    OPMERKING: De gegevens die bij deze ISM zijn verkregen, zijn niet betrouwbaar indien de hellingswaarde met meer dan 10% van de vorige kalibratie verschilt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het nut van de RTI techniek wordt aangetoond in een experiment dat is ontworpen om de veranderingen in a en tijdens een hypoosmolaire uitdaging te meten ( Figuur 8 en Figuur 9 ). Het is eerder aangetoond dat het verminderen van de osmolariteit van de ECS door wassen op hypotonische ACSF een afname in a en een toename van λ 13 zal veroorzaken .

In dit experiment werd RTI uitgevoerd op rat hersenplakken onder beide controle condities en tijdens het wassen van hypotonische ACSF. Een ISM werd vervaardigd en zijn kalibratieparameters werden ingevoerd in Wanda voor montage op de Nicolsky-vergelijking, die een helling ( M ) van 58,21 mV berekende. De ISM en iontophorese microelektroden werden in agar geplaatst en 120 μm apart van elkaar geplaatst om het transport nu te metenmber. Drie opnamen werden genomen en de krommen werden gemonteerd en geanalyseerd volgens de procedure in stap 6 van het protocol ( Figuur 8a ). De toegepaste curve van elke proef overlappend met de ruwe bocht ( Figuur 8a ). De gemeten diffusiecoëfficiënt ( D x 1E5 ), het transportnummer ( n t ) en het verschil tussen de schijnbare afstand van de microelektroden ( r_app ) en hun werkelijke afstand ( r ) verschillen niet significant tussen de drie opnamen ( Figuur 8b , Opnames a1-3). Op basis van deze criteria werd dit iontoforese micro-elektrode geacht acceptabel te blijven met het experiment.

Zodra de stabiele iontoforese microelektrode werd gekozen, werden controlewaarden voor a en λ in de rat hersenschijf genomen om een ​​basislijn te bepalen voor deze parameters. PreVious studies bleek dat controle waarden voor de rat neocortex a = 0,18-0,22 en A = 1,54-1,65 1 zijn . Om deze waarden te repliceren in dit experiment werden de micro-elektroden van ISM en iontoforese 200 μm diep in de rat neocortex en 120 μm van elkaar geplaatst. Het gemiddelde n t , berekend uit de gegevens in Figuur 8b , werd in het Wanda-programma ingevoerd voor gebruik in de berekeningen van a en λ . Een verschuiving in basislijn V van de plaatsing van de twee microelektroden ongeveer 200 μm diep in de hersenen werd geregistreerd en de spanningshop werd in Wanda ingevoerd om de basislijn TMA ( dwz de basis C parameter) te corrigeren. Er werden drie opnamen gemaakt, en hun curven werden gemonteerd ( Figuur 9a , Figuur 9d en Figuur 9f ). De pasjes onthullen een gemiddeldeA = 0,192 en λ = 1,69 ( figuur 9e ). Spacing en verschuivingen in basislijn V werden gecontroleerd nadat de opnames werden genomen en de gecorrigeerde waarden werden in Wanda ingevoerd om de data opnieuw te analyseren (zoals gedetailleerd in stap 8 van het protocol). De herberekende waarden verschillen niet significant en de waarden die in figuur 9d zijn gerapporteerd, werden geaccepteerd.

De normale osmolariteit van ACSF is 300 mOsm. Om het effect van hypotonische ACSF op α en λ in de somatosensorische neocortex van de rat te testen, werd ACSF met een osmolariteit van 150 mOsm gemaakt door de NaCl-concentratie te verminderen. Er werd verondersteld dat dit hypotonische ACSF zou leiden tot zwelling van hersencellen, waardoor een lager a en een potentieel hoger λ 13 zou kunnen zijn . De hersenschijf werd superfused met hypotonische ACSF gedurende ongeveer 30 minuten, waardoor het mogelijk wasEvenwicht met de hersenen. Gedurende deze tijd bleven de microelektroden op dezelfde plaats in de neocortex zoals ze waren tijdens eerdere metingen van controle condities. Vijf opnames werden genomen onder hypotonische omstandigheden ( Figuur 9b en f ). Dit genereerde een gemiddelde a = 0,13 en λ = 1,84 ( Figuur 9e ). Deze waarden waren consistent met de hypothese dat hypoosmolariteit α vermindert en λ verhoogt. Spacing en veranderingen in basislijn V werden gemeten en in aanmerking genomen tijdens de analyse en montage procedure.

Herstelparameters werden ook gemeten door te wassen op regelmatige ACSF (300 mOsm) en nieuwe opnames op dezelfde plaats in de neocortex te nemen. Omdat zwellingseffecten omkeerbaar zouden zijn, werd verwacht dat a en λ zou terugkeren naar controle niveaus. De waarden avVerwerkt over vier platen die na 30 minuten van de normale ACSF-wasserij werden genomen, waren α = 0,37 en A = 1,61 ( Figuur 9c , Figuur 9e en Figuur 9f ). Dit toonde aan dat er onder deze omstandigheden een onverwachte overschrijding was tijdens het herstel van α ( Figuur 9e en Figuur 9f ). Daarna werden de microelektroden teruggekeerd naar agar om te bevestigen dat het transportnummer van de iontoforese micro-elektrode ongewijzigd was ( Figuur 8c ). De ISM werd dan opnieuw gecalibreerd, en de nieuwe fit voor de Nicolsky vergelijking bleek de helling te zijn 58,21 mV.

Dit experiment is een duidelijk voorbeeld van hoe RTI onder ideale omstandigheden lijkt. De volgende elementen van het experiment waren de sleutel tot het succes ervan. Ten eerste, experimentele gegevens verzameld inAgarose en de hersenen toonden voldoende overlapping met de theoretische curven die door Wanda werden gegenereerd ( Figuur 8a en Figuur 9a en Figuur 9c ). De gelijkenis in helling, piek, en terug naar een vergelijkbare basislijn zijn allemaal belangrijk bij het bepalen van de kracht van de wedstrijd. Deze delen van de kromme zijn vaak problematisch bij opname in agarose, en het is gebruikelijk dat meerdere opnames moeten worden genomen alvorens de omstandigheden te vinden die goed gecompenseerde curven produceren ( dwz goede micro-elektroden). Ten tweede waren de gemiddelde transportnummers voor en na het experiment binnen 10% van elkaar ( Figuur 8b en Figuur 8c ). Als dit niet is gebeurd, kunnen de waarden in de hersenen niet worden vertrouwd. Dit is veruit het meest voorkomende probleem dat voorkomt bij RTI-experimenten. Ten derde, de ISM-kalibraties in gestandaardiseerde TMA-oplossingen voor en afTer het experiment overeenkomt (data niet getoond). Typisch zijn de kalibraties van een werkend ISM binnen 10%, waardoor dit een ongewone bron van experimentfout is.

Figuur 8
Figuur 8: Ideal Curve Fit Data in Agar voor en na experimenten in de hersenen. (A) Representatieve gegevens van een proef agar: [uiterst links] Representatieve gegevens van een proef verkregen agar aantonen van de concentratie curve van TMA. Voorafgaand aan diffusiemetingen werd een constante voorspanningsstroom van +20 nA aangebracht via de iontoforese micro-elektrode. Op tijd = 10 s werd TMA gepulseerd van de iontoforese micro-elektrode in de agar door een 50 secondenstroomstroom van +60 nA toe te passen. Een diffusiekromme werd gegenereerd door [TMA] te meten met behulp van een ISM geplaatst 120 μm van de bron. [Midden] Een aangepaste curve verkregen uit gegevens pRocessing in walter [Rechts] De overlap van de data en de aangebrachte curve tonen aan dat de curve-montage die Walter heeft uitgevoerd nauwkeurig diffusie modelleren in dit proces. ( B ) Tabel van agarmetingen voor experimenten in de hersenen: Gegevens verkregen uit drie proeven (a1, bovenstaande grafiek) voorafgaand aan de hypotonische stress experimenten ( Figuur 9 ). Alle proeven werden uitgevoerd met de iontoforese microelektrode en ISM gebruikt voor de hypoosmotische stressproeven. De gegevens voldoen aan de criteria die nodig zijn om verder te gaan met het experiment in breinschijfjes. Deze criteria omvatten voldoende overlapping tussen de data en de toegepaste curve (zoals hierboven) en minder dan 10% variatie in transportnummer. Aanvullende criteria worden beschreven in stap 7.6. ( C ) Tabel van agarmetingen na experimenten in de hersenen: Gegevens verkregen uit drie proeven uitgevoerd in agar na de hypoosmotische stress experimenten ( Figuur 9 ). Het bestaan Ency aangetoond tussen proeven a1-3 en a4-6 stelt sterk voor dat de ISM en iontoforese microelektroden stabiel waren in de hersenproeven. Rec = opname of trial; R = afstand tussen de ISM en de iontoforese micro-elektrode; Cb = basislijnconcentratie; Ref D x1E5 = theoretische vrije diffusie coëfficiënt x 10 5 (cm 2 s -1 ) op basis van een vooraf berekende standaard; N t = transportnummer (dimensieloos); D (E5) = gemeten vrije diffusie coëfficiënt x 10 5 (cm 2 s -1 ); R_app = schijnbare micro-elektrodeafstand (cm) op basis van de gemeten en referentie D (E5); N t apparent = schijnbaar transportnummer op basis van r_app . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

"> Figuur 9
Figuur 9: Hyposmotische Stress vermindert Alpha en verhoogt Lambda
ac. Representatieve gegevens uit proeven in de hersenen onder ( a ) controle, ( b ) hypoosmotische, en ( c ) herstelvoorwaarden: vaste lijnen vertegenwoordigen gegevens en gestippelde zwarte lijnen zijn uitgerust met curven. De drie condities tonen sterk verschillende diffusiekrommen, waaronder verschillende hellingen, amplitudes en breedtes. ( D ) Gegevenslijst van controleproeven: Gegevenslijst van drie controleproeven (b1, bovenstaande grafiek); Α en λ zijn vergelijkbaar in alle proeven en in overeenstemming met gepubliceerde gegevens voor de rat neocortex. Voor alle proeven in de hersenen werd de gemiddelde n t van pre- en post-experiment agarmetingen ( Figuur 8b en 8c ) gebruikt voor de hersenen n t D ref werd ingesteld op 1,25 × 10 -5 cm 2 s -1 , gebaseerd op een database van diffusiecoëfficiënten (in Walter) die werd verkregen in de ratbrein wanneer T = 34,5 [° C]. De parameter k ' [s -1 ] staat voor de kleine hoeveelheid TMA verloren van de ECS tijdens de diffusiemetingen. Hoewel k ' typisch erg klein is, met inbegrip van de parameter in curve-montage, wordt de nauwkeurigheid van de RTI-methode verbeterd. De verliesparameter k ' vertegenwoordigt waarschijnlijk cellulaire opname of het verlies van TMA aan het ACSF. ( E ) Vergelijking van controle-, hypoosmotische- en herstelomstandigheden: Gemiddelden van alle proeven in de hersenen onder controle, hypoosmotische en herstelomstandigheden. De gegevens tonen aan dat hypoosmotische stress α vermindert en λ toeneemt. Tijdens een herstelperiode na hypoosmotische condities, α- overschot basislijn (controle), terwijl λKeert terug naar de basislijn. De resultaten suggereren dat veranderingen in ECS tijdens hyposmotische uitdagingen gedeeltelijk omkeerbaar zijn. De RTI methode is ideaal voor het bestuderen van dit soort acute reversibel effect. ( F ) Grafiek die data clustering demonstreert: De volume-fractie (x-as) en tortuositeit (y-as) van elke proef worden als één punt getekend. De grafiek toont de clustering van gegevens binnen elke groep ( dwz controle, hypoosmolar en herstel), wat aangeeft dat RTI de gevoeligheid heeft om de reproduceerbare effecten van een hypoosmolaire uitdaging in de hersenen ECS te detecteren. Rec = opname of trial; R = afstand tussen ISM en iontoforese micro-elektrode; Cb = basislijnconcentratie; Alfa = volume fractie; Lambda = tortuosity; K ' = niet-specifieke klaring van de sonde. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende bestanden: Klik hier om de bestanden te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Figuur 10
Figuur 10: Niet-ideale gegevens die gemeenschappelijke technische problemen tonen. (A) Schema van gemeenschappelijke technische problemen met iontoforese micro-elektroden: Vergelijking van de normale release van TMA uit een functionerende iontoforese micro-elektrode met drie bronnen demonstreren technische problemen. [Hoge vergroting, a1] De stroom in een ideale iontoforetische bron wordt gelijk verdragen door TMA release en chloride opname. [Hoge vergroting, a2] Een iontoforese microelektrode met lage n t laat minder TMA vrij en neemt meer chloride op dan normaal. [High magnification, a3] Een iontophorese microelektrode die elektroosmosis toont, geeft TMA, chloride en oplosmiddel vrij. [Hoge vergroting, a4] Een iontophorese microelektrode die in de loop der tijd groeiende vrijlating toont ( dwz "opwarmen"). ( B ) Grafiek van niet-ideale gegevens oIn agar: De gegevens worden niet adequaat gemodelleerd door de curve die door Walter is uitgerust en kan daarom niet nauwkeurig worden geïnterpreteerd; De exacte oorzaak van de discrepantie is onduidelijk. C ) Tabel van niet-ideale data verkregen in agar: Normale of verwachte resultaten in agar worden weergegeven in de bovenste rij (afgebeeld in Figuur 8a ) ter vergelijking met de niet-ideale data in de tweede rij (afgebeeld in Figuur 10b ). De arme overlapping tussen de data en de geperforeerde curve in figuur 10b betekent dat de geperforeerde curve de diffusiedata niet nauwkeurig modelert; Daarom kunnen de berekende waarden (gemarkeerd met *) niet worden geïnterpreteerd. Dit zou kunnen zijn veroorzaakt door problemen met de iontophorese micro-elektrode ( bijv. Opwarmen) of de ISM ( bijv. Traag antwoord). Probleemoplossing: wissel de micro-elektroden één voor één uit, beginnend met de iontoforese micro-elektrode. Rec = opname of trial; r= Afstand tussen ISM en iontoforese micro-elektrode; Cb = basislijnconcentratie; Ref D x1E5 = theoretische vrije diffusie coëfficiënt x 10 5 (cm 2 s -1 ) op basis van een vooraf berekende standaard; N t = transportnummer (dimensieloos); D (E5) = gemeten vrije diffusie coëfficiënt x 10 5 (cm 2 s -1 ); R_app = schijnbare micro-elektrodeafstand (cm) op basis van de gemeten en referentie D (E5); N t apparent = schijnbaar transportnummer op basis van r_app . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Terwijl het experiment getoond in Figuur 8 en Figuur 9 een stabiele en werkende iontoforese micro-elektrode en ISM had, zijn er veel experimenten waarin ofwel of bovenDe microelektroden worden gecompromitteerd en leveren geen ideale resultaten op. Een "normale" TMA iontoforese micro-elektrode heeft een waarde van n t Vergelijking 0.3. Figuur 10a toont drie gemeenschappelijke problemen met het iontoforese microelektrode dat kan worden geconfronteerd tijdens RTI experimenten.

Lage vrijlating. De iontoforese microelektrode geeft zeer weinig TMA vrij wanneer biasstroom of hoofdstroom wordt toegepast, wat resulteert in n t <0,1. De stroom gaat nog steeds door het punt, maar het grootste deel wordt gedragen door de Cl anion die de tip binnentreedt en heel weinig door de TMA-kation die de punt verlaat. Als n t stabiel is in meerdere opeenvolgende proeven, kunnen deze iontoforese microelektroden worden gebruikt. Dit wordt echter niet aanbevolen, omdat ze niet optimaal functioneren, wat betekent dat verdere problemen kunnen ontstaan. Een nog groter extreemKomt voor wanneer de punt van de iontoforetische micro-elektrode geblokkeerd is en er geen ionen verlaten of in de punt komen. In dit geval wordt er geen curve geproduceerd. In dergelijke gevallen moet na het controleren of alle elektrische verbindingen goed en veilig zijn, de iontoforese microelektrode worden weggegooid.

Hoge afgifte (elektroosmosis). Naast TMA, laat de iontoforese micro-elektrode ook water vrij, wat resulteert in n t > 0,5. Als de nt stabiel gedurende verscheidene processen, kunnen deze iontoforese micro-elektroden worden gebruikt, maar dit wordt niet aanbevolen als verdere problemen ontstaan. De enige oplossing voor het oplossen van problemen is het verminderen van de hoofdstroom. Dit elimineert soms de ontlading van water en zorgt ervoor dat de n t lager wordt dan 0,5.

Groeiende release ("warming up"). In dit geval neemt de TMA-vrijlating over de tijd toe. Wanneer de "opwarmen" snel is,De diffusiecurve heeft een vorm die vergelijkbaar is met die in figuur 10b , en kan niet betrouwbaar worden gemonteerd. In dit geval demonstreert de diffusiekromme een langzame stijging van de TMA-concentratie tijdens de initiële fase van de hoofdstroom, en de TMA-concentratie doet geen plateau. Een onbetrouwbare pasvorm creëert een onnauwkeurige gemeten D , die de consistentie van het gemeten transportnummer en de r_app- waarden beïnvloedt . Wanneer het "opwarmen" geleidelijker, is het geen significante invloed op de vorm van afzonderlijke diffusie curves, maar manifesteert in een nt die toeneemt over opeenvolgende proeven. Een "opwarmen" conditie kan soms worden opgelost door de iontophorese micro-elektrode gedurende een tijdsperiode (ongeveer 30 minuten) te "pulsen". Dit gebeurt door een paar seconden tegelijkertijd tussen een biasstroom en een hoge hoofdstroom (+200 nA) te wisselen. Als een micro-elektrode van een iontoforese nog steeds geen stabel geeftE transportnummer, het is best om gewoon een nieuwe te testen.

Precieze meting van het transportnummer en stabiliteit tijdens het gehele experiment zijn essentieel om een ​​nauwkeurige waarde voor α te waarborgen. Het behoud van de afstand tussen microelektroden is cruciaal voor de bepaling van zowel a en λ . Als de spatie verandert na een meting, ofwel in agarose of in de hersenen, kan de rechte afstand tussen de tips van de micro-elektroden in de uitvoer spreadsheet worden ingevoerd en door Walter opnieuw geanalyseerd worden. Als de waarden teveel verschillen, moet de meting weggooien. Temperatuurschommeling kan ook een bijdragende factor zijn voor onnauwkeurigheid, dus met behulp van een nauwkeurige temperatuursensor en een betrouwbaar kamerverwarmingselement is belangrijk.

De iontoforese microelektrode is de meest voorkomende bron van problemen in de RTI techniek; Het maken en gebruiken van een stabiele ISM is cruciaal voor het verkrijgen van goede gegevens. ONe mogelijk probleem met de ISM kan een trage reactie zijn, die kan worden veroorzaakt door zeer hoge impedantie in de tip. Met een langzaam reagerende ISM, lijken alle iontoforese microelektroden een 'warming up'-effect ( figuur 10b ) te hebben, maar de curve wordt simpelweg veroorzaakt door het onvermogen van het ISM om de veranderende TMA-concentraties snel genoeg te detecteren. Door de afstand tussen de microelektroden (tot 150 μm) te verhogen kan er meer tijd voor het ISM mogelijk zijn om te reageren en kan de kromming aanpassen. Een trage reactie kan aangeven dat de ionenwisselaar in de punt is teruggetrokken. Dit kan gezien worden onder een samengestelde microscoop en, indien aanwezig, betekent dat de silanisatie arm was en dat de ISM moet worden weggegooid. Bovendien kunnen de aandrijvingen in het ISM-signaal onjuiste gegevens van de gegevens veroorzaken. Het is aan de experimentator om te bepalen of de drift de gegevens buiten tolerantie beïnvloedt.

Beperkingen van RTI

THier zijn een aantal beperkingen op de RTI-methode door aannames die aan de data-analyse liggen. Deze veronderstellingen omvatten een vereiste voor weefsel homogeniteit en weefsel isotropie in zowel de hersengebied van belang en een sferisch volume dat deze regio omringt. In de context van RTI vereist weefselhomogeniteit dat de diffusieparameters constant in het gebied van belang zijn. Weefselisotropie betekent dat een enkele waarde van D * van toepassing is op alle drie ruimtelijke assen. Elk molecuul dat vrijkomt van een bron-micro-elektrode neemt een willekeurig pad voordat u op de positie van het opname-ISM komt. De spanning op de ISM, die het aantal moleculen (dat wil zeggen concentratie) op een enkele keer opneemt, omvat moleculen die in alle drie ruimtelijke assen hebben gereisd, evenals sommige moleculen die buiten de ISM zijn gereisd en zijn teruggekeerd naar de meting Punt ( figuur 1c ). Tijdens RTI data analyse, het Walter programma genAtes gemiddelde α en λ , waaronder de diffusie van alle moleculen die in alle assen van een puntbron naar de ISM reizen. Als het diffusiesnelheid significant verschilt in één van de drie ruimtelijke assen (anisotropie) of als het weefsel niet-homogeen is, zijn extra gegevensverzameling en data-analyse nodig om α en λ 8 , 14 te berekenen.

Naast bovengenoemde weefselvoorwaarden, vereist de RTI-methode dat de afstand tussen een puntbron en ISM, dat wordt aangeduid als r , ongeveer 80 - 130 μm bedraagt. Wanneer r lager is dan 50 μm, kan het ISM-antwoord misschien niet snel genoeg zijn om diffusie-afhankelijke veranderingen in de concentratie van het sonde-molecuul op te nemen. Dit kan in de toekomst worden hersteld met behulp van concentrische ISM's met snellere responstijden 10 , 15 . Groter rAfstanden minimaliseren ook breinregio-onafhankelijke verschillen in het ECS-milieu, ISM-tipgrootte en schade aan hersenweefsel tijdens ISM-plaatsing. Omgekeerd, wanneer r groter is dan 150 μm, is de diffusie van moleculen uit de iontoforetische puntbron meer vatbaar voor invloed door niet-isotrope, inhomogene elementen die het belang van de hersenzone van belang of de weefsel-perfusaatgrens 14 omringen.

Inclusief RTI en alternatieve technieken om ECS te verkennen

De RTI-methode behoort tot een grotere groep technieken die een moleculaire probe gebruiken om de ECS te bestuderen; Elke methode heeft zijn eigen voordelen en tekortkomingen. Terwijl RTI een real-time berekening van zowel α als λ in real time mogelijk maakt, vereist de methode een geladen moleculaire probe die gedetecteerd kan worden door een ionenwisselaar. In experimenten waar iontoforese niet geschikt is, zoals de studie van een niet geladen probe, iOntophorese kan worden vervangen door drukuitwerping. Helaas kunnen de huidige technieken niet de berekening van α met drukuitwerping veroorloven, omdat het vrijgelaten volume afhankelijk is van de eigenschappen van het geïnjecteerde medium 16 . Om een ​​sonde te gebruiken waarvoor geen exchanger bestaat, kan de sonde fluorescent worden getagd en zijn diffusie door ECS gemeten door epifluorescente microscopie. Deze techniek, bekend als integratieve optische beeldvorming (IOI), wordt beperkt door de grootte en beschikbaarheid van fluorescent gelabelde moleculen en het potentieel voor cellulaire opname 17 , 18 . De IOI-techniek heeft het voordeel dat macromoleculen als probes kunnen worden gebruikt, en dit heeft aangetoond dat A met moleculaire grootte toeneemt. Tenslotte heeft een belangrijke klasse diffusiemethoden radiotracers gebruikt, maar ze zijn niet meer gebruikelijk 2 .

Toekomstige toepassingen van RTI

in vivo te implementeren, waarbij het potentieel 1 , 4 , 6 wordt uitgebreid . Het kan ook gebruikt worden om de effecten van een grote verscheidenheid aan veranderingen in de hersenfysiologie te toetsen, zoals die veroorzaakt worden door veranderingen in de chemische omgeving, farmacologie, trauma of genetische knock-out 1 . Zolang de in de ECS geïnduceerde verandering gedurende een periode van ongeveer 2 minuten of langer duurt, kan RTI een nauwkeurige kwantificering van ECS-volume-fractie en tortuositeit verschaffen.

Terwijl significante inzichten in de structuur en functie van hersen ECS zijn gegenereerd in de afgelopen 50 jaar, daarBlijf veel onbeantwoorde vragen. Bijvoorbeeld, is het nog onduidelijk of en hoe homeostatische mechanismen α regelen en hoe veranderingen in α de hersenfunctie beïnvloeden. Computermodellen hebben geholpen om de relatieve bijdragen van celgeometrie en andere factoren die λ beïnvloeden, te schatten, maar meer werk is nodig 1 . Ten slotte is de rol van de ECS bij de pathogenese van neurologische aandoeningen (en vice versa) grotendeels onontgonnen. In de nabije toekomst kunnen RTI-metingen de doelmatige drugsafgifte naar specifieke hersengebieden verbeteren 19 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Het werk werd ondersteund door NIH NINDS subsidie ​​R01 NS047557.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A/D and D/A converter National Instruments Corporation NI USB-6221 DAQ The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available.
agarose Lonza NuSieve GTG Agarose #50081 to prepare dilute agarose gel for RTI measurements
amplifier for ISM Dagan Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages
biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective) for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope
borosilicate theta capillary glass tubing Harvard Apparatus Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811 double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm
brush Winsor & Newton University Series 233, size 0 round shoft handle brush, available from Amazon
bunsen burner Fisher
camera for visualizing micropipettes Olympus OLY-150 requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional
chart recorder to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished
chlorotrimethylsilane, puriss., > 99% Sigma-Aldrich catalog # 92360 for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
Commercial Software The MathWorks MATLAB, Data acquisition toolbox for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available.
eye protective goggles Fisher
fixed-stage compound microscope Olympus BX51WI can use other compound microscopes with fixed stages
forceps Fine Science Tools #11251-10 to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work
fume hood for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab
glass microscope slide Fisher #12-550A to chip microelectrode tips
heater/stirrer Fisher Corning PC-420D to prepare dilute agarose gel and stir solutions
iontophoretic unit Dagan ION-100 and PS-100 ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites)
liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium World Precision Instruments IE190 Potassium Ion Exchanger Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate - do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight.
microelectrode holder WPI M3301EH to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH.
micromanipulator Narishige MM-3 to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition
micropipette puller Sutter Instruments Model P-97 to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing
microprobe thermometer Physiotemp Model BAT-12R fine probe of this thermometer is placed close to recording site
needle BD Syringes and Needles # 305122 (25 gauge) for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5 mm x 16 mm)
objective 5X dry Olympus MPlan N
objective 10X water immersion Olympus UMPlan FL N 10X objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm
plastic containers (with lids) Fisher #14-375-148 to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes
platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope EXFO Gibraltar Burleigh platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability
porous minicup for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade
reusable adhesive Bostik Blu-Tack for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon
robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning Sutter Instruments MP-285 two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text).
signal conditioning unit with low-pass filter Axon Instruments CyberAmp 320 or 380 no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed.
silver wire A-M Systems #7830 diameter 0.015", bare (no coating)
slice chamber Harvard Apparatus Warner Model RC-27L this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber
stereomicroscope for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers
syringe, 10 mL BD Syringes and Needles #309604 to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip
syringe filter 0.22 µm pore Whatman #6780-1302 to filter backfill solutions; available from Fisher
syringe needle, 28 gauge, 97mm World Precision Instruments MicroFil MF28G-5 to backfill microelectrodes
Teflon (=PTFE) tubing Component Supply STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge) for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax.
temperature control system Harvard Apparatus Warner Models TC-344B and SH-27A TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers
tetramethyammonium (TMA) chloride Sigma-Aldrich T-3411 5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
vibrating blade microtome Leica VT1000S to cut brain slices
xylenes Fisher X5-1 for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sykova, E., Nicholson, C. Diffusion in brain extracellular space. Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).
  2. Nicholson, C. Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue. Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).
  3. Nicholson, C. Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment. J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).
  4. Nicholson, C., Phillips, J. M. Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum. J Physiol. 321, 225-257 (1981).
  5. Nicholson, C., Sykova, E. Extracellular space structure revealed by diffusion analysis. Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).
  6. Xie, L. L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
  7. Hrabetova, S., Nicholson, C. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC press. 167-204 (2007).
  8. Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission. J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).
  9. Vargova, L., et al. Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas. Glia. 42 (1), 77-88 (2003).
  10. Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue. J Vis Exp. (103), (2015).
  11. Xiao, F., Hrabetova, S. Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers. Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).
  12. Sherpa, A. D., Pvan de Nes,, Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains. Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).
  13. Kume-Kick, J., et al. Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex. J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).
  14. Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus. J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).
  15. Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording. J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).
  16. Nicholson, C. Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity. Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).
  17. Nicholson, C., Tao, L. Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging. Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).
  18. Thorne, R. G., Nicholson, C. In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).
  19. Wolak, D. J., Thorne, R. G. Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery. Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).

Tags

Neurowetenschappen Uitgave 125 Brein diffusie extracellulaire ruimte real-time iontoforese ion-selectieve micro-elektroden tortuositeit volume fractie
Real-time iontophorese met tetramethylammonium om volume-fractie en tortuositeit van de extracellulaire ruimte van de hersenen te kwantificeren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Odackal, J., Colbourn, R., Odackal,… More

Odackal, J., Colbourn, R., Odackal, N. J., Tao, L., Nicholson, C., Hrabetova, S. Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space. J. Vis. Exp. (125), e55755, doi:10.3791/55755 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter