Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Transient ekspression og Cellulær Lokalisering af rekombinante proteiner i dyrkede insektceller

doi: 10.3791/55756 Published: April 20, 2017

Summary

Nonlytic insektcelle-ekspressionssystemer er underudnyttet for produktion, celletrafik / lokalisering, og rekombinant protein funktionel analyse. Her beskriver vi metoder til at generere ekspressionsvektorer og efterfølgende forbigående proteinekspression i kommercielt tilgængelige lepidoptera cellelinier. Co-lokaliseringen af Bemisia tabaci aquaporiner med subcellulære fluorescerende markørproteiner er også præsenteret.

Abstract

Heterologe proteinekspressionssystemer anvendes til fremstilling af rekombinante proteiner, fortolkningen af ​​celletrafik / lokalisering, og bestemmelse af den biokemiske funktion af proteiner ved sub-organismeniveauet. Selvom baculovirusekspressionssystemer stigende grad anvendes til proteinproduktion i talrige bioteknologiske, farmaceutiske og industrielle anvendelser, nonlytic systemer, som ikke involverer virusinfektion har klare fordele, men ofte bliver overset og underudnyttet. Her beskriver vi en fremgangsmåde til frembringelse nonlytic ekspressionsvektorer og forbigående rekombinant proteinekspression. Denne protokol giver mulighed for effektiv cellulære lokalisering af rekombinante proteiner og kan anvendes til hurtigt at skelne protein handel i cellen. Vi viser ekspressionen af fire rekombinante proteiner i et kommercielt tilgængeligt insektcellelinie, herunder to aquaporin proteiner fra insektet Bemisia tabaci, samtsom subcellulære markørproteiner specifikke for celleplasmamembranen og for intracellulære lysosomer. Alle rekombinante proteiner blev fremstillet som kimærer med fluorescerende proteinmarkører på deres carboxyltermini, hvilket tillader direkte påvisning af de rekombinante proteiner. Den dobbelte transfektion af celler med plasmider, der huser konstrukter for generne af interesse og en kendt subcellulær markør muliggør levende celler og forbedret validering af celleprotein lokalisering.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fremstilling af rekombinante proteiner under anvendelse af insekt-ekspressionssystemer giver mange fordele for studiet af eukaryote proteiner. Nemlig, insektceller besidder lignende post-translationelle modifikationer, forarbejdning og sortering mekanismer som de der findes i pattedyrceller, hvilket er fordelagtigt til fremstilling af korrekt foldede proteiner 1, 2, 3. Insektcellesystemer også typisk kræver færre ressourcer og mindre tid og indsats til vedligeholdelse end pattedyrcellelinier 4, 5. Baculovirusekspressionssystemet er en sådan insektcelle-baseret system, er nu almindeligt anvendt i mange discipliner, herunder produktion af rekombinante proteiner til protein karakterisering og terapeutiske midler, det immunogene præsentation af fremmede peptider og virale proteiner til fremstilling af vaccine, syntesen af ​​multi Proteinkoncentrater komplekser, Produktion af glycosylerede proteiner, osv. 1, 2, 4, 6. Der er imidlertid situationer, hvor baculovirus ekspression kan ikke være relevant 3, 7, og anvendelsen af nonlytic og forbigående insekt ekspressionssystemer kan være mere passende. Specifikt forbigående insektcelleekspression giver mulighed for hurtig syntese af rekombinant protein, kræver mindre udvikling og vedligeholdelse, ikke involverer viral pålagt cellelysis og tilvejebringer et middel til bedre at studere cellulær handel under proteinsyntese 7, 8, 9, 10.

Denne protokol beskriver en hurtig generering af ekspressionsvektorer under anvendelse af to-trins overlap-PCR (OE-PCR) Escherichia coli. Plasmider anvendes til dobbelt-transfektion kommercielt tilgængelige dyrkede insektceller og frembringe repræsentative proteiner. Protokollen beskriver fremstillingen og anvendelsen af to forskellige fluorescerende mærkede subcellulære markørproteiner og demonstrerer colokalisering med to aquaporin proteiner fra insektet Bemisia tabaci. Den følgende protokol giver den grundlæggende metode for OE-PCR, insektcelle vedligeholdelse og transfektion, og fluorescensmikroskopi for den cellulære lokalisering af målproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. OE-PCR for Konstruktion af ekspressionsplasmider

Bemærk: Se tabel 1 for alle primere anvendt i OE-PCR. Det anbefales at bruge af en high-fidelity DNA-polymerase for alle forstærkninger. Men fordi disse enzymer ofte ikke forlader en 3'A, er det nødvendigt at udføre en kort, ikke-amplificering inkubation med et Taq-DNA-polymerase til 'A-hale' PCR-produkterne før kloning dem i en TA insektcelleekspression vektor. Denne protokol viser en metode til at generere insekt ekspressionsplasmider huser kimære proteiner, med de fluorescerende proteiner fusioneret i ramme til carboxylterminalen af generne af interesse (i dette tilfælde, at to Bemisia tabaci aquaporinproteiner) eller subcellulære markørproteiner (figur 1).

  1. Bruge OE-PCR, som består af to uafhængige amplifikationsrunder, at generere: (1) sekvenser, der koder generne af interesse (B. tabaciaquaporin 1: BtDrip1; B. tabaci aquaporin 2: BtDrip2_v1) fusioneret i ramme med et grønt fluorescerende protein-variant kaldet EGFP eller (2) de subcellulære markører (Drosophila melanogaster sex-peptid-receptor: DmSPR; Homo sapiens phospholipase A2: HsPLA2) med mCherry kodende sekvens. Direkte ligere de endelige OE-PCR-produkter ind i PIB / V5-His-TA plasmid.
    1. For den første runde af OE-PCR (angivet med AD og A'-D' i figur 1), anvendes en gen-specifik sense-primer (vist med fed skrift i tabel 1) og et kimært antisense-primer (kursiv i tabel 1) svarende til den endelige 15 bp (uden stopkodonen) af genet af interesse / subcellulær markør og til 15 bp af 5'-enden af ​​det ønskede fluorescerende protein (EGFP eller mCherry) for at danne et produkt med en 3'-overhæng.
      Bemærk: Se tabel 2 for PCR-forhold.
    2. I et separat rør, anvendes en gen-specific fluorescerende protein antisense-primer (vist med understregning i tabel 1) og et kimært sense primer, der indeholder 15 bp fra 3'-enden af genet af interesse / subcellulær markør og 15 bp fra 5'-enden af det ønskede fluorescerende protein at frembringe et produkt med et 5'-overhæng.
      Bemærk: Se tabel 2 for de PCR-betingelserne. PCR skabelon kan enten være en sekvens-valideret PCR-produkt eller, mere fortrinsvis, plasmid-DNA, der huser den ønskede sekvens. Den her beskrevne undersøgelse anvender sekvensspecifikke valideret plasmider.
    3. Adskille PCR-produkterne med 1% agarosegelelektroforese (anvendelse af standard molekylær-grade agarose).
    4. Punktafgifter og oprense produkter af de forventede størrelser (se tabel 2) anvendelse af et kommercielt tilgængeligt DNA gelekstraktionskit (se tabellen af materialer til den specifikke kit anvendt i denne protokol).
    5. Brug geloprensede PCR-produkter fra trin 1.1.4 at generere den endelige overlap eXtension produkter (angivet ved A '' - D '' i figur 1). Brug en genspecifik senseprimer for genet af interesse / subcellulær markør og det tilsvarende gen-specifik antisense-primer for det fluorescerende protein til at generere den ønskede kimære sekvens.
      Bemærk: Se tabel 2 for de PCR-betingelserne. Det kan være nødvendigt at empirisk bestemme de optimale mængder af første runde overlap forlængelsesprodukter at tilføje til reaktionsblandingen for at give det endelige, fuldlængde kimære PCR-produkt.
    6. Adskille de anden runde OE-PCR produkter af 1% agarosegelelektroforese. Punktafgifter og renses produkterne anvendelse af et kommercielt tilgængeligt DNA gelekstraktionskit.
    7. Inkubere geloprensede anden runde OE-PCR-produkter med 1 enhed Taq-DNA-polymerase mastermix i 10 minutter ved 72 ° C for at danne 3'- adenylerede (dvs. A-tailed) produkter, der er nødvendige for TA kloning.
    8. Ligere de resulterende adenylerede produkteri PIB ekspressionsvektoren og bruge standard molekylære kloningsteknikker at omdanne kemisk kompetente (varmechok) eller elektrokompetente (elektroporation) Escherichia coli-celler. Plade natten over på medium indeholdende den passende selektionsmarkør (dvs. ampicillin eller carbenicillin).
    9. Udføre koloni-PCR 12 under anvendelse af en vektor-specifik primer og en indsats primer til identifikation insert-positive kolonier, der er blevet transformeret med ekspressionsplasmider der huser en indsats i 5'-3'-orientering. Forberede overnatskulturer af kolonier genererer PCR-produkter af de forventede størrelser.
    10. Isoler plasmid DNA under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt DNA-oprensning kit i overensstemmelse med producentens anvisninger (se Materialer Tabel til den specifikke kit anvendt i denne protokol). Validere sekvensen integritet hver indsats ved direkte DNA-sekventering.

Bemærk: For at opretholde sterile betingelser, udføre alle cellemanipulationer kræver åbning af vævsdyrkningskolben inden laminar udsugning. Tænd for laminært flow UV bakteriedræbende lampe mindst 1 time før cellemanipulationer. Slid nitril og dekontaminere overfladen af ​​bænk, pipetter, redskaber, rør, og kolber med 70% ethanol før deres anvendelse. Kendskab til grundlæggende celledyrkningsteknikker anbefales 13.

  1. Bruge TNI celler (en etableret cellekultur line afledt af Trichoplusia ni ovarievæv), der er tilpasset til serumfrit medium og vedligeholde dem som en adhærent monolagskultur i serumfrit insektmedium ved 28 ° C i T25 vævskulturflasker.
  2. Opretholde Sf9-celler (en etableret cellekultur linje afledt af Spodoptera frugiperda ovarievæv) På lignende men ved anvendelse af TNM-FH insekt dyrkningsmedium supplemented med 10% kalvefosterserum (FBS).
  3. Pode indledende kultur fra frosne Sf9 eller TNI celler ved at fjerne stock hætteglas fra -80 ° C og lade dem tø i et 37 ° C vandbad. Dekontaminerer hætteglas med 70% ethanol efter optøning og placere dem på is.
  4. Tilsæt 4 ml insektcelle medium til en ny T25 kolbe og overførsel 1 ml af den optøede insektcelle suspension. Kolben anbringes i et 28 ° C, ikke-befugtet inkubator og tillade cellerne at vedhæfte i 30-45 min.
  5. Erstatte seeding medium med 5 ml af den passende medium og overføre kolberne til en 28 ° C ikke-befugtet inkubator. Overvåg celle sammenløbet dagligt. Passage cellerne, når de når 90% sammenflydning.
    Bemærk: Komplet dækning af T25-kolbe svarer til ~ 5 x 10 6 celler.
  6. Insektcelle passage.
    1. Til passage af cellerne, først fjerne opbrugt medium fra kolben indeholdende konfluente celler under anvendelse af en steril 5 ml serologisk pipette.kolben vippe således at mediet strømmer til et hjørne, væk fra cellemonolaget. Fjern forsigtigt mediet under anvendelse af en pipette uden at forstyrre cellerne.
    2. Løsne TNI celler ved forsigtigt at skylle T25-kolber indeholdende konfluent monolag med 4 ml serumfrit insektmedium anvendelse ny, steril, 5 ml serologisk pipette. Bevæge pipettespidsen tværs kolben og langsomt overrisle for at fjerne celler løst bundne til kolben bund.
      1. Check for en tilstrækkelig frigørelse af celler ved at fjerne alle medier, dreje kolben i løbet, og observere, at bunden af ​​kolben er klar.
    3. For Sf9-celler, som klæber mere stramt, tilsættes 4 ml frisk TNM-FH-medium og bruge en celleskraber for at løsne de vedhæftede celler. Brug en 5 ml serologisk pipette til forsigtigt blandes og reducere celle sammenklumpning.
    4. Anvende en automatiseret celletæller at estimere antallet af levedygtige insekt- celler pr volumen af ​​medium. Overfør 0,1 ml celle / medium blanding til en 1,5-mlmikrofugerør. I en separat 0,5 ml mikrocentrifugeglas, tilsættes 10 pi celle / medium-blanding til 10 pi af trypanblåt.
    5. Fjerne en celletæller kammer slide ud af emballagen og der tilsættes 10 pi af celle / medium / trypanblåt blanding til hver side af optællingen slide. Sæt objektglasset i cellen tæller og bestemme celletætheden og levedygtighed.
    6. Anvendelse celletætheden, beregne og tilføje den korrekte volumen af ​​insektcelle-medium (op til 5 ml) til nye, sterile T25-kolber.
    7. Overfør ca. 1-1,5 x 10 6 celler til T25-flasker med friske medier; mærke kolberne med cellelinien, dato, medium, antal celler tilsat, og passage nummer (Pn + 1 generation, hvor Pn er passagen tal for den tidligere generation af celler); og kolberne anbringes i et 28 ° C inkubator i op til 72 timer.
      Bemærk: Insektceller kontinuerligt kan opformeres, selvom celler kan være mindre modtagelig for transfektion og / eller heterologproteinekspression efter 30 passager. Behandle alle kasserede celler / medier med 10% blegemiddelopløsning og autoklaveres engangs plast ware inden bortskaffelse.

3. Insect Cell transfektion

  1. Seed en T25 kolbe med op til 1 x 10 6 TNI eller Sf9-celler i et passende insektcelle-medium (serumfrit insektmedium for TNI og TNM-FH for Sf9) og vokse til konfluens i 72 timer ved 28 ° C.
  2. Fjern og kassér gamle medium og løsne cellerne med 4 ml frisk serumfrit insektmedium (se trin 2.6.2 og 2.6.3, ovenfor).
  3. Estimere celledensiteten anvendelse af en automatiseret celletæller (se trin 2.6.4, ovenfor).
  4. Der tilsættes ca. 7 x 10 5 celler til individuelle 35 mm glas-bund skåle og tillade cellerne at binde i 20-25 min ved 28 ° C.
  5. For hver transfektion, tilsættes 2 ug plasmid-DNA (enten fra ét plasmid for enkelt transfektioner eller 2 ug fra hver af de to plasmider til dojlfin transfektioner) til 0,1 ml serumfrit insektmedium (uden FBS i både Sf9 og TNI transfektioner) i en steril 1,5 ml mikrofugerør.
  6. I et separat rør, blandes 8 pi transfektionsreagens med 0,1 ml serumfrit insektmedium og derefter overføre denne løsning til røret indeholdende plasmid-DNA af interesse. Let vortexes og inkuberes ved stuetemperatur i 20 - 30 min.
  7. Fortynde plasmid-transfektionsblandingen fra trin 3.5 og 3.6 med 0,8 ml serumfrit insektmedium således at det samlede volumen er lig med 1 ml.
  8. omhyggeligt fjerne mediet fra glas skåle indeholdende vedhæftede celler. Overlay de vedhæftede celler med den fortyndede plasmid-transfektion medium.
  9. Inkubere cellerne ved 28 ° C i 5 timer.
    Bemærk: Betingelserne for transfektion kræver empirisk optimering for maksimal transfektionseffektivitet (for eksempel natten over transfektion snarere end 5 timer, mængden af plasmid DNA anvendt, kemien i transfektionsreagensbrugte, osv.).
  10. Fjern og kassér transfektionsmediet og forsigtigt vaske cellerne med 1 ml serumfrit insektmedium, pas på ikke at fjerne celler.
  11. Tilsæt 2 ml frisk insektcelle-medium (serumfrit insektmedium for TNI og TNM-FH for Sf9) og inkuber ved 28 ° C i 48-72 timer.
    Bemærk: Igen betingelser kræver empirisk optimering for maksimal heterolog proteinekspression.

4. Konfokal fluorescensmikroskopi

  1. Ved 48-72 timer efter transfektion vaskes cellerne en gang med 1 ml IPL-41 insektmedium og derefter dække med 2 ml IPL-41 til billeddannelse.
    Bemærk: Denne vasketrin reducerer baggrunden automatisk fluorescens observeret med insektcelle medium anvendes i normal celle vedligeholdelse.
  2. Tilføj 4 dråber Hoechst levende cellefarvning reagens (se tabellen af ​​materialer til den specifikke nukleare pletten anvendes i denne protokol) til mediet og inkuberes ved 28 ° C i 20-25 min.
    Bemærk: Yderligere nucLear pletter kan være substitueret, selvom farvestoffet bør have en fluorescensprofilen unikt fra EGFP og mCherry.
  3. Placer en 35 mm skål i den selv-indesluttet laser scanning konfokal mikroskop (se tabellen af ​​materialer til den specifikke instrument, der anvendes i denne protokol).
  4. Juster mikroskop til Hoechst, EGFP, og mCherry observation betingelser: Hoechst excitation / emission - 359/461 nm; EGFP excitation / emission - 489/510 nm; mCherry excitation / emission - 580/610 nm.
  5. Foretage en indledende scanning via en 10x objektiv at bekræfte fluorescerende ekspression og derefter skifte til skanderingsmåde anvendelse af en 60X fasekontrast vand-immersionsobjektiv.
  6. Juster lasereffekten (5-7%), detektorfølsomheden (47-49%), scanningshastighed, Z-aksen dybde, og digital zoom at optimere billedet kontrast og opløsning. Billede cellerne ved 1,5 x digital zoom til at give i alt 90X forstærkning.
    Bemærk: Mikroskop parametre kræver empirisk justering for optimalbilledsamling og kan være specifik for instrumentet i brug.
  7. Eksporter de rå data som TIFF billedfiler og ændre (afgrøde og overlay) til figur generation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OE-PCR

OE-PCR tillader syntese af kimære DNA-produkter, som, når indsat i en ekspressionsvektor, tillader fremstilling af rekombinante kimære proteiner, der svarer til en hvilken som helst test genet af interesse og fluorescerende markørprotein. Figur 1 viser et generelt skema til fremstilling af PIB ekspressionsvektorer indeholdende B. tabaci aquaporin-kodende sekvenser (BtDrip1 og BtDrip2_v1) i ramme med det fluorescerende protein markør EGFP. I dette scenario blev to BtDrip kimære proteiner indeholdende EGFP ved deres carboxyl termini produceret. Denne protokol også demonstreret metoder til udvikling to insekt subcellulære markørproteiner, DmSPR og PLA2G15 (figur 1), fremstillet som kimærer med mCherry på deres carboxyltermini. EGFP og mCherry blev valgt, fordi deres emissionsspektre er tilstrækkeligt divergent, giver mulighed for than uafhængig detektering og co-lokalisering af signaler fra testproteinerne (f.eks., BtDrip-EGFP) og DmSPR- og PLA2G15-mCherry-mærkede markørproteiner. Alle PCR-reaktioner fremstillet bånd af de forventede størrelser og lykkedes klonet i PIB. Alle plasmider blev bekræftet ved DNA-sekventering til at indeholde de tilsvarende indsatser i den korrekte orientering og i ramme med fluorescerende proteinmarkører.

Forbigående rekombinant protein ekspression i insektcellekultur

Efter konstruktionen af ​​ekspressionsvektorer, der svarer til PIB / BtDrip1-EGFP, PIB / BtDrip2_v1-EGFP, PIB / DmSPR-mCherry, og PIB / PLA2G15-mCherry blev celler transficeret og ekspression af rekombinante proteiner i levende celler blev visualiseret under anvendelse af konfokal fluorescens mikroskopi (figur 2). Succesfuld transfektion og ekspression af rekombinant BtDrip1-EGFP er indlysende by tilstedeværelsen af grøn fluorescens på overfladen af TNI celler (figur 2B, 2F). Grøn fluorescens observeret inden TNI celler transficeret med BtDrip2_v1-EGFP (figur 2J, 2 N), hvilket indikerer den intracellulære ekspression af BtDrip2_v1. Ligeledes TNI celler transficeret med PIB / DmSPR-mCherry (figur 2C, 2K) eller PIB / PLA2G15-mCherry (figur 2G, 2O) viser rød fluorescens, hvilket indikerer ekspressionen af de respektive kimærer.

Co-lokalisering af rekombinante BtDrip proteiner og subcellulære markører

Den dobbelte transfektion af TNI celler muliggør co-ekspression af to fluorescensmærkede proteiner. Overlejrede billeder af transficerede TNI celler, som er orange / gul indikerer, at celler huser plasmider, som producerer både EGFP og mCherry og antyder, at proteinerne co-lokaliseret i samme subcellular strukturer (figur 2D, 2H, 2L & 2P). Dette bekræfter tidligere resultater, som BtDrip1 og DmSPR udtrykkes på celleoverfladen 14, 15, 16. En overlejring af TNI celler dobbelt-transficeret med PIB / BtDrip1-EGFP og PIB / DmSPR-mCherry viser overlapning af de grønne og røde fluorescenssignaler (figur 2D), hvilket antyder co-lokalisering af BtDrip1-EGFP og DmSPR-mCherry på celleoverfladen . Tidligere Maroniche et al. 17 viste, at PLA2G15 er en markør for intercellulære lysosomer, når de udtrykkes i Sf9-celler som en kimære med mCherry. Selv om det blev forudsagt at det rekombinante BtDrip2_v1-EGFP-proteinet ville translokere til celleoverfladen, blev det tidligere vist, at det kimære protein primært var lokaliseret intracellulært inden transficerede TNI celler 15. Til støtte for dette, der var lidt evidENCE for co-lokalisering af grønne og røde fluorescerende signaler når BtDrip2_v1-EGFP blev co-udtrykt med PIB / DmSPR-mCherry (figur 2L). I modsætning hertil co-ekspression af PIB / BtDrip2_v1-EGFP og PIB / PLA2G15-mCherry resulterede i en væsentlig overlapning i de cytoplasmatiske grønne og røde fluorescerende signaler (Figur 2P), hvilket kraftigt antyder, at BtDrip2_v1 sandsynligvis er handles til intracellulære lysosomer.

figur 1
Figur 1: Skematisk for Building ekspressionskonstruktioner ved hjælp overlap-PCR (OE-PCR). OE-PCR anvendes til at bygge PIB ekspressionsvektorer indeholdende Bemisia tabaci aquaporin-1 / EGFP (BtDrip1-EGFP), B. tabaci aquaporin-2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1-EGFP), Drosophila melanogaster sex peptid receptor / mCherry (DmSPR- mCherry), og Homo sapiens phospholipase-A2 / mCherry(HsPLA2G15-mCherry) produkter. Den første runde af OE-PCR genererer fragmenter svarende til fuld længde cDNA'er af interesse, BtDrip1 (A), BtDrip2_v1 (B), DmSPR (C), og HsPLA2G15 (D), indeholdende en lille 3'overlappende område svarende til 5'-enden af ​​enten EGFP eller mCherry fluorescerende markørproteiner. Samtidigt, fuld længde cDNA'er fra EGFP og mCherry er PCR amplificeret og indeholde en lille 5'overlappende region svarende til 3'-enderne af BtDrip1 (A '), BtDrip2_v1 (B'), DmSPR (C'), eller HsPLA2G15 ( D'). Bemærk, at alle primerne anvendt til at amplificere cDNA'er af interesse (dvs. BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR, og HsPLA2G15) i den første runde af OE-PCR mangler stopkodonet normalt findes ved 3'-enden af hver kodende sekvens. Alle første runde OE-PCR-produkter amplificeres, separeret ved agarosegel udvalgterophoresis, og geloprenset. Den anden runde af OE-PCR anvender poolede par af geloprensede PCR-produkter fra den første runde af OE-PCR som templates til amplifikationen af ​​fuldlængde kimære produkter. For hver reaktion, sense primeren svarer til 5'-enden af cDNA'et af interesse kodende sekvenser og antisense-primeren er komplementær til 3'-enden af EGFP eller mCherry, med dens stopcodon intakte (A ', B' 'C'' og D ''). De fire anden runde OE-PCR-produkter er geloprenset, adenyleret med Taq-polymerase, og ligeret ind i PIB / V5-His ekspressionsvektor. Plasmider er opformeret i E. coli, og oprenset plasmid-DNA anvendes til at transficere insektceller. B. tabaci aquaporiner BtDrip1 og BtDrip2_v1 er vist i mørkeblå og cyan henholdsvis og subcellulære markører DmSPR og PLA2G15 er vist i orange og lyserød hhv. EGFP er shegne i grøn og mCherry er i rødt. Farvede pile viser retningen (sense-primere i fremadgående retning og antisense primere i modsat retning) og placering af genspecifikke primere (farven af ​​en primer indikerer kilden til primersekvensen). Se tabel 1 for primer detaljer. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2: Levende Billeddannelse af dobbelt--transficerede TNI celler, der udtrykker rekombinant BtDrip1-EGFP, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry, og PLA2G15-mCherry proteiner. Trichoplusia ni (TNI) -celler blev dobbelt-transficeret med PIB / BtDrip1-EGFP og PIB / DmSPR-mCherry (AD), PIB / BtDrip1-EGFP og PIB / PLA2G15-mCherry (EH), PIB / BtDrip2_v1-EGFP og PIB / DmSPR -mCherry (<strong> IL), eller PIB / BtDrip2_v1-EGFP og PIB / PLA2G15-mCherry (MP). Billeder blev taget med en laser konfokalt anvendelse af en 60X fasekontrast vand-immersionsobjektiv (NA 1.2) ved 90X amplifikation. Hoechst paneler viser repræsentative levende celle billeder af farvede cellekerner (ex / em = 359/461 nm). De EGFP paneler viser fluorescensen ekspression af celler transficeret med EGFP kimærer (ex / em = 489/510 nm). De mCherry paneler viser fluorescensen ekspression af celler transficeret med mCherry kimærer (ex / em = 580/610 nm). Flettepanelet viser overlejringen af alle tre fluorescerende kanaler (dvs. Hoechst, EGFP, og mCherry). Skalasøjle = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Heterologe proteinekspressionssystemer er vigtige værktøjer til fremstilling af rekombinante proteiner anvendt i talrige efterfølgende anvendelser 4. Vælge fra de forskellige ekspressionssystemer tilgængelige, afhænger af det endelige mål for proteinet af interesse. Adskillige insekt celle ekspressionssystemer er tilgængelige, der tilbyder fleksible alternativer til prokaryote og eukaryote celle ekspressionssystemer 5, 6. Insekt systemer, der kræver baculovirusinfektion at drive proteinekspression er langt den mest populære og udbredte insektsystem, med mange sådanne proteiner, der anvendes i forskning og terapeutiske anvendelser 1, 2, 3. Baculovirusekspression imidlertid, har begrænsninger, herunder: 1) den virale livscyklus involverer lyse af værtscellen; 2) værtscellerne, der lyserede frigiver typisk høj amounts af nedbrydende enzymer; 3) generering af stabile cellelinjer er tidskrævende og kan ikke være muligt for cytotoksiske proteiner; 4) diskontinuerlig ekspression kræver hyppig vedligeholdelse; 5) vektor generation kræver ofte multiple kloningstrin; 6) insekt celledensiteter ofte er omvendt proportional med virusinfektion; og 7) rekombinante proteiner er primært trafikerede ved høje niveauer til celleoverfladen eller udskilles 3, 7, 9, 10. Nonlytic transient genekspression baseret på insektcelle transfektion med plasmid-DNA tilbyder en alternativ teknik til produktion af rekombinante proteiner, uden nogle af de unikke udfordringer forbundet med baculovira 7, 8. Nemlig forbigående insektcelleekspression tilbyder kortere turn-around på vektorkonstruktion og proteinsyntese, undgår challeng es forbundet med virusinfektion og cellelyse, og giver en robust middel til at observere celletrafik af proteiner.

Her blev to validerede ekspressionskonstruktioner anvendes til at bestemme den subcellulære lokalisering af B. tabaci aquaporinproteiner BtDrip1 og BtDrip2_v1. DmSPR-mCherry er en markør for plasma cellemembranen 16, og PLA2G15-mCherry lokaliseres inden cellulære lysosomer 17. Figur 2 viser værdien af disse markører til vurdering placeringerne af proteiner af interesse, i dette tilfælde, co-lokaliseringen af BtDrip1-EGFP med DmSPR-mCherry på celleoverfladen og BtDrip2_v1-EGFP med PLA2G15-mCherry inden lysosomer. Derfor, som vist her og i tidligere undersøgelser 14, 15, 16, 18, 19,ass = "xref"> 20, kan denne metode anvendes til hurtigt at fastslå protein handel inden insektceller. Selvom proteinekspression og handel inden TNI celler er vist her (figur 2), er det vigtigt at bemærke, at protokollen kan optimeres og anvendes lige godt til andre insektcellelinier (Sf9, Sf21, BM-N, S2 osv) .

Som alle heterologe protein ekspressionssystemer, der er begrænsninger for forbigående proteinproduktion inden dyrkede insektceller. Nemlig procentdelen af ​​celler positive for plasmid-afledte udtryk er typisk lavere end den, der opnås fra baculovirus eller i at anvende stabile cellelinjer. Således er mængden af ​​rekombinant protein (er) fremstilles, kan være lavere i et transient system imidlertid kan anvendelsen af forskellige promotorer og inkorporeringen af genetiske enhancere overvinde denne potentielle begrænsning 7, 21, 22. Thans protokol viser co-transfektion af TNI celler med to PIB vektorer, hver huser forskellige protein-kodende sekvenser (figur 2). Selvom lignende transfektionseffektiviteter blev observeret for alle fire ekspressionsvektorer der anvendes til at transficere TNI celler (data ikke vist), er dette ikke altid muligt. Derfor kan eksperimenter med sådanne transiente ekspressionsvektorer kræve omfattende empirisk optimering (f.eks variation i mængden af hver vektor, transfektion tid, transfektionsreagens kemi, etc.) at opnå ækvivalente transfektionseffektiviteter og / eller niveauer af rekombinant protein ekspression. Endvidere er det muligt, at tilsætning af et fluorescerende protein kan påvirke eller begrænse subcellulær handel med protein retter 23, 24. Identifikationen af ​​den subcellulære co-lokalisering af to proteiner ved observation af fluorescens med markørproteiner ikke necessarily indikerer direkte protein-protein interaktioner mellem proteinerne af interesse 24, 25. Derfor skal der udvises forsigtighed ved fortolkningen af ​​sådanne co-positionsbestemmelser.

Forbigående genekspression ikke tilbyde flere fordele i forhold aktuelt tilgængelige baculovirusekspressionssystemer. Transient ekspression kræver mindre tid og arbejdskraft til konstruktionen af ​​vektorer og til syntesen af ​​rekombinante proteiner, er forbigående ekspression ikke involverer cellelyse associeret med det patogene livscyklus baculovirus, og forbigående ekspression kan tilvejebringe en bedre undersøgelse system til subcellulære handel med proteiner 3, 7, 9. Denne protokol fremhæver den lethed og hastighed af bygning konstruktioner ved direkte inkorporering af et gen af interesse i PIB ekspressionsvektor under anvendelse overlap-PCR (figur 1 26. Selv EGFP 27 og mCherry 28 blev inkorporeret her ved carboxyl termini af to B. tabaci aquaporinproteiner kunne OE-PCR også anvendes til at placere mange andre variant fluorescerende markørproteiner 26 ved aminoterminalen af disse proteiner. Det er bemærkelsesværdigt, at der ud over talrige ekspressionsplasmider bygget under anvendelse af OE-PCR blev mange traditionelle ekspressionskioning kassetter fremstillet og kan anvendes til at producere næsten ethvert protein af interesse i ramme med de fluorescerende proteiner EGFP, Venus, og mCherry fusioneret ved enten amino- eller terminale ender. Sådanne ekspressionskassetter er tilgængelige efter anmodning.

Den æra af "genomics" har tilvejebragt en hidtil uset mængde af og adgang til meningsfuld dved en. Dog er forskellen fortsætter, at udvide mellem gen-opdagelse og tildeling af funktion til genprodukter; derfor, er yderligere empiriske værktøjer desperat behov for at accelerere funktionel genomik. Henviser, gen-redigering og andre in vivo gen-manipulation systemer kan i sidste ende give kvintessens tilgange for tildeling genfunktion, vil heterologe proteinekspressionssystemer sandsynligvis fortsat af betydning for biomanufacture af værdifulde proteiner og til dechifrering proteinstruktur og funktion. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til forøget konstruktion af ekspressionsplasmider og den forbigående ekspression af rekombinante proteiner i insektceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Lynn Forlow-Jech og Dannialle LeRoy til teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af basen CRIS finansiering til USDA ARS, nationale program 304 - Crop Protection og karantæne [Projekt # 2020-22620-022-00D] til JAF og JJH Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne artikel er udelukkende med det formål at give specifikke oplysninger og er ikke ensbetydende med anbefaling eller godkendelse af US Department of Agriculture. USDA er en lige muligheder udbyder og arbejdsgiver.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD DNA Polymerase EMD Millipore 71085-3 High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase TaKaRa-Clontech RR001B DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix Lucigen 30033-1 DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler Biometra/LABRepCo 070-851
Agarose LE Benchmark Scientific A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit EMD Millipore LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit ThermoFisher K89020 Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit Qiagen 27104
QIAcube Robotic Workstation Qiagen 9001292
Purifier Vertical Clean Bench Labconco 3970401
Tni cultured insect cell Line Allele Biotech ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line Allele Biotech ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium Allele Biotech ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium Allele Biotech ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium ThermoFisher 11405081
Cellfectin II Transfection Reagent ThermoFisher 10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers Sarstedt 83.1832 Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps Life Science Products CT-229331
Transfer Pipets Fisher 1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes Life Science Products CT-229475
PipetteBoy VWR 14222-180
5 mL Serological Pipettes Sarstedt 86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes Fisher 14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags Fisher 01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes Matsunami Glass D35-14-1.5-U 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E VWR 35823-961
Countess II FL Cell Counter ThermoFisher AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent ThermoFisher C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope Olympus FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA transOMIC Technologies TCH1303
pmCherry Vector Clontech 632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) ThermoFisher R37605

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, (5), 567-575 (2005).
  2. van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96, (1), 6-23 (2015).
  3. Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30, (1), 1-18 (2014).
  4. Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40, (1), 1-22 (2005).
  5. Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9, (3), 255-271 (2013).
  6. Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).
  7. Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
  8. Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88, (1), 134-142 (2013).
  9. Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
  10. Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6, (2), 189-194 (2005).
  11. Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12, (9), 653-657 (1998).
  12. Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9, (3), 1-6 (2008).
  13. Cell Culture Basics Handbook. ThermoFisher Scientific. Available from: http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0 (2014).
  14. Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41, (3), 178-190 (2011).
  15. Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
  16. Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23, (3), 301-319 (2014).
  17. Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20, (5), 675-685 (2011).
  18. Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81, (4), 179-198 (2012).
  19. Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3, (6), 1-12 (2012).
  20. Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
  21. Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
  22. Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
  23. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  24. Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
  25. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
  26. Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  27. Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, (5148), 802-805 (1994).
  28. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22, (12), 1567-1572 (2004).
Transient ekspression og Cellulær Lokalisering af rekombinante proteiner i dyrkede insektceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fabrick, J. A., Hull, J. J. Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells. J. Vis. Exp. (122), e55756, doi:10.3791/55756 (2017).More

Fabrick, J. A., Hull, J. J. Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells. J. Vis. Exp. (122), e55756, doi:10.3791/55756 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter