Summary
여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.
Abstract
심근 경색과 이후 허 혈 성 캐스케이드 congestive 심장 마비, 전세계 사망률의 주요 원인으로 이어지는 cardiomyocytes의 광범위 한 손실 될. 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 현재, 침략 적 기술을 대체 하 세포 기반 치료를 위한 유망한 옵션입니다. MSCs 엽 계보, 심장 세포 유형, 등으로 분화 할 수 있다 하지만 기능 세포로 완전 한 차별화가 아직 달성 하지. 차별화의 이전 방법 약리학 대리인 또는 성장 요인에 근거 했다. 그러나, 더 순수 관련 전략 cardiomyogenic 변환을 MSCs를 사용할 수도 있습니다. 여기, 우리가 cardiomyocyte 같은 계약 셀 생산 cardiomyocyte 급지대 레이어에 MSC 집계를 사용 하 여 차별화 방법 제시.
인간 탯 줄 혈관 주위 세포 (HUCPVCs) 보다 잠재적인 큰 차별화를가지고 표시 되었습니다 일반적으로 MSC 종류, 골 MSCs (BMSCs) 등을 조사. Ontogenetically 젊은 소스로 서, 우리는 이전 소스에 비해 첫 삼분기 (FTM) HUCPVCs의 cardiomyogenic 잠재력 조사. FTM HUCPVCs는 그들의 utero immunoprivileged 속성 경작 하는 때 유지 하는 MSCs의 소설, 풍부한 소스 생체 외에서. 이 분화 프로토콜, FTM 및 용어를 사용 하 여 (즉, myocyte 증강 2 C, 심장 분 T, 무거운 체인 심장 myosin, 신호 규제 단백질 α, 비율과 connexin 43) cardiomyocyte 마커의 증가 식에 표시 된 대로 HUCPVCs BMSCs에 비해 크게 증가 cardiomyogenic 차별화를 달성. 그들은 또한 그들의 더 낮은 HLA A 식 및 높은 HLA-G 식 시연으로 상당히 낮은 immunogenicity를 유지. 잠재력과 셀 클러스터 심장 급지대 레이어에 공동 문화의 1 주 안에 계약, 그렇게 할 첫 번째 MSC 종류 되 고 생성 된 집계 기반 차별화 적용, FTM HUCPVCs 증가 집계 형성을 보였다.
우리의 결과이 차별화 전략 효과적으로 FTM HUCPVCs 같은 젊은 MSCs의 cardiomyogenic 잠재력을 활용 하는 체 외에서 사전 차별화 그들의 재생 효능 비보를 증가 하는 잠재적인 전략 될 수 보여줍니다.
Introduction
심부 전 (CHF) 병 적 상태와 사망률 전세계의 주요 원인으로 지속합니다. CHF는 종종 cardiomyocytes의 대규모 손실과 심근 경색 (MI)1의 병 적인 결과로 흉터 조직 세포 무료의 개발에 따라 발생 합니다. 마음은 부분적으로 자체 갱신 기관, 풍요로 움과 노인된 환자에서 종종 손상 후 복구에 대 한 부족 한 되는 기능에 거주 줄기와 조상 세포 수영장 크게 조직 재생을 실행에 대 한 책임 감소 한다. 따라서, 손상 된 심근으로 건강 한 기증자 세포의 이식 관련 된 실험적 치료 개발에 큰 관심이입니다. 그것은 기증자 세포 조직, 구조를 복원 뿐만 아니라 또한 영향을 받는 심근의 기능 회복을 달성.
기본 심장 심장 조직-거주자를 고용 하 고 생 골 수 유래 줄기 세포 후 부상에 대 한 복구2,,34. 재생 세포 호스트 및 기증자 파생 모두 해야 합니다 적절 한 표현 형 및 효율적이 고 안전 하 게 손실 된 세포를 대체 하는 능력과 함께 개장 심근의 microenvironment에서 기능 능력을가지고. 차별화 방법 체 외에서 높은 효율, 줄기 세포 기반 cardiomyocyte 생산5,6을 달성 하기 위해 광범위 하 게 사용 되었습니다. 심장 혈통 마커의 식 프로필 심장 계보7으로 줄기 세포 분화 과정을 정의 하는 데 사용 됩니다. 초기 분화 마커, NKX2.5, myocyte 증강 인자 2 C 등 (Mef2c), 및 GATA48,9, cardiomyogenic 프로세스의 개시의 표시 될 수 있습니다. 성숙한 cardiomyocyte 마커 차별화 효능을 평가 하기 위해 일반적으로 사용 되 있으며 신호 규제 단백질 α (SIRPA)10, 심장 분 T (cTnT)11, 무거운 체인 심장 myosin (MYH6)8,,1213, connexin 43 (Cx43)14,,1516. 배아 줄기 세포 (ESCs)와 만능 줄기 세포 (Psc)를 사용 하 여 방법 철저 하 게 최적화 하 고 되었습니다 유도 요인, 산소 및 영양소 그라디언트, 세부 사항 및 작업5,6,7,,1718의 정확한 타이밍에 관한 논의. 그럼에도 불구 하 고, esc 키 및 PSC 기반 기술을 여전히 여러 윤리 및 안전 우려, 차선 electrophysiological 및 면역 기능19,20함께 제시. 종종 이러한 세포와 함께 이식 하는 호스트 immunorejection 경험과 영구 면역 억제 필요. 이것은 주로 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 분자 호스트에 기증자 및 결과 T 세포 응답21일치. 동안 개별 MHC 종류 I 정합은 가능한 해결책, 더 접근 가능한 임상 연습 immunoprivileged 거절의 우려를 극복 하기 위해 보편적으로 셀 소스를 요구할 것입니다.
특히, BMSCs, 임상 응용, MSCs에서에서 사용에 대 한 대체 셀 소스로 199522에 그들의 초기 설명 이후 조직 재생에 사용 하기 위해 조사 했습니다. MSCs 거주 재생 세포 거의 모든 vascularized 조직23에서 찾을 수 있는 것으로 추정 된다. 원하는 소스에서 격리, 따라 MSCs 문화에 쉽게 확장 될 수 있다, 광범위 한 paracrine 용량 있고 종종 소유 immunoprivileged 또는 immunomodulatory 속성24,25. 그들의 안전과 효능 이미 표시 되었습니다 여러 전 임상 연구에서 특히 심장 재생3,26.
많은 MSC 차별화 전략 변수 효율 5 azacytidine22 와 DMSO27그리고 성장 또는 Bmp5,7,,2829 또는 angiotensin II30, 같은 morphogenic 요인 등의 약리 에이전트를 사용합니다. 그러나 이러한 전략, 기반 하지 순진한 재생 셀은 유도 또는 상해의 위치에 배달 되 고 후 발생할 가능성이 장애물 vivo에서. 더 순수 관련 전략, 더 어려운 동안 정의 및 조작, MSC 차별화 자체 조직 microenvironment에서 신호를 통해 유도 될 수 있다 전제에 기반. 이전 연구 보여주었다 심장 세포 lysates31 또는 심 실 myocardium32,33에 노출 또는 기본 cardiomyocytes 체 외 에서15,34, 접촉 MSCs에서 심장 감 적의 식을 높일 수 있습니다 직접. Cardiomyocytes39,40 BMSCs 융합 초기 심근을 생성 하는 경우, 비록 다른 MSCs35,36,,3738와 심장 부상 치료 후 자연 스러운 cardiomyogenesis를 증명 하고있다. 우리의 지식, 기능, 자발적 계약 cardiomyocytes 조직 소스 (hMSCs) 인간의 MSCs에서 하지 아직 보고 되었습니다.
현재 일치는 모든 MSCs 혈관 주위 세포23에서 발생 하는 것 이다. 영 MSCs pericyte 속성 인간 탯 조직41,,4243의 혈관 주위 지역에서 격리 될 수 있습니다. BMSCs에 비해 HUCPVCs 소유 증가 감 별 법 잠재력 및 다른 여러 재생 장점, 두 생체 외에서41,44 그리고 vivo에서45,46,47. 특히, 산 모-신생아 인터페이스 되는 소스 HUCPVCs는 MSCs의 성인 소스에 비해 상당히 낮은 immunogenicity. 우리의 연구에 초점을 맞추고 특성화 및 FTM HUCPVCs, 조사, MSCs의 막내 소스의 전 임상 응용 프로그램 우리 이전 증식 및 높은 multilineage 증가 표시는 차별화 능력, cardiomyogenic 계보41에 포함 한.
여기, 선물이 MSCs 집계의 완전 한 cardiomyogenic 차별화를 달성 하기 위해 유도 세력 제공 조건에 vivo에서 2D 부착 문화에 비해 더 나은 모델 3D 환경으로 집계 형성과 기본 심장 셀 피더 레이어를 결합 하는 프로토콜. 심장 급지대 레이어를 활용 하 여 MSCs에 대 한 궁극적인 이식 사이트의 대표 하는 환경을 제공 합니다. 사전 또는 출생 탯에서 격리 하는 MSCs의 젊은 소스 형태로 집계를 유지 하면서도 그들의 면역 권한 성인 BMSCs에 비해 심장 형에 도달 하는 높은 능력을가지고 설명 합니다. 심장 혈통 마커 유전자와 세포의 유도 식의 가파른 상승 외 (즉, cTnT와 MYH6) 및 세포 표면 단백질 (즉, SIRPA 및 Cx43) cardiomyocytes에 대 한 특정, 우리 보여 FTM HUCPVCs의 감 별 법 잠재력이이 방법으로 무력화 될 수 있습니다 그리고 그들은 저절로 cardiomyocyte 같은 셀 계약에 상승을 줄 수 있습니다.
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Discussion
줄기 세포의 심근 분화 MSC 소스에서 cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하는 데 사용 되 고 여러 가지 다른 전략으로 2 년간 개발 되었습니다. 그러나 이러한 전략은,, 많은, 고 사용 조건이 자주 하지는 환경 이식 세포 발생에서 vivo에서의 대표.
기존의 방법 달리 여기에 제시 된 프로토콜 기본 심장 급지대 레이어 및 MSC 집계 형성의 조합을 사용 합니다. 기본 심장 급지대 레이어는 hMSCs 이식 시에 노출 되는 것과 유사한 차별화 환경을 제공. 집계 생성 그라디언트와 산소와 영양소, 혈통 헌신 시작에 유도 영향을 미칠 수 있는 환경. Hypoxic 늘어진 사용 하 여 PSC 및 ESC 기반 심장 차별화 전략 및 집계 형성 줄기 세포5,,5253에이 유도 효과 설립 했다. 또한, 3 차원 구조는 더 셀을 연결 제공 비보유사합니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 성공적으로 동기적으로 계약 hMSC 집계에 처음으로 hMSC 형식 우리의 지식, 이것을 달성할 수 있었다을 생산. 중요 한 것은, 젊은 hMSC 셀 소스만 적용, FTM HUCPVCs,이 능력을 전시.
순진한 또는 미리 차별화 된 MSCs ESCs 또는 Psc에 심장 재생을 위한 사용의 중요 한 장점은 그들의 immunomodulatory 또는 immunoprivileged 속성에 있다. 그러나, MSCs의 경우에 immunomodulatory 속성 그들의 나이 및 소스54와 다릅니다. BMSCs 자주 주입55에 그들의 거부에 이르게 그들의 면역성 속성 후 차별화를 변경 하려면 표시 되었습니다. 앞에서 설명한, 탯 줄에서 MSCs 기원가지고 면역 특전56 그들의 utero에서 근원 때문. 프로토콜을 사용 하 여 차별화 cardiomyocyte 모양의 세포, 기간과 FTM HUCPVCs로 HLA-G (을 적극적으로 약하게 타고 난 면역 반응)의 높은 수준의 전시 후에 위에서 설명한 고 (T-세포는 세포 독성을 중재 결정) 하는 HLA A의 낮은 수준 유지.
이 분화 프로토콜 분석의 여러 수준에 대 한 편리 하 게 허용의 이점이 있다. 첫째, 계약 집계 기능, 라이브 이미징 급지대 레이어로 통합 단일 셀을 구별 보다 더 실현입니다. 프로토콜 활용 혼합 종 공동 문화, 인간 전용 프라이 머 적용 됩니다 정량 분석, FACS 및 ICC 표현 형의-특히 급속 한 식별을 제공 하는 동안 심장 마커 식 (그림 2). 설명 된 대로 프로토콜을 사용 하 여, SIRPA, cTnT, MYH6, aSarc, Mef2c, 및 Cx43의 높은 수준은 발견 했다. HuNu와 함께, Mef2c와 차별화 된 hMSCs에서 aSarc의 식을 식별 하 고 쥐 cardiomyocyte 파생 급지대 레이어 또는 융합된 세포에서 구별 가능 하다. 급지대 레이어에 계약의 식별 상대적으로 쉬운 반면, 수집 또는 그들을 수확 하는 것은 제한이 발생할 수 있습니다. 이 문제를 처리 하는 micromanipulator 갖춘 현미경을 사용할 수 있습니다. 또는, 인간 세포는 인간의 특정 안티-TRA-1-85 항 체를 사용 하 여 공동 문화에서 효율적으로 정렬할 수 있습니다. 공동 문화는 또한 잠재적인 세포 융합의 도전을 제시, 하는 동안이 너무 극복할 수 있습니다 핵과 세포 표면 인간의 마커 추적기 (보충 그림 1)의 조합을 사용 하 여.
우리의 차별화 방법의 가능한 수정 집계의 형성을 조절 하는 것입니다. 우리의 결과 집계 크기 최적의 차별화에 대 한 중요 한 매개 변수로 사용할 수는 것이 좋습니다. 된 집계 더 접착제 셀에 대 한 선택적, CD49f-긍정적인 hMSCs에 대 한 사전 선택 단계로 작동할 수 있다. 향상 된 MSC 구체 형성 CD49f 식49, 증가에 연결 되어있다 그리고 CD49f 또한 높은 stemness 연관 SOX2, OCT449에 직접 연결 되므로. 낮은 수가 작아 전체 크기 관찰을 설명할 수 있는 FTM HUCPVCs에 비해 hMSCs의 이전 소스에 CD49f-긍정적인 세포 관찰 합니다. 따라서 아마도 집계 유도 차별화의 효율성 증가 제출 하는 더 높은 집계 크기를 달성 하기 위해 집계 당 hMSCs의 수를 증가 시켜이 선택에 대 한 보상 될 수 있다 이론 화.
미래의 응용 프로그램 프로토콜 에서도 수정 필요할 수 있습니다. 그것은 미리 차별화 된 hMSCs의 임상 응용 이종 무료 조건에서 개최입니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 생산 계약 집계 설계 심장 근육 조직의 창조에도 사용할 수 있었습니다. 임상 적용 가능한 제품을 생산 하는 cGMP 준수 워크플로 필요 하다. 이종 무료 문화 매체를 hMSCs 위해 사용할 수 있는 하는 동안 동물 자유로운 피더 레이어를 제공 하 도전적 일 수 있습니다. 그러나, Ipsc, 등 다른 줄기 세포 소스의 미리 차별화 된 피더 레이어를 적용 가능한 솔루션입니다.
결론적으로, 편리 하 고 재현 가능한 방식으로 hMSCs의 젊은 원본의 기능 cardiomyocyte 같은 전지를 생산 하 설명 차별화 메서드를 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
닥터 클 리 포드 L. Librach는 특허의 공동 소유자: 격리의 첫 번째 임신 탯 조직에서 파생 된 셀의 사용 방법, 캐나다와 호주에 부여.
Acknowledgments
저자는 다음 직원을 감사 하 고 그들의 공헌에 대 한 인사를 연구: 매튜 Librach, 라일라 Maghen, 타 냐 A. Baretto, Shlomit Kenigsberg, 그리고 앙드레 Gauthier 피셔. 이 작품은 온타리오 연구 기금-연구 우수성 (ORF-다시, 라운드 #7)과 만드는 프로그램 i n c.에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation |
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For HUCPVC and BMSC culture media. |
| PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody | Biolegend | 313612 | Integrin marker for FC |
| APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody | R&D Systems | FAB7737A | Connexin 43 marker for FC |
| FITC-conjugated HLA-A2 antibody | Genway Biotech Inc. | GWB-66FBD2 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody | Abcam | ab7904 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody | AbD Serotec/Bio-Rad | MCA2518F | Cardiac marker for FC |
| APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195A | Human cell marker for FC and FACS |
| FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195F | Human cell marker for FC and FACS |
| Anti-connexin 43/GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Cx43. For ICC |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21428 | For ICC |
| Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody | Abcam | ab9465 | aSARC. For ICC |
| Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21426 | For ICC |
| Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody | New England BioLabs Ltd. | 5030S | For ICC |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-21206 | For ICC |
| Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody | EMD Millipore | MAB1281 | For ICC |
| MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | For imaging aggregates. | |
| 1.5 ml centrifuge microtubes | Axygen | MCT-150-C | For staining MSCs with fluorescent dye. |
| ImageJ | Open source image processing software. | ||
| Aria II | BD | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Bone marrow mesechymal stromal cells | Lonza | PT-2501 | BMSCs |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030-100G | BSA. To prepare solutions for ICC |
| BrdU | EMD Millipore | MAB3424 | Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use. |
| Canto II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| cDNA EcoDry Premix | Clontech/Takara | 639570 | For preparation of cDNA for qPCR |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies | C7025 | Fluorescent imaging of cell cytoplasm |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | For cell counting |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | D6421 | For rat primary cardiomyocyte culture medium. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010023 | D-PBS, without Ca2+, Mg2+ |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope | |
| FACSCalibur | BD | In-house. For flow cytometry. | |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | FBS. Component of cell culture medium. |
| IDT Prime Time qPCR probes | Integrated Data Technologies | FAM fluorophore | http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers |
| Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium | ThermoScientific | TA-030-FM | For storage of cells to undergo ICC |
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Normal goat serum | Cell Signaling Technology | 5425S | NGS. Used in blocking solution for ICC |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells | Thermo Scientific Nunc | 155409 | To prepare samples for ICC |
| OmniPur Triton X-100 Surfactant | EMD Millipore | 9410-OP | As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For fixing cells for ICC. |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Component of cell culture medium. |
| Primers | Sigma | Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol | CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G |
| Quorum Spinning Disk Confocal | Zeiss | SickKids Imaging Facility | |
| ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes | ReproCell | RCD001N | Positive control for qPCR |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | To isolate RNA for qPCR |
| Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | For qPCR with master mix |
| RPMI 1640 | Gibco | A1049101 | For MSC, monocyte coculture medium. |
| TaqMan qPCR primer assays | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | For qPCR |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | Staining of cells for viability and counting |
| Trypsin | Gibco | 272500108 | For cell dissociation |
| Volocity | Perkin-Elmer | Volocity 6.3 | Imaging software |
| 0.2 μm pore filter | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | For sterilizing tissue culture media |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat heart. Can use any similar forceps. |
| Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For mincing rat heart. Curved scissors recommended. |
| 50 mL tube | BD Falcon | 352070 | For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 6-well plates | Thermo Scientific Nunc | CA73520-906 | For tissue culture |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For aggregate formation |
| Axiovert 40C Microscope | Zeiss | For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol | |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
| Triton X-100 | EMD Millipore | 9410-1L | Used in permeabilization solution for ICC |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain used during visualization of Cx43 localization |
References
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