Nonlytic insektcelle-ekspressionssystemer er underudnyttet for produktion, celletrafik / lokalisering, og rekombinant protein funktionel analyse. Her beskriver vi metoder til at generere ekspressionsvektorer og efterfølgende forbigående proteinekspression i kommercielt tilgængelige lepidoptera cellelinier. Co-lokaliseringen af Bemisia tabaci aquaporiner med subcellulære fluorescerende markørproteiner er også præsenteret.
Heterologe proteinekspressionssystemer anvendes til fremstilling af rekombinante proteiner, fortolkningen af celletrafik / lokalisering, og bestemmelse af den biokemiske funktion af proteiner ved sub-organismeniveauet. Selvom baculovirusekspressionssystemer stigende grad anvendes til proteinproduktion i talrige bioteknologiske, farmaceutiske og industrielle anvendelser, nonlytic systemer, som ikke involverer virusinfektion har klare fordele, men ofte bliver overset og underudnyttet. Her beskriver vi en fremgangsmåde til frembringelse nonlytic ekspressionsvektorer og forbigående rekombinant proteinekspression. Denne protokol giver mulighed for effektiv cellulære lokalisering af rekombinante proteiner og kan anvendes til hurtigt at skelne protein handel i cellen. Vi viser ekspressionen af fire rekombinante proteiner i et kommercielt tilgængeligt insektcellelinie, herunder to aquaporin proteiner fra insektet Bemisia tabaci, samtsom subcellulære markørproteiner specifikke for celleplasmamembranen og for intracellulære lysosomer. Alle rekombinante proteiner blev fremstillet som kimærer med fluorescerende proteinmarkører på deres carboxyltermini, hvilket tillader direkte påvisning af de rekombinante proteiner. Den dobbelte transfektion af celler med plasmider, der huser konstrukter for generne af interesse og en kendt subcellulær markør muliggør levende celler og forbedret validering af celleprotein lokalisering.
Fremstilling af rekombinante proteiner under anvendelse af insekt-ekspressionssystemer giver mange fordele for studiet af eukaryote proteiner. Nemlig, insektceller besidder lignende post-translationelle modifikationer, forarbejdning og sortering mekanismer som de der findes i pattedyrceller, hvilket er fordelagtigt til fremstilling af korrekt foldede proteiner 1, 2, 3. Insektcellesystemer også typisk kræver færre ressourcer og mindre tid og indsats til vedligeholdelse end pattedyrcellelinier 4, 5. Baculovirusekspressionssystemet er en sådan insektcelle-baseret system, er nu almindeligt anvendt i mange discipliner, herunder produktion af rekombinante proteiner til protein karakterisering og terapeutiske midler, det immunogene præsentation af fremmede peptider og virale proteiner til fremstilling af vaccine, syntesen af multi Proteinkoncentrater komplekser, Produktion af glycosylerede proteiner, osv. 1, 2, 4, 6. Der er imidlertid situationer, hvor baculovirus ekspression kan ikke være relevant 3, 7, og anvendelsen af nonlytic og forbigående insekt ekspressionssystemer kan være mere passende. Specifikt forbigående insektcelleekspression giver mulighed for hurtig syntese af rekombinant protein, kræver mindre udvikling og vedligeholdelse, ikke involverer viral pålagt cellelysis og tilvejebringer et middel til bedre at studere cellulær handel under proteinsyntese 7, 8, 9, 10.
Denne protokol beskriver en hurtig generering af ekspressionsvektorer under anvendelse af to-trins overlap-PCR (OE-PCR) <sup class = "xref"> 11 og standard kloning af plasmid-DNA i Escherichia coli. Plasmider anvendes til dobbelt-transfektion kommercielt tilgængelige dyrkede insektceller og frembringe repræsentative proteiner. Protokollen beskriver fremstillingen og anvendelsen af to forskellige fluorescerende mærkede subcellulære markørproteiner og demonstrerer colokalisering med to aquaporin proteiner fra insektet Bemisia tabaci. Den følgende protokol giver den grundlæggende metode for OE-PCR, insektcelle vedligeholdelse og transfektion, og fluorescensmikroskopi for den cellulære lokalisering af målproteiner.
Heterologe proteinekspressionssystemer er vigtige værktøjer til fremstilling af rekombinante proteiner anvendt i talrige efterfølgende anvendelser 4. Vælge fra de forskellige ekspressionssystemer tilgængelige, afhænger af det endelige mål for proteinet af interesse. Adskillige insekt celle ekspressionssystemer er tilgængelige, der tilbyder fleksible alternativer til prokaryote og eukaryote celle ekspressionssystemer 5, 6. Insekt s…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Lynn Forlow-Jech og Dannialle LeRoy til teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af basen CRIS finansiering til USDA ARS, nationale program 304 – Crop Protection og karantæne [Projekt # 2020-22620-022-00D] til JAF og JJH Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne artikel er udelukkende med det formål at give specifikke oplysninger og er ikke ensbetydende med anbefaling eller godkendelse af US Department of Agriculture. USDA er en lige muligheder udbyder og arbejdsgiver.
KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |