Summary
Vi præsenterer her, en metode til at effektivt udnytte hjerte differentiering potentiale af unge kilder til humane mesenkymale stamceller for at skabe funktionelle, ordregivende, cardiomyocyte-lignende celler in vitro-.
Abstract
Myokardieinfarkt og den efterfølgende iskæmisk cascade resultere i omfattende tab af cardiomyocytes, førende til kongestiv hjerteinsufficiens, den hyppigste årsag til dødelighed på verdensplan. Mesenchymale stamceller (msc) er en lovende mulighed for celle-baserede behandlinger til at erstatte aktuelle, invasive teknikker. MSC'er kan differentiere i mesenchymale lineages, herunder hjerte celletyper, men fuldstændig differentiering af funktionelle celler endnu ikke er nået. Tidligere metoder til differentiering var baseret på farmakologiske midler eller vækstfaktorer. Mere fysiologisk relevante strategier kan imidlertid også aktivere MSCs underkastes cardiomyogenic transformation. Her præsenterer vi en differentiering metode ved hjælp af MSC aggregater på cardiomyocyte feeder lag til at producere cardiomyocyte-lignende ordregivende celler.
Menneskelige navlestrengen perivascular celler (HUCPVCs) har vist sig at have en større differentiering potentielle end almindeligt undersøgt MSC typer, såsom knoglemarv MSCs (BMSCs). Som en ontogenetically yngre kilde undersøgte vi cardiomyogenic potentiale i første trimester (FTM) HUCPVCs i forhold til ældre kilder. FTM HUCPVCs er en roman, rig kilde af MSC'er, der bevarer deres i utero immunoprivileged egenskaber når kulturperler i vitro. Ved hjælp af denne differentiering protokol, FTM og sigt opnået HUCPVCs betydeligt øget cardiomyogenic differentiering i forhold til BMSCs, som angivet ved den øget ekspression af cardiomyocyte markører (dvs. myocyte forstærker faktor 2 C, cardiac troponin T, tunge kæde hjerte myosin, signal regulerende protein α og connexin 43). De bevarede også betydeligt lavere immunogenicitet, som påvist af deres lavere HLA-A udtryk og højere HLA-G udtryk. Anvende aggregat-baserede differentiering, viste FTM HUCPVCs øget samlede dannelse potentielle og genererede kontraherende celler klynger inden for 1 uge i fælles kultur på hjerte feeder lag, bliver den første MSC type hertil.
Vores resultater viser, at denne differentiering strategi effektivt kan udnytte cardiomyogenic potentiale af unge MSC'er, såsom FTM HUCPVCs, og foreslår, at in vitro- pre differentiering kunne være en potentiel strategi til at øge deres regenerativ effekten in vivo.
Introduction
Congestive hjerteinsufficiens (CHF) fortsætter som en førende årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan. CHF opstår ofte efter det massive tab af cardiomyocytes og udviklingen af celle-fri arvæv som patologiske resultatet af et myokardieinfarkt (MI)1. Mens hjertet er en delvist selvstændig fornyelse orgel, mindsker bosiddende stilk og stamfader celle poolen ansvarlig for udførelsen vævsregeneration betydeligt i overflod og funktion hos ældre patienter, ofte bliver utilstrækkelig til optimal opsving efter skade. Der er således stor interesse i at udvikle eksperimentelle behandlinger, der involverer transplantation af sunde donor celler i den beskadigede myokardiet. Det er bydende nødvendigt, at donor celler ikke kun genoprette struktur af væv, men også opnå en funktionel genopretning af de berørte myokardiet.
De indfødte hjerte beskæftiger hjerte væv-beboer og endogene stammer fra knoglemarv stamceller til efter skade reparere2,3,4. Regenerativ celler-host - og donor-stammer både-skal have kapacitet til at indhente passende fænotype og funktion i mikromiljø i remodeling myokardiet, sammen med evnen til at effektivt og sikkert erstatte de tabte celler. In vitro differentiering metoder er blevet brugt flittigt til at opnå høj effektivitet, stamcelle-baseret cardiomyocyte produktion5,6. Profilen udtryk af cardiac lineage markører bruges til at definere processen med stamcelle differentiering mod hjerte lineage7. Tidlig differentiering markører, såsom NKX2.5, myocyte forstærker faktor 2 C (Mef2c), og GATA48,9, kan være en indikation af indledningen af cardiomyogenic processen. Modne cardiomyocyte markører almindeligt anvendt til at vurdere differentiering effekten er signal regulerende protein α (SIRPA)10, cardiac troponin T (cTnT)11, tunge kæde hjerte myosin (MYH6)8,12,13og connexin 43 (Cx43)14,15,16. De metoder, der bruger embryonale stamceller (råd) og pluripotente stamceller (PSC) er blevet grundigt optimeret og drøftet med hensyn til detaljerne i induktive faktorer, ilt og næringsstoffer forløb, og den nøjagtige timing af aktion5,6,7,17,18. Ikke desto mindre præsentere ESC - og PSC-baserede teknologier stadig flere etiske og sikkerhed bekymringer, sammen med suboptimal elektrofysiologiske og immunologiske funktioner19,20. Værter transplanteret med disse celler ofte opleve immunorejection og kræve permanent immunosuppression. Dette er hovedsagelig på grund af misforholdet store histocompatibility complex (MHC) molekyler i host og donoren og til den resulterende T-celle respons21. Mens enkelte MHC klasse I matchende er en mulig løsning, en mere tilgængelige kliniske praksis ville kræve en celle kilde, der er universelt immunoprivileged at overvinde bekymring for afvisning.
Som en alternativ celle kilde til brug i kliniske applikationer, MSC'er, navnlig BMSCs, er blevet undersøgt til brug i væv revitalisering siden deres indledende beskrivelse i 199522. MSC'er menes at være bosat regenerativ celler, der kan findes i næsten enhver vaskulariserede væv23. Ved isoleret fra den ønskede kilde, MSCs kan nemt udvides i kultur, har omfattende paracrine kapacitet, og ofte har immunoprivileged eller immunmodulerende egenskaber24,25. Deres sikkerhed og effektivitet har allerede været vist i flere prækliniske undersøgelser, navnlig for kardiale regenerering3,26.
Mange MSC differentiering strategier udnytte farmakologiske stoffer, såsom 5-azacytidine22 og DMSO27, og vækst eller morphogenic faktorer, såsom BMP5,7,28,29 eller angiotensin-II30, med variabel effektivitet. Disse strategier, er imidlertid ikke baseret på de hindringer, som en naiv regenerativ celle er sandsynlig hen til opgør efter homing eller at blive leveret til stedet, skaden in vivo. Mere fysiologisk relevante strategier, mens vanskeligere at definere og manipulere, er baseret på den forudsætning, at MSC differentiering kan være fremkaldt via signaler fra væv mikromiljø, selv. Tidligere undersøgelser har vist, at eksponering for kardiale celle lysates31 eller ventrikulære myokardiet32,33, eller direkte kontakt med primære cardiomyocytes in vitro-15,34, kan øge udtryk for hjertets markører i MSCs. Andre har demonstreret spontane cardiomyogenesis efter behandling af kardiale skader med MSCs35,36,37,38, selv om delvis fusion af BMSCs og cardiomyocytes39,40 genereret den spirende myokardiet. Til vores viden, har funktionelle, spontant ordregivende cardiomyocytes fra menneskelige MSCs (hMSCs) af enhver væv kilde ikke endnu blevet rapporteret.
Den nuværende konsensus er, at alle MSCs opstår fra perivascular celler23. Unge MSCs med pericyte egenskaber kan isoleres fra regionen perivascular af menneskelige navlestreng væv41,42,43. I forhold til BMSCs besidder HUCPVCs øget differentiering potentielle og flere andre regenerativ fordele, både in vitro-41,44 og i vivo45,46,47. Især, har kilden er grænsefladen maternel-føtal, HUCPVCs betydeligt lavere immunogenicitet i forhold til voksne kilder til MSCs. Vores forskning fokuserer på karakterisering og præ-kliniske anvendelser af FTM HUCPVCs, den yngste kilde til MSCs undersøgt, som vi tidligere har vist sig at have øget proliferativ og højere multilineage differentiering kapacitet, herunder i cardiomyogenic slægt41.
Vi præsenterer her, en protokol, der kombinerer samlede dannelse og primære hjerte cellelag med feeder som induktive styrker at opnå komplet cardiomyogenic differentiering af MSC'er. aggregater giver en 3D-miljø, som bedre modeller betingelser i vivo i forhold til 2D vedhængende kulturer. Udnytte hjerte feeder lag skaber et miljø, der er repræsentativ for den ultimative transplantation site for at MSC'er. Vi demonstrere, at yngre kilder af MSC'er isoleret fra før eller efter fødslen umbilical snore har en højere kapacitet form aggregater og nå frem til hjerte fænotype sammenlignet med voksne BMSCs, mens den stadig vedholdt deres immun-privilegium. Udover den stejle højde af cardiac lineage markørgener og den inducerede udtryk af intracellulære (dvs. cTnT og MYH6) og celle-overflade proteiner (dvs., SIRPA og Cx43) specifikt for cardiomyocytes, vi viser, at differentiering af FTM HUCPVCs potentiale kan udnyttes med denne metode, og at de kan give anledning til spontant kontraherende cardiomyocyte-lignende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjerte differentieringen af stamceller har været under udvikling i 2 årtier, med flere forskellige strategier, der anvendes til at generere cardiomyocyte-lignende celler fra MSC kilder. Mange af disse strategier, men er ineffektiv, og de betingelser der ofte ikke er repræsentative miljø transplanterede celler møde i vivo.
I modsætning til eksisterende metoder benytter protokollen præsenteres her en kombination af primære hjerte feeder lag og MSC samlede dannelse. De primære hjerte feeder lag giver en differentiering miljø svarende til det, som hMSCs udsættes for ved transplantation. Aggregater generere et miljø med ilt og næringsstoffer forløb, der kan have en induktiv virkning på indlede afstamning engagement. PSC - og ESC-baserede hjerte differentiering strategier via hypoksiske forkonditionering og samlede dannelse har etableret denne induktiv virkning på stamceller5,52,53. Derudover ligner en 3D struktur bedre celle til celle forbindelser leveres in vivo. Brug denne metode, produceret vi med succes synkront ordregivende hMSC aggregater-den første gang med en hMSC type var i stand til at opnå dette, at vores viden. Vigtigere, udstillet kun den yngste hMSC celle kilde anvendes, FTM HUCPVCs, denne evne.
En væsentlig fordel ved at bruge enten naiv eller pre differentieret MSCs over europæiske sektorråd eller PSC'er for kardiale regenerering ligger i deres immunmodulerende eller immunoprivileged egenskaber. Men selv i tilfælde af MSC'er, immunmodulerende egenskaber varierer med deres alder og kilde54. BMSCs har vist sig at ændre deres immunogen egenskaber efter differentiering, som ofte fører til deres afvisning efter implantation55. Som tidligere beskrevet, MSCs fra navlestrengen oprindelse besidder særlige immun privilegium56 på grund af deres i utero oprindelse. Ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor, selv efter differentiering i cardiomyocyte-lignende celler, sigt og FTM HUCPVCs udstillet høje niveauer af HLA-G (der aktivt dæmper det medfødte immunforsvar) og vedligeholdes lave niveauer af HLA-A (der bestemmer T-celle medieret cytotoksicitet).
Denne differentiering protokol har fordel af praktisk giver mulighed for analyse på flere niveauer. Først, den levende billeddannelse af funktionelle, kontraherende aggregater er mere realistisk end skelne enkelt celler integreret i et feeder lag. Som protokollen udnytter blandet arter Co kulturer, human-specifikke primere anvendes qPCR analyse, mens FACS og ICC giver hurtig identifikation af fænotype-specifikt, cardiac markør udtryk (figur 2). Ved hjælp af protokollen, som beskrevet, blev forhøjede niveauer af SIRPA, cTnT, MYH6, aSarc, Mef2c og Cx43 opdaget. I forbindelse med HuNu er det muligt at identificere udtrykket af Mef2c og aSarc i differentierede hMSCs og at skelne fra rotte cardiomyocyte-afledte feeder lag eller sammensmeltet celler. Mens identifikation af ordregivende aggregater på feeder lag er forholdsvis let, kan indsamle eller høst af dem udgøre en begrænsning. Mikroskoper udstyret med en micromanipulator kan være ansat til at håndtere denne udfordring. Alternativt, menneskelige celler kan sorteres effektivt fra Co kulturer ved hjælp af menneske-specifikke anti-TRA-1-85 antistoffer. Mens fælles kulturer også fremlægge udfordring af potentielle cellefusion, kan dette også løses ved hjælp af en kombination af nukleare og celle-overflade menneskelige markør røbestoffer (tillægs figur 1).
En eventuel ændring af vores differentiering metode er at justere dannelsen af aggregater. Vores resultater tyder på, at samlede størrelse kan være en afgørende parameter for optimal differentiering. Antages det, at sammenlægningen er selektiv for mere klæbende celler, kan den fungere som en forhåndsudvælgelse trin for CD49f-positive hMSCs. Forbedret MSC sfære dannelse har været knyttet til øget CD49f udtryk49, og CD49f er også forbundet med højere stemness, fordi det er direkte forbundet til SOX2 og OCT449. Vi observerede lavere antal CD49f-positive celler i ældre kilder til hMSCs i forhold til FTM HUCPVCs, der kunne forklare den formindsket samlede størrelse observeret. Vi teoretisere, at dette udvalg kan kompenseres for ved at øge antallet af hMSCs pr. aggregat til at opnå en højere samlet størrelse, dermed muligvis øge effektiviteten af sammenlægning-induceret differentiering.
Fremtidige ansøgninger kan kræve ændringer i protokollen. Det er bydende nødvendigt, at kliniske anvendelser af pre differentierede hMSCs finder sted i xeno-fri betingelser. De ordregivende aggregater fremstillet ved hjælp af denne protokol kan også bruges til oprettelse af manipuleret hjerte muskelvæv. For at producere en klinisk relevant produkt, er en cGMP-kompatibel arbejdsgang nødvendig. Mens xeno-fri næringssubstratet er tilgængelig for hMSCs, kan giver et dyr-gratis feeder lag være udfordrende. Dog er anvender pre differentieret feeder lag af andre stamcelle kilder, såsom iPSCs, en mulig løsning.
Afslutningsvis kan differentiering beskrevne metode anvendes til at producere funktionel cardiomyocyte-lignende celler fra unge kilder til hMSCs i en bekvem og reproducerbar måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Clifford L. Librach er fælles indehaveren af patentet: metoder til isolering og brug af celler, der stammer fra første trimester navlestrengen væv, ydes i Canada og Australien.
Acknowledgments
Forfatterne takke de følgende medarbejdere og forskning personale for deres bidrag: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg og Andrée Gauthier-Fisher. Dette arbejde blev støttet af den The Ontario forskningsfond - Research Excellence (ORF-RE, runde #7) og oprette programmet Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation |
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For HUCPVC and BMSC culture media. |
| PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody | Biolegend | 313612 | Integrin marker for FC |
| APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody | R&D Systems | FAB7737A | Connexin 43 marker for FC |
| FITC-conjugated HLA-A2 antibody | Genway Biotech Inc. | GWB-66FBD2 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody | Abcam | ab7904 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody | AbD Serotec/Bio-Rad | MCA2518F | Cardiac marker for FC |
| APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195A | Human cell marker for FC and FACS |
| FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195F | Human cell marker for FC and FACS |
| Anti-connexin 43/GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Cx43. For ICC |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21428 | For ICC |
| Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody | Abcam | ab9465 | aSARC. For ICC |
| Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21426 | For ICC |
| Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody | New England BioLabs Ltd. | 5030S | For ICC |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-21206 | For ICC |
| Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody | EMD Millipore | MAB1281 | For ICC |
| MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | For imaging aggregates. | |
| 1.5 ml centrifuge microtubes | Axygen | MCT-150-C | For staining MSCs with fluorescent dye. |
| ImageJ | Open source image processing software. | ||
| Aria II | BD | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Bone marrow mesechymal stromal cells | Lonza | PT-2501 | BMSCs |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030-100G | BSA. To prepare solutions for ICC |
| BrdU | EMD Millipore | MAB3424 | Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use. |
| Canto II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| cDNA EcoDry Premix | Clontech/Takara | 639570 | For preparation of cDNA for qPCR |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies | C7025 | Fluorescent imaging of cell cytoplasm |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | For cell counting |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | D6421 | For rat primary cardiomyocyte culture medium. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010023 | D-PBS, without Ca2+, Mg2+ |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope | |
| FACSCalibur | BD | In-house. For flow cytometry. | |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | FBS. Component of cell culture medium. |
| IDT Prime Time qPCR probes | Integrated Data Technologies | FAM fluorophore | http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers |
| Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium | ThermoScientific | TA-030-FM | For storage of cells to undergo ICC |
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Normal goat serum | Cell Signaling Technology | 5425S | NGS. Used in blocking solution for ICC |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells | Thermo Scientific Nunc | 155409 | To prepare samples for ICC |
| OmniPur Triton X-100 Surfactant | EMD Millipore | 9410-OP | As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For fixing cells for ICC. |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Component of cell culture medium. |
| Primers | Sigma | Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol | CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G |
| Quorum Spinning Disk Confocal | Zeiss | SickKids Imaging Facility | |
| ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes | ReproCell | RCD001N | Positive control for qPCR |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | To isolate RNA for qPCR |
| Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | For qPCR with master mix |
| RPMI 1640 | Gibco | A1049101 | For MSC, monocyte coculture medium. |
| TaqMan qPCR primer assays | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | For qPCR |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | Staining of cells for viability and counting |
| Trypsin | Gibco | 272500108 | For cell dissociation |
| Volocity | Perkin-Elmer | Volocity 6.3 | Imaging software |
| 0.2 μm pore filter | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | For sterilizing tissue culture media |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat heart. Can use any similar forceps. |
| Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For mincing rat heart. Curved scissors recommended. |
| 50 mL tube | BD Falcon | 352070 | For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 6-well plates | Thermo Scientific Nunc | CA73520-906 | For tissue culture |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For aggregate formation |
| Axiovert 40C Microscope | Zeiss | For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol | |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
| Triton X-100 | EMD Millipore | 9410-1L | Used in permeabilization solution for ICC |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain used during visualization of Cx43 localization |
References
- Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
- Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
- Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
- Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
- Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
- Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
- Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
- Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
- Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
- van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
- Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
- Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
- Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
- Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1 (2014).
- Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
- Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767 (2015).
- Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4 (2008).
- Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
- Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
- Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
- Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
- Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
- Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
- Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
- Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
- Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
- Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
- Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
- Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
- Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
- Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
- Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
- Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
- Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
- Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252 (2016).
- Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
- Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
- Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
- Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
