Summary
Aquí, presentamos un método para aprovechar eficientemente el potencial de diferenciación cardiaca de jóvenes fuentes de células madre mesenquimales humanas con el fin de generar las células funcionales, contratantes, cardiomiocitos-como en vitro.
Abstract
Infarto de miocardio y la posterior cascada isquémica como resultado la pérdida extensa de cardiomiocitos, llevando a insuficiencia cardíaca congestiva, la principal causa de mortalidad en todo el mundo. Las células madre mesenquimales (MSCs) son una opción prometedora para las terapias basadas en células reemplazar las actuales técnicas invasivas. MSCs pueden diferenciarse en linajes mesenquimales, incluyendo tipos de la célula cardiaca, pero completa diferenciación en células funcionales todavía no se ha logrado. Anteriores métodos de diferenciación se basan en agentes farmacológicos o factores de crecimiento. Sin embargo, estrategias más fisiológico relevantes también pueden habilitar MSCs a sufrir una transformación cardiomiogenético. Aquí, presentamos un método de diferenciación utilizando agregados MSC en capas de alimentador de cardiomiocitos para producir células contratantes cardiomiocitos.
Células perivasculares de cordón umbilical humano (HUCPVCs) se ha demostrado que tiene una diferenciación mayor que comúnmente investigados tipos de MSC, como médula ósea MSCs (BMSCs). Como una fuente más joven ontogeneticamente, investigamos el potencial de cardiomiogenético de HUCPVCs de (FTM) durante el primer trimestre en comparación con las más viejas fuentes. HUCPVCs FTM son una novela, rica fuente de MSCs que conservan sus útero immunoprivileged propiedades cuando cultivadas en vitro. Utilizando este protocolo de diferenciación, FTM y término HUCPVCs logrado cardiomiogenético perceptiblemente creciente diferenciación en comparación con BMSCs, tal como se indica por el aumento de la expresión de marcadores de cardiomiocitos (es decir, el factor del miocito enhancer 2 C, troponina T, cardiaca miosina de cadena pesada, señal regulador de la proteína α y conexina 43). También mantuvieron significativamente menor inmunogenicidad, como quedó demostrado por su menor expresión de HLA-A y la más alta expresión de HLA-G. Aplicación de diferenciación basada en el agregado, HUCPVCs FTM demostró formación agregada creciente potencial y genera contratación racimos de células dentro de 1 semana de co-cultivo en capas cardiacas alimentador, convirtiéndose en el primer tipo MSC para hacerlo.
Nuestros resultados demuestran que esta estrategia de diferenciación efectiva puede aprovechar el potencial de cardiomiogenético de MSCs joven, como HUCPVCs de FTM y sugiere que en vitro la diferenciación previa podría ser una estrategia potencial para aumentar su eficacia regenerativa en vivo.
Introduction
Insuficiencia cardíaca congestiva (CHF) persiste como una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. CHF ocurre a menudo después de la masiva pérdida de cardiomiocitos y el desarrollo de tejido cicatricial sin células como el resultado patológico de un infarto de miocardio (IM)1. Mientras que el corazón es un órgano parcialmente renovado, la residente madre y progenitoras celulares piscina responsable de ejecutar la regeneración tisular significativamente disminuye en abundancia y la función en pacientes envejecidos, a menudo convertirse en insuficiente para la recuperación óptima después de la lesión. Así, hay gran interés en el desarrollo de tratamientos experimentales que implican el trasplante de células de un donante sano en el miocardio dañado. Es imprescindible que las células del donante no sólo restauración la estructura del tejido, sino que también logran la recuperación funcional del miocardio afectado.
El corazón nativo emplea tejido reside en el corazón y endógenas originados en la médula ósea las células madre para después de la lesión de reparación2,3,4. Regenerativa células huésped derivadas y del donante-por igual-deben tener la capacidad de obtener el fenotipo apropiado y la función en el microambiente del miocardio remodelado, junto con la capacidad de manera eficiente y segura reemplazar las células perdidas. Métodos de diferenciación in vitro se han utilizado ampliamente para lograr la producción de cardiomiocitos de alta eficiencia, basada en la célula de vástago5,6. El perfil de expresión de marcadores de linaje cardíaco se utiliza para definir el proceso de diferenciación de células madre hacia el linaje cardíaco7. Diferenciación marcadores tempranos, tales como NKX2.5, factor potenciador de miocito 2C (Mef2c) y GATA48,9, pueden ser un indicio de la iniciación del proceso cardiomiogenético. Cardiomiocitos maduros marcadores utilizados para evaluar la eficacia de diferenciación son señal de regulador de la proteína α (SIRPA)10, troponina cardíaca T (cTnT)11, cadena pesada de miosina cardiaca (MYH6)8,12,13y conexina 43 (Cx43)14,15,16. Los métodos utilizando células madre embrionarias (ESCs) y células madre pluripotentes (PSC) han sido completamente optimizados y discutido sobre los detalles de factores inductivos de gradientes de nutrientes y oxígeno y la sincronización exacta de acción5,6,7,17,18. Sin embargo, tecnologías basadas en el ESC y el PSC aún presentan múltiples problemas éticos y de seguridad, junto con características electrofisiológicas e inmunológicos subóptima19,20. Transplantados con estas células a menudo experiencia immunorejection y requiere inmunosupresión permanente. Esto se debe principalmente a unir mal histocompatibilidad complejo () las moléculas de MHC en el host y de los donantes y a la resultante t-célula respuesta21. Mientras que los MHC de clase I que empareja es una posible solución, una práctica clínica más accesible requeriría una fuente de células que es universal immunoprivileged para superar la preocupación de rechazo.
Como una fuente alternativa de la célula para su uso en aplicaciones clínicas, MSCs y, en particular, BMSCs, han sido investigados para su uso en la regeneración de los tejidos desde su descripción inicial en 199522. MSCs se creen para ser residente células regenerativas que pueden encontrarse en casi cualquier tejido vascularizado23. A aislamiento de la fuente deseada, MSCs pueden ampliarse fácilmente en la cultura tienen capacidad amplia paracrina y poseen a menudo immunoprivileged o inmunomoduladores propiedades24,25. Su seguridad y eficacia han ya demostrados en varios estudios preclínicos, en particular para la regeneración cardiaca3,26.
Muchas estrategias de diferenciación de MSC utilizan a agentes farmacológicos, tales como 5-azacitidina22 y27de DMSO y crecimiento o factores morfogénicos, como ordenación5,7,28,29 o angiotensina II30, con eficacia variable. Sin embargo, estas estrategias no están basadas en los obstáculos que un ingenuo regenerador celular es probable encontrar después de autoguiado hacia el blanco o ser entregado al sitio de lesión en vivo. Estrategias más fisiológicamente relevantes, mientras que la más difícil de definir y manipular, se basan en la premisa que la diferenciación MSC puede ser inducida a través de señales del microambiente del tejido propio. Estudios previos han demostrado que la exposición a los lysates de la célula cardiaca31 o el miocardio ventricular32,33o dirigen contacto con cardiomiocitos primarios en vitro15,34, puede aumentar la expresión de marcadores cardiacos en MSCs. Otros han demostrado cardiomyogenesis espontánea después de tratar heridas cardiacas con MSCs35,36,37,38, aunque en parte, la fusión de BMSCs y cardiomiocitos39,40 generados por el miocardio naciente. A nuestro conocimiento, todavía no se han divulgado cardiomiocitos funcionales, espontáneamente contratación de MSCs humanos (hMSCs) de cualquier fuente de tejido.
El consenso actual es que todos MSCs surgen de células perivasculares23. Jóvenes de MSCs con propiedades pericyte puede ser aislado de la región perivascular del tejido de cordón umbilical humano41,42,43. En comparación con BMSCs, HUCPVCs poseen potencial mayor diferenciación y varias otras ventajas regenerativas, tanto en vitro41,44 y en vivo45,46,47. En particular, la fuente ser la interfaz materno-fetal, HUCPVCs tienen menor inmunogenicidad en comparación con adultos fuentes de MSCs. Nuestra investigación se centra en la caracterización y aplicaciones preclínicas de FTM HUCPVCs, la fuente más joven de MSCs investigado, que previamente hemos demostrado aumentaron multilineage proliferativa y mayor capacidad de diferenciación, incluyendo en el linaje de cardiomiogenético41.
Aquí, presentamos un protocolo que combina capas de alimentador primario de la célula cardiaca y formación agregada como fuerzas inductivas para lograr la diferenciación de cardiomiogenético completa de MSCs. agregados proporcionan un entorno 3D que modela mejor condiciones en vivo frente a culturas adherentes 2D. Utilizando capas cardiacas alimentador proporciona un entorno que es representativa del sitio de trasplante definitivo de las MSCs. Nos demuestran que jóvenes fuentes de MSCs aisladas de cordón umbilical antes o después del parto tienen una mayor capacidad para formar agregados y alcanzar el fenotipo cardíaco en comparación con adultos BMSCs, mientras que todavía mantiene su privilegio inmune. Además de la elevación escarpada de genes marcadores de linaje cardíaco y la expresión inducida de intracelular (es decir, reposo y MYH6) y proteínas de la superficie de la célula (es decir, SIRPA y Cx43) específico para cardiomiocitos, demostramos que se puede aprovechar el potencial de diferenciación de la FTM HUCPVCs con este método y que puede dar lugar a contraer espontáneamente cardiomiocitos-como las células.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La diferenciación cardiaca de células madre ha estado en desarrollo durante más de dos décadas, con varias diversas estrategias están utilizados para generar cardiomiocitos-como las células procedentes de MSC. Muchas de estas estrategias, sin embargo, son ineficientes, y las condiciones a menudo no son representativas del ambiente transplantada células encuentro en vivo.
En contraste con los métodos existentes, el protocolo presentado aquí utiliza una combinación de capas de alimentador cardiaca primaria y formación agregada MSC. Las capas de alimentación cardiaca primaria proporcionan un ambiente de diferenciación similar a la que el hMSCs exponen a trasplante. Los agregados generan un ambiente con gradientes de oxígeno y nutrientes, lo que puede tener un efecto inductivo sobre iniciar el compromiso de linaje. PSC y ESC-estrategias basadas en la diferenciación cardiaca mediante preacondicionamiento hipóxico y formación agregada han establecido este efecto inductivo en las células de vástago5,52,53. Además, una estructura 3D mejor se asemeja a la de célula a célula conexiones previstas en vivo. Usando este método, hemos producido con éxito síncrono contratante hMSC agregados-la primera vez que un tipo de hMSC fue capaz de lograr esto, a nuestro conocimiento. Lo importante, sólo la más joven hMSC célula fuente aplicada, HUCPVCs FTM, exhibió esta capacidad.
Una ventaja importante del uso ingenuo o MSCs previamente diferenciadas sobre CES o PSC para la regeneración cardiaca se encuentra en sus propiedades inmunomoduladoras o immunoprivileged. Sin embargo, incluso en el caso de MSCs, propiedades inmunomoduladoras varían con su edad y origen54. BMSCs se han demostrado para cambiar su propiedades inmunogénicas posteriores la diferenciación, que a menudo conduce a su rechazo a la implantación de55. Como se describió anteriormente, MSCs del cordón umbilical origen poseen especial privilegio inmune56 debido a su origen en el útero . Utilizando el protocolo descrito, incluso después de la diferenciación en cardiomiocitos células, término y FTM HUCPVCs exhibe altos niveles de HLA-G (que activamente atenúa la respuesta inmune innata) y mantiene bajos niveles de HLA-A (que determina el que t-cell mediado citotoxicidad).
Este protocolo de diferenciación tiene la ventaja de permitir convenientemente para varios niveles de análisis. En primer lugar, la viva imagen funcional, contratación agregados es más factible que distingue las células integradas en una capa de alimentador. Como el protocolo utiliza co-cultivos de especies mixtas, cartillas específicas humanos se aplican al análisis de qPCR, mientras FACS y ICC proporcionan la identificación rápida del fenotipo, específicamente, expresión de marcadores cardíacos (figura 2). Utilizando el protocolo como se describe, se detectaron niveles elevados de SIRPA, reposo, MYH6, aSarc, Mef2c y Cx43. Junto con HuNu, es posible identificar la expresión de Mef2c y aSarc de hMSCs diferenciados y distinguir de las capas de alimentador derivado de cardiomiocitos de rata o células fusionadas. Mientras que la identificación de los contratantes agregados en la capa de alimentación es relativamente fácil, recoger o cosecharles puede suponer una limitación. Microscopio equipado con un instrumental quirúrgico puede ser empleado para manejar este reto. Como alternativa, las células humanas pueden ordenarse eficientemente de co-cultivos con anticuerpos de anti-TRA-1-85 de humanos específicos. Mientras que las culturas Co también presentan el desafío de la posible fusión de la célula, esto también se puede solucionar utilizando una combinación de marcadores nucleares y superficie de la célula humana marcador (suplementario Figura 1).
Una posible modificación de nuestro método de diferenciación es ajustar la formación de agregados. Nuestros resultados sugieren que el tamaño agregado puede ser un parámetro crítico para la diferenciación óptima. Suponiendo que la agregación es selectiva para las células más adhesivas, puede actuar como un paso de preselección de hMSCs CD49f positivo. Mayor formación de esfera MSC se ha ligado a aumentado CD49f expresión49y CD49f también se asocia a mayor troncalidad porque está conectado directamente a SOX2 y OCT449. Se observó un menor número de células positivas de CD49f en más viejas fuentes de hMSCs comparado con HUCPVCs FTM, que podría explicar el disminución tamaño agregado observado. Teoriza que esta selección puede compensarse aumentando el número de hMSCs por agregado para alcanzar un mayor tamaño agregado, posiblemente aumentando la eficiencia de la diferenciación inducida por la agregación.
Futuras aplicaciones podrían requerir modificaciones en el protocolo así. Es imperativo que aplicaciones clínicas de hMSCs previamente diferenciadas tienen lugar en condiciones libres de xeno. Los contratantes agregados producidos usando este protocolo podrían utilizarse también para la creación de los tejidos de músculo de corazón ingeniería. Para producir un producto clínicamente aplicable, es necesario un flujo de trabajo compatibles con las cGMP. Mientras que el medio de cultivo libre de xeno está disponible para hMSCs, podría desafiar proporcionando una capa de alimentación libre de animales. Sin embargo, aplicando capas de alimentador previamente diferenciada de otras fuentes de células madre, como iPSCs, es una posible solución.
En conclusión, el método de diferenciación descrito puede aplicarse para producir células de cardiomiocitos funcionales de jóvenes fuentes de hMSCs en forma conveniente y reproducible.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
El Dr. Clifford L. Librach es común titular de la patente: métodos de aislamiento y uso de células derivadas de tejido de cordón umbilical de primer trimestre, en Canadá y Australia.
Acknowledgments
Los autores agradecemos a los siguientes miembros del personal y de investigación personal por sus contribuciones: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg y Andrée Gauthier-Fisher. Este trabajo fue financiado por el fondo de investigación de Ontario la - excelencia en la investigación (ORF-RE, redondo #7) y crear programa Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation |
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For HUCPVC and BMSC culture media. |
| PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody | Biolegend | 313612 | Integrin marker for FC |
| APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody | R&D Systems | FAB7737A | Connexin 43 marker for FC |
| FITC-conjugated HLA-A2 antibody | Genway Biotech Inc. | GWB-66FBD2 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody | Abcam | ab7904 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody | AbD Serotec/Bio-Rad | MCA2518F | Cardiac marker for FC |
| APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195A | Human cell marker for FC and FACS |
| FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195F | Human cell marker for FC and FACS |
| Anti-connexin 43/GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Cx43. For ICC |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21428 | For ICC |
| Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody | Abcam | ab9465 | aSARC. For ICC |
| Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21426 | For ICC |
| Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody | New England BioLabs Ltd. | 5030S | For ICC |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-21206 | For ICC |
| Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody | EMD Millipore | MAB1281 | For ICC |
| MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | For imaging aggregates. | |
| 1.5 ml centrifuge microtubes | Axygen | MCT-150-C | For staining MSCs with fluorescent dye. |
| ImageJ | Open source image processing software. | ||
| Aria II | BD | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Bone marrow mesechymal stromal cells | Lonza | PT-2501 | BMSCs |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030-100G | BSA. To prepare solutions for ICC |
| BrdU | EMD Millipore | MAB3424 | Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use. |
| Canto II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| cDNA EcoDry Premix | Clontech/Takara | 639570 | For preparation of cDNA for qPCR |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies | C7025 | Fluorescent imaging of cell cytoplasm |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | For cell counting |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | D6421 | For rat primary cardiomyocyte culture medium. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010023 | D-PBS, without Ca2+, Mg2+ |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope | |
| FACSCalibur | BD | In-house. For flow cytometry. | |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | FBS. Component of cell culture medium. |
| IDT Prime Time qPCR probes | Integrated Data Technologies | FAM fluorophore | http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers |
| Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium | ThermoScientific | TA-030-FM | For storage of cells to undergo ICC |
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Normal goat serum | Cell Signaling Technology | 5425S | NGS. Used in blocking solution for ICC |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells | Thermo Scientific Nunc | 155409 | To prepare samples for ICC |
| OmniPur Triton X-100 Surfactant | EMD Millipore | 9410-OP | As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For fixing cells for ICC. |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Component of cell culture medium. |
| Primers | Sigma | Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol | CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G |
| Quorum Spinning Disk Confocal | Zeiss | SickKids Imaging Facility | |
| ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes | ReproCell | RCD001N | Positive control for qPCR |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | To isolate RNA for qPCR |
| Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | For qPCR with master mix |
| RPMI 1640 | Gibco | A1049101 | For MSC, monocyte coculture medium. |
| TaqMan qPCR primer assays | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | For qPCR |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | Staining of cells for viability and counting |
| Trypsin | Gibco | 272500108 | For cell dissociation |
| Volocity | Perkin-Elmer | Volocity 6.3 | Imaging software |
| 0.2 μm pore filter | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | For sterilizing tissue culture media |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat heart. Can use any similar forceps. |
| Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For mincing rat heart. Curved scissors recommended. |
| 50 mL tube | BD Falcon | 352070 | For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 6-well plates | Thermo Scientific Nunc | CA73520-906 | For tissue culture |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For aggregate formation |
| Axiovert 40C Microscope | Zeiss | For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol | |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
| Triton X-100 | EMD Millipore | 9410-1L | Used in permeabilization solution for ICC |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain used during visualization of Cx43 localization |
References
- Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
- Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
- Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
- Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
- Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
- Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
- Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
- Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
- Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
- van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
- Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
- Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
- Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
- Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1 (2014).
- Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
- Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767 (2015).
- Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4 (2008).
- Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
- Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
- Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
- Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
- Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
- Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
- Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
- Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
- Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
- Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
- Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
- Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
- Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
- Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
- Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
- Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
- Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
- Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252 (2016).
- Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
- Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
- Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
- Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
