Summary
هنا، فإننا نقدم أسلوباً لكفاءة الاستفادة من إمكانات التمايز القلب الشباب مصادر الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية بغية توليد خلايا وظيفية، المتعاقدة، مثل كارديوميوسيتي في المختبر.
Abstract
احتشاء عضلة القلب وتتالي الدماغية اللاحقة يؤدي إلى خسائر كبيرة في cardiomyocytes، مما يؤدي إلى فشل القلب الاحتقاني، السبب الرئيسي للوفيات في جميع أنحاء العالم. الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) خيار واعدة للعلاجات المستندة إلى خلية ليحل محل التقنيات الحالية، والغازية. MSCs يمكن أن تفرق في الأنساب الوسيطة، بما في ذلك أنواع خلايا القلب، ولكن كاملة التمايز إلى خلايا وظيفية لم يتحقق حتى الآن. تستند الأساليب السابقة للتمييز بين وكلاء الدوائية أو عوامل النمو. ومع ذلك، أيضا تمكين الاستراتيجيات ذات الصلة أكثر فسيولوجيا MSCs على الخضوع للتحول كارديوميوجينيك. نقدم هنا، أسلوب تمايز استخدام المجاميع ماجستير في كارديوميوسيتي تغذية الطبقات لإنتاج خلايا المتعاقدة مثل كارديوميوسيتي.
الحبل السري البشري ارتشاح الخلايا (هوكبفكس) تبين أن يكون تفريق أكبر محتملة من التحقيق عادة أنواع لجنة السلامة البحرية، مثل نخاع العظم MSCs (بمسكس). كمصدر أونتوجينيتيكالي أصغر، نحن التحقيق في إمكانية كارديوميوجينيك من هوكبفكس (FTM) الاثلوث الأول مقارنة بالمصادر القديمة. هوكبفكس FTM هي مصدر الرواية، غنية من MSCs التي تحتفظ في الرحم إيمونوبريفيليجيد خصائصها عند مثقف في المختبر. استخدام هذا البروتوكول التمايز و FTM ومصطلح هوكبفكس تحقيق التمايز كارديوميوجينيك زيادة كبيرة بالمقارنة مع بمسكس، كما يتضح من زيادة التعبير عن علامات كارديوميوسيتي (عامل محسن ميوسيتيأي، ج 2، القلب تروبونين تي وسلسلة ثقيلة القلب الميوسين، إشارة α البروتين التنظيمي وكونيكسين 43). وأكدوا أيضا الاستمناع أقل بكثير، كما ثبت بانخفاض هلا-بالتعبير والتعبير هلا-ز أعلى. تطبيق التمايز القائم على التجميع، أظهر هوكبفكس FTM تشكيل إجمالي الزيادة المحتملة وولدت المتعاقدة كتل الخلايا ضمن أسبوع الثقافة المشارك في طبقات تغذية القلب، ليصبح أول نوع لجنة السلامة البحرية للقيام بذلك.
نتائجنا تثبت أن هذا التمايز استراتيجية يمكن فعالية تسخير إمكانات كارديوميوجينيك MSCs الشباب، مثل هوكبفكس FTM، ويوحي بأن في المختبر قبل المفاضلة يمكن أن تكون استراتيجية محتملة لزيادة على فعالية التجدد في فيفو.
Introduction
فشل القلب الاحتقاني (CHF) ما زال قائما كسبب رئيسي للإصابة بالأمراض والوفيات في جميع أنحاء العالم. وكثيراً ما يحدث فرنك سويسري عقب الخسارة الهائلة في cardiomyocytes وتطوير ندبا خالية من الخلية نتيجة مرضية ل احتشاء عضلة القلب (ميتشيغن)1. بينما القلب جهاز جزئيا تجديد ذاتي، يقلل المقيم الجذعية والسلف خلية المسبح المسؤولة عن تنفيذ تجديد الأنسجة إلى حد كبير في وفرة ووظيفتها في المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين، غالباً ما تصبح غير كافية للاسترداد الأمثل بعد الإصابة. وهكذا، هناك اهتمام كبير في تطوير العلاجات التجريبية التي تنطوي على زرع خلايا صحية من الجهات المانحة في عضلة القلب التالفة. من المحتم أن الخلايا المانحة ليس فقط استعادة هيكل الأنسجة، ولكن أيضا تحقيق الانتعاش الوظيفية لعضلة القلب المتضررة.
قلب الأم توظف المقيمين أنسجة القلب والخلايا الجذعية نخاع العظام نشأت الذاتية للإصابة بعد إصلاح2،،من34. التجدد تستمد الخلايا المضيفة والجهات المانحة على حد سواء يجب أن تملك القدرة على الحصول على النمط الظاهري المناسب والدالة في المكروية لعضلة القلب يعيد البناء، جنبا إلى جنب مع القدرة على كفاءة وأمان تحل محل الخلايا المفقودة. وقد استخدمت أساليب المفاضلة في المختبر على نطاق واسع لتحقيق كارديوميوسيتي ذات الكفاءة العالية، ويستند إلى الخلية الجذعية إنتاج5،6. التشكيل الجانبي للتعبير من علامات النسب القلب يستخدم لتعريف عملية تمايز الخلايا الجذعية نحو النسب القلب7. أوائل التمايز علامات، مثل NKX2.5، ميوسيتي محسن عامل ج 2 (Mef2c)، و8،GATA49، يمكن أن يكون مؤشرا على بدء عملية كارديوميوجينيك. علامات كارديوميوسيتي الناضجة تستخدم عادة لتقييم فعالية التمايز هي إشارة البروتين التنظيمي α (سيربا)10القلب تروبونين تي (كتنت)11، وسلسلة ثقيلة القلب الميوسين (MYH6)8،،من1213وكونيكسين 43 (Cx43)14،،من1516. تم أساليب استخدام الخلايا الجذعية الجنينية (بتوليدا) والخلايا الجذعية pluripotent (PSCs) دقة الأمثل ومناقشتها بشأن تفاصيل العوامل الاستقرائية والأكسجين والمغذيات التدرجات، والتوقيت الدقيق للعمل5،،من67،،من1718. ومع ذلك، تقديم التكنولوجيات القائمة على ESC ومجلس السلام والأمن لا تزال الشواغل الأخلاقية وسلامة متعددة، جنبا إلى جنب مع ميزات الكهربية والمناعية الأمثل19،20. يستضيف زرع هذه الخلايا غالباً ما تجربة إيمونوريجيكتيون وتتطلب الكبت المناعي الدائمة. وهذا يرجع أساسا إلى غير متطابقة histocompatibility الرئيسية المعقدة جزيئات (MHC) في البلدان المضيفة والمانحة، وإلى استجابة تي خلية الناتج21. بينما MHC الفردية الفئة الأولى مطابقة حل ممكن، تتطلب ممارسة سريرية أكثر يسرا مصدر خلية عالمياً إيمونوبريفيليجيد للتغلب على قلق الرفض.
كمصدر لخلايا بديلة للاستخدام في التطبيقات السريرية، MSCs وخاصة، بمسكس، قد حقق لاستخدامها في تجديد الأنسجة منذ الوصف الأولى في عام 199522. ويعتقد أن الخلايا التجدد المقيمين التي يمكن العثور عليها في ما يقرب من أي أنسجة vascularized23MSCs. عند عزلة من المصدر المطلوب، MSCs يمكن توسيعها بسهولة في الثقافة، ولديها القدرة paracrine واسعة النطاق، وكثيراً ما تملك إيمونوبريفيليجيد أو إيمونومودولاتوري خصائص24،25. سلامتهم ونجاعة الفعل ثبت في العديد من الدراسات ما قبل السريرية، لا سيما لإنعاش القلب3،26.
استخدام العديد من استراتيجيات التمايز MSC وكلاء الدوائية، مثل 5-أزاسيتيديني22 و [دمس]27، والنمو أو morphogenic عوامل، مثل BMPs5،7،،من2829 أو انجيوتنسين الثاني30، مع كفاءة متغير. هذه الاستراتيجيات، ومع ذلك، لا تقوم على العقبات التي خلية التجدد ساذجة من المرجح أن تواجه بعد صاروخ موجه أو يجري تسليمها إلى موقع الإصابة المجراة في. الاستراتيجيات ذات الصلة أكثر من الناحية الفسيولوجية، بينما من الصعب تحديد والتلاعب، تستند إلى الافتراض بأن التمايز ماجستير يمكن أن يتسبب من خلال إشارات من المكروية الأنسجة نفسها. الدراسات السابقة قد أظهرت أن التعرض لخلايا القلب ليساتيس31 أو32،عضلة القلب البطين33، أو توجيه الاتصال مع كارديوميوسيتيس الأولية في المختبر15،34، يمكن زيادة التعبير عن علامات القلب في MSCs. الآخرين أثبتت كارديوميوجينيسيس عفوية بعد علاج إصابات القلب مع MSCs35،36،،من3738، على الرغم من أن في جزء منه، تولد الانصهار من بمسكس وكارديوميوسيتيس،من3940 عضلة القلب الوليدة. على حد علمنا، كارديوميوسيتيس الوظيفية، المتعاقدة عفويا من MSCs البشرية (همسكس) من أي مصدر الأنسجة لم تم تبلغ بعد.
توافق الآراء الحالي أن MSCs كافة تنشأ من ارتشاح الخلايا23. يمكن أن يكون الشباب MSCs مع خصائص بيريسيتي المعزولة من منطقة ارتشاح في الحبل السري البشري الأنسجة41،،من4243. بالمقارنة مع بمسكس، تمتلك هوكبفكس احتمال ازدياد التمايز والعديد من المزايا الأخرى التجدد، على حد سواء في المختبر41،44 و في فيفو45،،من4647. جدير بالذكر أن المصدر يجري على واجهة الأم الجنين، قد هوكبفكس الاستمناع أقل بكثير مقارنة بمصادر الكبار من MSCs. ابحاثنا ويركز على توصيف وتطبيقات ما قبل السريرية من FTM هوكبفكس، مصدر أصغر من التحقيق، MSCs التي أثبتنا سابقا بزيادة مولتيلينيجي التكاثري وأعلى تمايز القدرات، بما في ذلك في النسب كارديوميوجينيك41.
نقدم هنا، بروتوكول يجمع بين تشكيل التجميعية وخلية القلب الابتدائي تغذية الطبقات كما تقدم قوات الاستقرائي لتحقيق التمايز كارديوميوجينيك كاملة من MSCs. المجاميع بيئة ثلاثية الأبعاد، ونماذج أفضل الشروط في فيفو مقارنة بالثقافات ملتصقة 2D. استخدام طبقات تغذية القلب يوفر بيئة ممثل الموقع زرع الأعضاء في نهاية المطاف MSCs. نظهر أن مصادر الأصغر سنا من MSCs المعزولة من حبل السرة قبل أو بعد الولادة لها قدرة أعلى لمجاميع النموذج والوصول إلى النمط الظاهري القلب بالمقارنة مع بمسكس الكبار، مع الحفاظ على جهاز المناعة-الامتياز. إلى جانب ارتفاع حاد النسب القلب علامة الجينات والتعبير المتعمد من داخل الخلايا (أي، كتنت و MYH6) والبروتينات على سطح الخلية (أي، سيربا و Cx43) محددة ل cardiomyocytes، نحن تظهر أنه يمكن تسخير إمكانيات التمايز هوكبفكس FTM مع هذا الأسلوب، وأنها يمكن أن تؤدي إلى المقاولات كارديوميوسيتي-مثل الخلايا تلقائياً.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم التفريق بين القلب من الخلايا الجذعية تحت التطوير لأكثر من 2 عقود، مع العديد من الاستراتيجيات المختلفة المستخدمة لتوليد الخلايا مثل كارديوميوسيتي من مصادر لجنة السلامة البحرية. العديد من هذه الاستراتيجيات، ومع ذلك، غير فعالة، وغالباً ما لا شروط استخدام ممثل بيئة زرع الخلايا اللقاء في فيفو.
وعلى النقيض من الأساليب القائمة، يستخدم البروتوكول المعروضة هنا مجموعة من الطبقات الرئيسية تغذية القلب والكلية تشكيل لجنة السلامة البحرية. الطبقات تغذية القلب الأساسي توفير بيئة تمايز مشابهة لتلك التي تتعرض همسكس إلى عند زرع الأعضاء. المجاميع تولد بيئة مع التدرجات الأوكسجين والمغذيات، التي يمكن أن يكون لها تأثير حثي على بدء الالتزام بالنسب. وأنشأت PSC و ESC-الاستراتيجيات القائمة على التمايز القلب استخدام preconditioning التاكسج وتشكيل إجمالي هذا تأثير حثي على الخلايا الجذعية البالغة5،،من5253. بالإضافة إلى ذلك، تمثل بنية ثلاثية الأبعاد أفضل خلية إلى خلية الاتصالات المقدمة في فيفو. باستخدام هذا الأسلوب، انتجنا شكل متزامن المتعاقدة همسك المجاميع المرة الأولى نوع همسك كان قادراً على تحقيق ذلك، لمعرفتنا بنجاح. الأهم من ذلك، عرضت فقط أصغر همسك الخلية المصدر تطبيق، هوكبفكس FTM، هذه القدرة.
ميزة كبيرة لاستخدام أما من السذاجة أو MSCs قبل المتباينة عبر بتوليدا أو PSCs لإنعاش القلب يكمن في خصائصها إيمونومودولاتوري أو إيمونوبريفيليجيد. ومع ذلك، حتى في حالة MSCs، تختلف خصائص immunomodulatory مع انتهاء العمر ومصدر54. ثبت بمسكس لتغيير على التفريق بين ما بعد خصائص مكسبه، الذي غالباً ما يؤدي إلى رفضهم على غرس55. كما سبق ذكره، MSCs من الحبل السري الأصل تمتلك امتياز الحصانة الخاصة56 بسبب أصلهم في الرحم . استخدام البروتوكول الموصوفة أعلاه، حتى بعد التمايز في الخلايا مثل كارديوميوسيتي، هوكبفكس FTM والأجل أظهرت مستويات عالية من هلا-ز (أن يخفف بفعالية الاستجابة المناعية الفطرية)، وحافظت على مستويات منخفضة من هلا-أ (التي تحدد بوساطة خلايا T سيتوتوكسيسيتي).
ويمتاز هذا البروتوكول التمايز ملائم السماح لعدة مستويات للتحليل. أولاً، تصوير حية من الوظيفية، المتعاقدة المجاميع أكثر جدوى من تمييز الخلايا المفردة دمج طبقة وحدة تغذية. كما يستخدم البروتوكول الثقافات المشارك الأنواع المختلطة، الإشعال الخاصة بالإنسان تطبق على تحليل قبكر، بينما توفر نظام مراقبة الأصول الميدانية والمحكمة الجنائية الدولية التعرف السريع على النمط الظاهري-على وجه التحديد، التعبير علامة القلب (الشكل 2). استخدام البروتوكول كما هو موضح، تم الكشف عن مستويات مرتفعة من سيربا، كتنت، MYH6، أسارك، Mef2c، و Cx43. بالتزامن مع هنو، من الممكن تحديد التعبير عن Mef2c وأسارك في همسكس المتباينة وتميز من الفئران المستمدة من كارديوميوسيتي تغذية الطبقات أو الخلايا تنصهر فيها. في حين أن من السهل نسبيا تحديد المجاميع المتعاقدة على الطبقة المغذية، جمع أو حصاد لهم يمكن أن تشكل قيداً. يمكن أن تستخدم المجاهر المزودة ميكرومانيبولاتور للتعامل مع هذا التحدي. وبدلاً من ذلك، يمكن فرز الخلايا البشرية كفاءة من الثقافات المشتركة باستخدام الأجسام المضادة-هيئة تنظيم الاتصالات-1-85 الخاصة بالإنسان. بينما ثقافات المشارك أيضا تحديا لاحتمال خلية الانصهار، هذا أيضا يمكن التغلب عليها باستخدام مزيج من تتبع العلامة النووي وسطح الخلية البشرية (تكميلية الشكل 1).
إمكانية إدخال تعديل أسلوب المفاضلة لدينا ضبط تشكيل المجاميع. نتائجنا تشير إلى أن الحجم الكلي يمكن أن تكون معلمة حرجة للتمايز الأمثل. افتراض أن التراكم الانتقائي للخلايا أكثر لاصقة، أنها يمكن أن تعمل كخطوة اختيار المسبق همسكس CD49f-إيجابية. ارتبط تشكيل المجال MSC معززة زيادة CD49f التعبير49، وأيضا يرتبط CD49f مع ستيمنيس أعلى لأنه متصل مباشرة إلى SOX2 و OCT449. لاحظنا انخفاض عدد الخلايا CD49f-الإيجابية في مصادر أقدم من همسكس مقارنة مع FTM هوكبفكس، الذي يمكن أن يفسر تقلص حجم التجميعية ولاحظ. نحن التنظير أن هذا التحديد يمكن تعويضه عن طريق زيادة عدد همسكس الواحدة والكلية لتحقيق حجم تجميعية أعلى، وبالتالي ربما زيادة كفاءة التمايز المستحثة بالتجميع.
التطبيقات المستقبلية قد تتطلب إدخال تعديلات على البروتوكول، وكذلك. من المحتم أن التطبيقات السريرية من همسكس قبل متمايزة تجري في ظروف خالية من كرة. يمكن أيضا استخدام المجاميع المتعاقدة التي تنتج باستخدام هذا البروتوكول لإنشاء أنسجة عضلة القلب هندسيا. لإنتاج منتج المطبقة سريرياً، سير عمل متوافقة مع المركب ضروري. بينما يتوفر المتوسطة ثقافة خالية من كرة همسكس، قد تحدي توفير طبقة تغذية خالية من الحيوان. بيد أن تطبيق طبقات التغذية قبل متمايزة من مصادر الخلايا الجذعية الأخرى، مثل إيبسكس، حل ممكن.
وفي الختام، يمكن تطبيق الأسلوب التمايز ووصف لإنتاج الفنية كارديوميوسيتي مثل الخلايا من مصادر الشباب من همسكس بطريقة مريحة واستنساخه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الدكتور كليفورد ليبراتش L. حامل مشترك للبراءة: أساليب العزل واستخدام الخلايا المستمدة من أنسجة الحبل السري الاثلوث الأول، منح في كندا وأستراليا.
Acknowledgments
الكتاب أشكر الموظفين التالية وبحوث الأفراد لمساهماتها: ماثيو ليبراتش، ماغين ليلى، تانيا ألف Baretto، وشلوميت كينيغزبيزغ، وأندريه غوتييه-فيشر. هذا العمل كان يدعمها "الصندوق البحوث أونتاريو"-التميز البحثي (ORF-RE، جولة #7) وإنشاء شركة البرنامج
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation |
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For HUCPVC and BMSC culture media. |
| PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody | Biolegend | 313612 | Integrin marker for FC |
| APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody | R&D Systems | FAB7737A | Connexin 43 marker for FC |
| FITC-conjugated HLA-A2 antibody | Genway Biotech Inc. | GWB-66FBD2 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody | Abcam | ab7904 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody | AbD Serotec/Bio-Rad | MCA2518F | Cardiac marker for FC |
| APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195A | Human cell marker for FC and FACS |
| FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195F | Human cell marker for FC and FACS |
| Anti-connexin 43/GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Cx43. For ICC |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21428 | For ICC |
| Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody | Abcam | ab9465 | aSARC. For ICC |
| Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21426 | For ICC |
| Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody | New England BioLabs Ltd. | 5030S | For ICC |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-21206 | For ICC |
| Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody | EMD Millipore | MAB1281 | For ICC |
| MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | For imaging aggregates. | |
| 1.5 ml centrifuge microtubes | Axygen | MCT-150-C | For staining MSCs with fluorescent dye. |
| ImageJ | Open source image processing software. | ||
| Aria II | BD | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Bone marrow mesechymal stromal cells | Lonza | PT-2501 | BMSCs |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030-100G | BSA. To prepare solutions for ICC |
| BrdU | EMD Millipore | MAB3424 | Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use. |
| Canto II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| cDNA EcoDry Premix | Clontech/Takara | 639570 | For preparation of cDNA for qPCR |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies | C7025 | Fluorescent imaging of cell cytoplasm |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | For cell counting |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | D6421 | For rat primary cardiomyocyte culture medium. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010023 | D-PBS, without Ca2+, Mg2+ |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope | |
| FACSCalibur | BD | In-house. For flow cytometry. | |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | FBS. Component of cell culture medium. |
| IDT Prime Time qPCR probes | Integrated Data Technologies | FAM fluorophore | http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers |
| Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium | ThermoScientific | TA-030-FM | For storage of cells to undergo ICC |
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Normal goat serum | Cell Signaling Technology | 5425S | NGS. Used in blocking solution for ICC |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells | Thermo Scientific Nunc | 155409 | To prepare samples for ICC |
| OmniPur Triton X-100 Surfactant | EMD Millipore | 9410-OP | As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For fixing cells for ICC. |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Component of cell culture medium. |
| Primers | Sigma | Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol | CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G |
| Quorum Spinning Disk Confocal | Zeiss | SickKids Imaging Facility | |
| ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes | ReproCell | RCD001N | Positive control for qPCR |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | To isolate RNA for qPCR |
| Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | For qPCR with master mix |
| RPMI 1640 | Gibco | A1049101 | For MSC, monocyte coculture medium. |
| TaqMan qPCR primer assays | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | For qPCR |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | Staining of cells for viability and counting |
| Trypsin | Gibco | 272500108 | For cell dissociation |
| Volocity | Perkin-Elmer | Volocity 6.3 | Imaging software |
| 0.2 μm pore filter | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | For sterilizing tissue culture media |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat heart. Can use any similar forceps. |
| Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For mincing rat heart. Curved scissors recommended. |
| 50 mL tube | BD Falcon | 352070 | For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 6-well plates | Thermo Scientific Nunc | CA73520-906 | For tissue culture |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For aggregate formation |
| Axiovert 40C Microscope | Zeiss | For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol | |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
| Triton X-100 | EMD Millipore | 9410-1L | Used in permeabilization solution for ICC |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain used during visualization of Cx43 localization |
References
- Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
- Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
- Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
- Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
- Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
- Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
- Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
- Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
- Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
- van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
- Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
- Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
- Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
- Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1 (2014).
- Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
- Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767 (2015).
- Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4 (2008).
- Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
- Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
- Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
- Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
- Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
- Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
- Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
- Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
- Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
- Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
- Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
- Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
- Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
- Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
- Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
- Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
- Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
- Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252 (2016).
- Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
- Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
- Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
- Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
