Nonlytic insektcelle-ekspresjonssystemer er underutnyttet for produksjon, cellulær handel / lokalisering, og rekombinant protein funksjonell analyse. Her beskriver vi metoder for å generere ekspresjonsvektorer og påfølgende forbigående proteinekspresjon i kommersielt tilgjengelige sommerfugl-cellelinjer. Den ko-lokalisering av Bemisia tabaci aquaporins med subcellulære fluorescerende markørproteiner er også presentert.
Heterologe proteiner ekspresjonssystemer brukes for fremstilling av rekombinante proteiner, tolkningen av cellulær handel / lokalisering, og bestemmelse av den biokjemiske funksjon av proteiner ved under eller organismen. Selv om baculovirus ekspresjons-systemer blir stadig mer brukt for proteinproduksjon i mange bioteknologisk, farmasøytiske og industrielle anvendelser, nonlytic systemer som ikke involverer viral infeksjon har klare fordeler, men er ofte overses og lite brukte. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å generere nonlytic ekspresjonsvektorer og forbigående ekspresjon av rekombinant protein. Denne protokollen gir mulighet for effektiv cellulær lokalisering av rekombinante proteiner og kan brukes til hurtig å skjelne protein handelen i cellen. Vi viser ekspresjonen av fire rekombinante proteiner i en kommersielt tilgjengelig insekt-cellelinje med to aquaporin proteiner fra det insekt Bemisia tabaci, så velsom subcellulære markørproteiner som er spesifikke for celleplasmamembranen og intracellulære lysosomer. Alle rekombinante proteiner ble produsert som kimærer med fluorescerende protein markører på sin karboksyl termini, som gjør det mulig for den direkte påvisning av de rekombinante proteiner. Den doble transfeksjon av celler med plasmider som husing konstruksjoner for gener av interesse og en kjent subcellulær markør tillater levende celle avbildning og forbedret verdsetting av cellulært protein lokalisering.
Fremstilling av rekombinante proteiner ved anvendelse av insektcelle-ekspresjonssystemer gir en rekke fordeler for studiet av eukaryote proteiner. Nemlig, insektceller har lignende post-translasjonelle modifikasjoner, behandling, sortering og mekanismer som de som er til stede i pattedyrceller, som er fordelaktig for fremstilling av korrekt foldete proteiner 1, 2, 3. Insektcellesystemer inkluderer også typisk mindre ressurskrevende og mindre tid og anstrengelse for vedlikehold enn pattedyrcellelinjer 4, 5. Baculovirus-ekspresjonssystemet er et slikt insektcelle-basert system som nå mye brukt i mange fagområder, inkludert produksjon av rekombinante proteiner for proteinkarakterisering og terapeutika, det immunogene presentasjonen av fremmede peptider og virale proteiner for vaksineproduksjon, syntesen av fler -protein-komplekser, Produksjon av glykosylerte proteiner, osv. 1, 2, 4, 6. Det finnes imidlertid situasjoner hvor baculovirus ekspresjon kan ikke være relevant 3, 7, og bruken av nonlytic og forbigående insekt ekspresjonssystemer kan være mer hensiktsmessig. Nærmere bestemt, har transient insektcelle ekspresjon mulighet for hurtig syntese av rekombinant protein, krever mindre utvikling og vedlikehold, innebærer ikke viral pålagt cellelyse, og gir et middel for å bedre studere cellulært handelen under proteinsyntesen 7, 8, 9, 10.
Denne protokollen beskriver den hurtige dannelse av ekspresjonsvektorer ved bruk av to-trinns overlappforlengelse-PCR (OE-PCR) <sup class = "ekstern referanse"> 11 og standard kloning av plasmid-DNA i Escherichia coli. Plasmider blir brukt til å transfektere dobbelt kommersielt tilgjengelige dyrkede insektceller og for å fremstille representative proteiner. Protokollen beskriver fremstilling og bruk av to forskjellige fluoresceinmerkede subcellulære markørproteiner og demonstrerer colocalization med to aquaporin proteiner fra det insekt Bemisia tabaci. Følgende protokoll gir grunnleggende metodikk for OE-PCR, insektcelle vedlikehold og transfeksjon, og fluorescens mikroskopi for den cellulære lokalisering av målproteiner.
Heterologe protein ekspresjonssystemer er viktige verktøy for produksjon av rekombinante proteiner som benyttes i tallrike anvendelser nedstrøms 4. Velge fra de ulike uttrykks systemer tilgjengelig, avhenger av det endelige målet for proteinet av interesse. Flere insektscelle-ekspresjonssystemer er tilgjengelige som gir bøyelige alternativer til prokaryote og eukaryote celleekspresjonsvektorer systemer 5, 6. Insektsystemer som krever …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Lynn Forlow-Jech og Dannialle LeRoy for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av basen CRIS midler til USDA ARS, National Program 304 – Crop Protection og karantene [Prosjekt # 2020-22620-022-00D] til JAF og JJH Omtale av varemerker eller kommersielle produkter i denne artikkelen er utelukkende for å gi spesifikk informasjon og innebærer ikke en anbefaling eller godkjenning av US Department of Agriculture. USDA er en lik mulighet leverandør og arbeidsgiver.
KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |