Nonlytic sistemas de expresión de células de insectos están infrautilizados para la producción, celular tráfico / localización, y el análisis funcional de proteínas recombinantes. A continuación, describimos métodos para generar vectores de expresión y la expresión de proteína transitoria posterior en líneas celulares de lepidópteros disponibles comercialmente. También se presenta la co-localización de las acuaporinas de Bemisia tabaci con proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares.
sistemas de expresión de proteína heteróloga se utilizan para la producción de proteínas recombinantes, la interpretación de celular tráfico / localización, y la determinación de la función bioquímica de las proteínas a nivel de sub-organismo. Aunque los sistemas de expresión de baculovirus se utilizan cada vez más para la producción de proteínas en numerosos biotecnológica, farmacéutica y aplicaciones industriales, sistemas nonlytic que no implican infección viral tiene evidentes ventajas, pero a menudo se pasa por alto y poco utilizados. A continuación, describimos un método para generar vectores de expresión nonlytic y expresión de la proteína recombinante transitoria. Este protocolo permite la localización celular eficiente de proteínas recombinantes y se puede utilizar para discernir rápidamente el tráfico de proteínas dentro de la célula. Mostramos la expresión de cuatro proteínas recombinantes en una línea de células de insecto disponibles comercialmente, incluyendo dos proteínas de acuaporina del insecto Bemisia tabaci, asícomo proteínas marcadoras subcelulares específicos para la membrana plasmática de la célula y para lisosomas intracelulares. Todas las proteínas recombinantes se produjeron como quimeras con marcadores de proteínas fluorescentes en sus extremos carboxilo, que permite la detección directa de las proteínas recombinantes. La doble transfección de células con plásmidos que albergan construcciones de los genes de interés y un marcador subcelular conocido permite para imágenes de células vivas y la mejora de validación de localización de la proteína celular.
La producción de proteínas recombinantes utilizando sistemas de expresión de células de insectos ofrece numerosos beneficios para el estudio de proteínas eucarióticas. A saber, células de insectos poseen modificaciones similares después de la traducción, procesamiento, y los mecanismos de clasificación como los presentes en células de mamífero, lo que es ventajoso para la producción de proteínas correctamente plegadas 1, 2, 3. Sistemas de células de insectos también típicamente requieren menos recursos y menos tiempo y esfuerzo para el mantenimiento de líneas celulares de mamífero 4, 5. El sistema de expresión de baculovirus es un sistema basado en células de insectos de tal manera que ahora se utiliza ampliamente en muchas disciplinas, incluyendo la producción de proteínas recombinantes para la caracterización de proteínas y la terapéutica, la presentación inmunogénico de péptidos extraños y las proteínas virales para la producción de vacunas, la síntesis de múltiples complejos proteínicas, La producción de proteínas glicosiladas, etc. 1, 2, 4, 6. Hay, sin embargo, situaciones en las que la expresión de baculovirus puede no ser aplicable 3, 7, y el uso de sistemas de expresión de insectos nonlytic y transitorios pueden ser más apropiados. Específicamente, la expresión de células de insecto transitoria ofrece la posibilidad para la rápida síntesis de proteína recombinante, requiere menos desarrollo y mantenimiento, no implica la lisis celular viral impuesta, y proporciona un medio para estudiar mejor tráfico celular durante la síntesis de 7, 8, 9 proteínas, 10.
Este protocolo describe la rápida generación de vectores de expresión utilizando extensión de solapamiento de dos etapas de PCR (OE-PCR) <sup class = "xref"> 11 y el estándar de clonación de ADN de plásmido en Escherichia coli. Los plásmidos se utilizan para doble transfectar células de insecto cultivadas comercialmente disponibles y para producir proteínas representativas. El protocolo describe la producción y el uso de dos proteínas marcadoras subcelular marcados con fluorescencia diferentes y demuestra colocalización con dos proteínas de acuaporina del insecto Bemisia tabaci. El siguiente protocolo proporciona la metodología básica para OE-PCR, insecto mantenimiento de las células y la transfección, y microscopía de fluorescencia para la localización celular de proteínas diana.
Sistemas de expresión de proteínas heterólogas son herramientas importantes para la producción de proteínas recombinantes utilizadas en numerosas aplicaciones aguas abajo 4. La elección de los diversos sistemas de expresión disponibles depende del objetivo final de la proteína de interés. Varios sistemas de expresión de células de insecto están disponibles que ofrecen alternativas flexibles para sistemas de expresión de células procariotas y eucariotas 5,</sup…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Lynn Forlow-Jech y Dannialle LeRoy para la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la financiación CRIS base para USDA ARS, Programa Nacional 304 – Protección de las plantas y de cuarentena [Proyecto # 2020-22620-022-00D] para JAF y JJH La mención de marcas o productos comerciales en este artículo es el único fin de proporcionar información específica y no implica recomendación ni aprobación por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos. USDA es un proveedor y empleador que ofrece igualdad de oportunidades.
KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |