Nichtlysierende Insektenzellexpressionssysteme sind für die Produktion, Zellmigration / Lokalisierung und rekombinante Protein funktionelle Analyse nicht ausgelastet. Hier beschreiben wir Verfahren, Expressionsvektoren und nachfolgende transiente Proteinexpression in kommerziell erhältlichen Lepidoptera-Zelllinien zu erzeugen. Die Co-Lokalisierung von Bemisia tabaci aquaporins mit subzellulären fluoreszierenden Markerproteinen wird ebenfalls vorgestellt.
Heterologe Proteinexpressionssysteme sind für die Herstellung rekombinanter Proteine verwendet werden, die Interpretation von zellulärem Handel / Lokalisierung und die Bestimmung der biochemischen Funktion von Proteinen an der Unter organismal Ebene. Obwohl Baculovirus-Expressionssysteme werden zunehmend für die Proteinproduktion in zahlreichen biotechnologischen, pharmazeutischen und industriellen Anwendungen, nichtlysierende Systemen verwendet, die nicht virale Infektion haben klare Vorteile beinhalten sie sind aber oft übersehen und nicht ausgelastet. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Erzeugen nichtlysierende Expressionsvektoren und transiente Expression von rekombinantem Protein. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen und kann verwendet werden, um schnell den Proteintransport in der Zelle zu unterscheiden. Wir zeigen die Expression von vier rekombinanten Proteinen in einer handelsüblichen Insektenzelllinie, einschließlich zwei Aquaporin – Proteine aus dem Insekten Bemisia tabaci, sowieals subzellulären Markerproteine spezifisch für die Zellplasmamembran und für die intrazelluläre Lysosomen. Alle rekombinanten Proteine wurden als Chimären mit fluoreszierendem Protein-Marker an ihrer Carboxyltermini hergestellt, die für den direkten Nachweis der rekombinanten Proteine ermöglicht. Die Doppel-Transfektion von Zellen mit Plasmiden Konstrukten für die Gene von Interesse und einem bekannten subzellulären Marker ermöglicht lebende Zellen und eine verbesserte Validierung von zellulären Proteinlokalisierung beherbergen.
Die Herstellung von rekombinanten Proteinen Insektenzellexpressionssysteme bietet zahlreiche Vorteile für die Untersuchung von eukaryotischen Proteinen. Und zwar besitzen Insektenzellen ähnliche post-translationale Modifikationen, die Verarbeitung und Sortiermechanismen wie jene , die in Säugetierzellen, die zur Herstellung von korrekt gefalteten Proteinen 1, 2, 3 vorteilhaft sind. Insektenzellsysteme , auch benötigen in der Regel weniger Ressourcen und weniger Zeit und Aufwand für die Wartung als Säugetier-Zelllinien 4, 5. Das Baculovirus-Expressionssystem ist ein solches Insektenzell-basiertes System, das heute weit verbreitet in vielen Disziplinen verwendet wird, einschließlich der Herstellung von rekombinanten Proteinen für die Proteincharakterisierung und Therapeutika, die immunogene Präsentation von Fremdpeptiden und virale Proteine, die für die Impfstoffherstellung, die Synthese von mehr -Protein KomplexeDie Herstellung von glycosylierten Proteinen, etc. 1, 2, 4, 6. Es gibt jedoch Situationen , in denen von Baculovirus – Expressions nicht anwendbar sein , 3, 7, und die Verwendung von nichtlysierende und transienten Insektenexpressionssystemen kann besser geeignet sein. Insbesondere transiente Insektenzellexpressions die Möglichkeit zur schnellen Synthese von rekombinantem Protein bieten, weniger Entwicklung und Wartung erfordert, nicht viralen auferlegte Zelllyse beteiligt, und stellt ein Mittel besseren zellularen Handel während Proteins zu studieren Synthese 7, 8, 9, 10.
Dieses Protokoll beschreibt die schnelle Erzeugung von Expressionsvektoren unter Verwendung von Zweistufen-Überlappungsverlängerungs-PCR (OE-PCR) <sup class = "Xref"> 11 und die Standard – Klonierung von Plasmid – DNA in Escherichia coli. Plasmide sind doppelt transfizieren kommerziell erhältlichen gezüchteten Insektenzellen verwendet und repräsentative Proteine zu produzieren. Das Protokoll beschreibt die Herstellung und Verwendung von zwei verschiedenen fluoreszenzmarkierten subzellulären Markerproteinen und zeigt Kolokalisation mit zwei Aquaporin – Proteinen aus dem Insekten Bemisia tabaci. Das folgende Protokoll stellt die grundlegende Methodik für OE-PCR, Insektenzell Wartung und Transfektion und Fluoreszenzmikroskopie für die zelluläre Lokalisation von Zielproteinen.
Heterologe Proteinexpressionssysteme sind wichtige Werkzeuge für die Herstellung von rekombinanten Proteinen in zahlreichen Anwendungen eingesetzt Downstream 4. Die Auswahl aus den verschiedenen Expressionssystemen zur Verfügung, hängt vom Endziel für das Protein von Interesse. Mehr Insektenzellexpressionssysteme zur Verfügung , die flexible Alternativen zu pro- und eukaryotischen Zellexpressionssystemen 5, 6 bieten. Insektensysteme …
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Lynn Forlow-Jech und Dannialle LeRoy für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von Basis CRIS Finanzierung USDA ARS, Nationales Programm 304 unterstützt – Crop Protection and Quarantine [Projekt # 2020-22620-022-00D] JAF und JJH Die Erwähnung von Handelsnamen oder Handelsprodukten in diesem Artikel ausschließlich zum Zweck ist die Bereitstellung spezifische Information und stellen keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture implizieren. USDA eine Politik der Chancengleichheit Anbieter und Arbeitgeber.
KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |