Nonlytic sistemi di espressione di cellule di insetto sono sottoutilizzate per la produzione, il traffico cellulare / localizzazione, e analisi funzionale proteina ricombinante. Qui, descriviamo metodi per generare vettori di espressione e successiva espressione proteica transiente in cellule lepidotteri disponibili in commercio. La co-localizzazione di Bemisia tabaci acquaporine con proteine marker fluorescenti subcellulare è anche presentato.
Sistemi di espressione di proteine eterologhi vengono utilizzati per la produzione di proteine ricombinanti, l'interpretazione di cellulari traffico / localizzazione, e la determinazione della funzione biochimica delle proteine a livello sub-organismi. Sebbene i sistemi di espressione baculovirus sono sempre più utilizzati per la produzione di proteine in numerose biotecnologico, farmaceutico e applicazioni industriali, sistemi nonlytic che non coinvolgono infezione virale benefici evidenti ma sono spesso trascurati e sottoutilizzate. Qui, si descrive un metodo per la generazione di vettori di espressione nonlytic e l'espressione della proteina ricombinante transiente. Questo protocollo consente la localizzazione cellulare efficace delle proteine ricombinanti e può essere utilizzato per discernere rapidamente proteina trafficking all'interno della cellula. Mostriamo l'espressione di quattro proteine ricombinanti in cellule di insetto commercialmente disponibile, inclusi due proteine acquaporina dalla insetto Bemisia tabaci, nonchécome proteine marker subcellulari specifici per la membrana plasmatica delle cellule e per lisosomi intracellulari. Tutte le proteine ricombinanti sono state prodotte come chimere con marcatori proteici fluorescenti a loro termini carbossile, che consente la rilevazione diretta delle proteine ricombinanti. La doppia transfezione di cellule con plasmidi ospitare costrutti per i geni di interesse e di un marcatore subcellulare noto consente per l'imaging cellulare dal vivo e una migliore validazione di localizzazione delle proteine cellulari.
La produzione di proteine ricombinanti utilizzando sistemi di espressione di cellule di insetto offre numerosi vantaggi per lo studio delle proteine eucariotiche. Cioè, cellule di insetto possiedono simili modificazioni post-traduzionali, elaborazione e smistamento meccanismi come quelli presenti in cellule di mammifero, che è vantaggioso per la produzione di proteine correttamente ripiegate 1, 2, 3. Sistemi cellulari di insetto anche in genere richiedono meno risorse e meno tempo e fatica per la manutenzione di linee cellulari di mammiferi 4, 5. Il sistema di espressione baculovirus è uno di questi sistemi a base di cellule di insetto che è ora ampiamente utilizzato in molte discipline, compresa la produzione di proteine ricombinanti per la caratterizzazione delle proteine e terapie, la presentazione immunogenico di peptidi esteri e proteine virali per la produzione di vaccini, la sintesi di multi complessi -Concentrati, La produzione di proteine glicosilata, ecc. 1, 2, 4, 6. Esistono, tuttavia, situazioni in cui l'espressione baculovirus possono non essere applicabile 3, 7, e l'uso di sistemi di espressione insetti nonlytic e transitori può essere più appropriato. Specificamente, l'espressione cellulare di insetto transiente offre la possibilità per la rapida sintesi di proteina ricombinante, richiede meno sviluppo e manutenzione, non comporta lisi cellulare virale imposto, e fornisce un mezzo per studiare meglio il traffico cellulare durante la sintesi proteica 7, 8, 9, 10.
Questo protocollo descrive la rapida generazione di vettori di espressione usando due passaggi overlap extension PCR (OE-PCR) <sup class = "xref"> 11 e la clonazione standard DNA plasmidico in Escherichia coli. I plasmidi sono utilizzati per doppio trasfezione disponibili in commercio cellule di insetto coltivate e producono proteine rappresentativi. Il protocollo descrive la produzione e l'uso di due differenti proteine marker subcellulare fluorescenza marcata e dimostra colocalizzazione con due proteine acquaporina dalla insetto tabaci Bemisia. Il protocollo che segue fornisce la metodologia di base per OE-PCR, manutenzione insetto cellulare e trasfezione, e microscopia a fluorescenza per la localizzazione cellulare delle proteine target.
Sistemi di espressione di proteine eterologhe sono strumenti importanti per la produzione di proteine ricombinanti utilizzati in numerose applicazioni a valle 4. Scegliendo tra i diversi sistemi di espressione disponibili dipende l'obiettivo finale per la proteina di interesse. Diversi sistemi di espressione delle cellule di insetto sono disponibili che offrono alternative flessibili per sistemi di espressione delle cellule procariote ed eucariote 5, <sup cl…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Lynn Forlow-Jech e Dannialle LeRoy per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di base CRIS a USDA ARS, Programma Nazionale 304 – Crop Protection e la quarantena [del progetto # 2020-22620-022-00D] per JAF e JJH Menzione dei nomi commerciali o prodotti commerciali in questo articolo è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.
KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |