Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Оптимизированный протокол для извлечения белков из митрального клапана человека

doi: 10.3791/55762 Published: June 14, 2017

Summary

Белковый состав митрального клапана человека все еще частично неизвестен, поскольку его анализ осложняется низкой клеточностью и, следовательно, низким биосинтезом белка. Эта работа обеспечивает протокол для эффективного извлечения белка для анализа протеома митрального клапана.

Abstract

Анализ клеточного протеома может помочь выявить молекулярные механизмы, лежащие в основе болезней, из-за развития технологий, которые позволяют широкомасштабную идентификацию и количественную оценку белков, присутствующих в сложных биологических системах. Знания, полученные из протеомического подхода, могут потенциально привести к Лучшее понимание патогенных механизмов, лежащих в основе болезней, позволяющих идентифицировать новые диагностические и прогностические маркеры болезни и, надеюсь, терапевтических целей. Однако сердечный митральный клапан представляет собой очень сложный образец для протеомического анализа из-за низкой клеточности в протеогликане и обогащенном коллагеном внеклеточном матриксе. Это затрудняет извлечение белков для глобального протеомического анализа. Эта работа описывает протокол, который совместим с последующим анализом белка, таким как количественная протеомика и иммуноблоттинг. Это может обеспечить корреляцию данных вГ белка с данными о количественной экспрессии мРНК и не количественном иммуногистохимическом анализе. Действительно, эти подходы, когда они выполняются вместе, приведут к более полному пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе болезней, от мРНК до посттрансляционной модификации белка. Таким образом, этот метод может иметь отношение к исследователям, заинтересованным в изучении физиопатологии сердечного клапана.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Недавние данные изменили понимание роли многих регуляторных механизмов, которые возникают после синтеза мРНК. Действительно, трансляционные, посттранскрипционные и протеолитические процессы могут регулировать количество и функцию белка. Догма - в которой говорится, что концентрации мРНК являются проксимидами, соответствующими концентрациям соответствующих белков, предполагая, что уровни транскрипции являются основным фактором, определяющим количество белков, - были частично пересмотрены. В результате уровни транскрипции лишь частично предсказывают обилие белка, предполагая, что посттранскрипционные события Происходят для регулирования белков в клетках 1 , 2 .

Кроме того, белки в конечном счете диктуют функцию клетки и, следовательно, диктуют ее фенотип, который может подвергаться динамическим изменениям в ответ на аутокринную, паракринную и эндокринную факторы; Кровные посредники; температура; Лечение наркозависимости; И болезни развиваютсяМент. Таким образом, анализ экспрессии, сфокусированный на уровне белка, полезен для характеристики протеома и разгадать критические изменения, которые происходят с ним как часть патогенеза болезни 3 .

Таким образом, возможности, которые протеомика представляет для выяснения состояния здоровья и болезней, являются грозными, несмотря на существующие технологические проблемы. Особенно перспективные области исследований, к которым могут вносить протеомики: идентификация измененной экспрессии белка на любом уровне ( т . Е. Целые клетки или ткань, субклеточные клетки и биологические жидкости); Идентификация, верификация и валидация новых биомаркеров, полезных для диагностики и прогнозирования болезни; И, мы надеемся, идентификация новых белковых мишеней, которые могут быть использованы в терапевтических целях, а также для оценки эффективности и токсичности препарата 4 .

Захват сложностиПротеом представляет собой технологическую проблему. Существующие протеомические инструменты дают возможность проводить крупномасштабный высокопроизводительный анализ для идентификации, количественной оценки и проверки измененных уровней белка. Кроме того, внедрение методов фракционирования и обогащения, направленных на предотвращение интерференции, вызванной наиболее распространенными белками, также улучшило идентификацию белка путем включения наименее распространенных белков. Наконец, протеомика дополнена анализом посттрансляционных модификаций, которые постепенно появляются как важные модуляторы функции белка.

Однако подготовка проб и восстановление белка в анализируемых биологических образцах по-прежнему остаются предельными стадиями протеомического рабочего процесса и увеличивают потенциал возможных ловушек 5 . Действительно, в большинстве методов молекулярной биологии, которые необходимо оптимизировать, первыми шагами являются гомогенизация тканиИон и клеточный лизис, особенно при анализе белков с низким уровнем обилия, для которых методов амплификации не существует. Кроме того, химическая природа белков может влиять на их собственное выздоровление. Например, анализ высокогидрофобных белков очень сложный, поскольку они легко осаждаются во время изоэлектрической фокусировки, тогда как транс-мембранные белки почти нерастворимы (см. Ссылку 5). Кроме того, изменчивость состава ткани создает значительный барьер для разработки универсального метода экстракции. Наконец, поскольку почти все клинические образцы имеют ограниченное количество, необходимо обеспечить подготовку белка с максимальным восстановлением и воспроизводимостью из минимальных количеств проб 6 .

В этой работе описывается оптимизированный протокол экстракции белка из нормального митрального клапана сердца человека, который представляет собой очень сложный образец для протеомического анализа. Нормальный митральный клапан представляет собой компLex, лежащей между левым предсердием и левым желудочком сердца ( рис. 1 ). Он играет важную роль в контроле кровотока из атриума в желудочек, предотвращении обратного потока и обеспечении надлежащего уровня подачи кислорода всему телу, что обеспечивает адекватный сердечный выброс. Однако он часто считается «неактивной» тканью с низкой клеточностью и несколькими компонентами, главным образом в внеклеточной матрице. Это связано с тем, что в нормальных условиях резидентные клапанные интерстициальные клетки (VIC) представляют собой покоящийся фенотип с низкой скоростью биосинтеза белка 7 .

Однако было продемонстрировано, что в патологическом состоянии количество VIC в спонгиозе увеличивается, а их синтез белка активируется вместе с другими функциональными и фенотипическими изменениями 8 . Поэтому неудивительно, что минимальные данные, имеющиеся вВ литературе основное внимание уделяется анализу патологических митральных клапанов 9 , 10 , в которых увеличение числа активированных ВИП может объяснить относительно большое количество идентифицированных белков.

В заключение, настоящий протокол может служить для развития понимания патогенных механизмов, ответственных за болезни митрального клапана, путем изучения компонентов белка митрального клапана. Действительно, более глубокое понимание лежащих в основе патологических процессов могло бы помочь улучшить клиническое лечение клапанных заболеваний, чьи текущие показания к вмешательству в основном основаны на гемодинамических соображениях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В этом протоколе человеческие сердца собираются во время мультиорганной эксплантации (время холодной ишемии 4-12 ч, в среднем 6 ± 2 ч) от доноров многих органов, исключенных из трансплантации органов по техническим или функциональным причинам, несмотря на нормальные эхокардиографические параметры. Они отправляются в сердечно-сосудистый тканевый банк Милана, Кардиологический центр Монзино (Милан, Италия) для лечения аортальных и легочных клапанов. Митральные задние листочки не используются в клинических целях, поэтому они собираются во время выделения аорты и легочного клапана после получения информированного согласия от родственников доноров. Ткань для трансплантации и исследований собирается только после согласия родителей; На листе согласия они разрешают (или не) использование сердечной ткани для исследования только в том случае, если оно не подходит для клинического применения ( т.е. микробиологических, функциональных и серологических проблем), следуя руководящим принципам комитета по этикеМонзино-кардиологический центр.

1. Подготовка митрального клапана

  1. Убирайте человеческий митральный клапан как можно скорее после эксплантации органа (время холодной ишемии 4-12 часов).
  2. В чистой комнате удалите сердце из транспортной сумки, содержащей холодный (4 ° C) раствор ( т. Е. Солевой раствор или сбалансированную среду Eurocollins или Wisconsin). Поместите его в ведро и поместите его в шкаф для биобезопасности (биологическая защита от вертикального воздушного потока, класс A, классификация надлежащей производственной практики (GMP)), чтобы продолжить подготовку клапана.
  3. Поместите сердце на стерильную одноразовую драпировку в шкафу. Используя стерильный одноразовый скальпель, полностью отрежьте сердце, перпендикулярно его главной оси, на уровне левого и правого желудочков, примерно на расстоянии 4 см от вершины.
  4. Переместите восходящую аорту и легочную артерию, чтобы отобразить левую предсердную крышу.
  5. С помощью стерильных автоклавируемых щипцов и кирков обрезать левое предсердие наЛевая предсердная крыша, делая видимым митральный клапан и позволяя идентифицировать большой митральный листок (передний) и маленький митральный листок (задний).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Антеро-латеральные и задние медиальные комиссуры определяют границу передней листочки и задней области.
  6. Используя стерильные автоклавируемые ножницы и невращающиеся щипцы, рассекайте левый предсердие и толщину стенки желудочка по всей окружности всего митрального клапана .
  7. Определите непрерывность мито-аортального клапана.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Левый желудочек содержит весь митральный клапан и аккорды.
  8. Отделите лист переднего митрального клапана от листочка нижнего митрального клапана, отрежьте задний лист по вставке с желудочком (комиссурой).
  9. Промойте задний лист в физиологическом растворе. Отрежьте листовку на мелкие кусочки (<1 см 2 ) и индивидуально оберните их алюминиевой фольгой. Заморозить их жидким азотом,
    Осторожно: соблюдайте организационные правила безопасности при использовании жидкого азота.
    1. Санифицируйте таблицу шкафа раствором 70% изопропилового спирта и 6% раствором перекиси водорода в конце процедуры.

2. Выделение белка

  1. Используйте пинцет для забора образца, хранящегося в жидком азоте, и немедленно поместите его на сухой лед, все еще обернув в алюминиевую фольгу. Не оставляйте образец для оттаивания во время любых передач.
  2. Перед шлифованием охладите фарфоровый / циркониевый раствор и пестик системы измельчителя ( например, CryoGrinder) вместе с образцом, помещая их в колбу Дьюара, содержащую жидкий азот (~ 500 мл).
    Осторожно: соблюдайте организационные правила безопасности при использовании жидкого азота.
  3. Поместите раствор и пестик в полистирол, содержащий сухой лед. Удалите образец из алюминиевой фольги и положите ее в раствор.
  4. Измельчить tОн образец с большим пестиком против раствора 15-20 раз, используя отвертку для вращения пестика. Смешайте образец с кончиком предварительно охлажденного шпателя во время процесса измельчения.
    1. Повторите с маленьким пестиком.
  5. Перенесите образец почвы в предварительно взвешенную трубку ( например, пробирку с центрифугой на 15 мл), повернув трубку, поместив ее поверх раствора и перевернув вместе, чтобы переместить образец в трубку. Используйте предварительно охлажденный шпатель для извлечения всего материала из раствора.
    1. Держите трубку с образцом на сухом льду, чтобы избежать оттаивания образца во время переноса.
  6. Рассчитайте чистый вес образца.
  7. Очистите ступку и пестик после каждого образца и дезактивируйте их автоклавированием или нагрейте их при 200 ° C в течение 2 часов.
  8. Перенесите порошкообразный образец из центрифужной трубки в стеклянную трубку гомогенизатора путем инверсии.
  9. Добавить фильтрованный буфер мочевиныR (8 М мочевина, 2 М тиомочевины, 4% мас. / Об. CHAPS, 20 мМ Трис и 55 мМ дитиотреитола) в стеклянную трубку, 200 мкл мочевинного буфера для каждых 10 мг порошкообразной ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Остаточный порошкообразный образец, оставшийся в пробирке для центрифуги, может быть восстановлен с использованием части расчетного объема буфера мочевины.
  10. Гомогенизируйте образец, используя мешалку, оборудованную боросиликатным стеклянным раствором и пептидом из политетрафторэтилена (ПТФЭ). Медленно нажмите пестик на образец с крутящим движением (1500 об / мин) 10 раз.
  11. Восстановите супернатант и перенесите его в чистую 1,7 мл центрифужную пробирку. Снова извлеките оставшийся образец свежим буфером мочевины, добавив половину объема, используемого во время первой экстракции.
  12. Повторите шаг 2.10.
  13. Восстановить супернатант и объединить его с супернатантом с шага 2.11. Поместите объединенный супернатант на ротатор трубки в течение 30 мин.
  14. Центрифугируйте пробирку в течение 30 минут при 13000 xg и 4 ° C.
  15. Восстановить супернатантD измерьте концентрацию белка, используя анализ белка Bradford, согласно инструкциям производителя. Храните образец при температуре -80 ° C до использования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Экстракция и растворение белков в мочевиновом буфере непосредственно совместимы с протеомными методами, основанными на изоэлектрофокусировке (двумерный электрофорез (2-DE) 11 и жидкофазная изоэлектрическая фокусировка (IEF) 12 ) и с иммуноблоттингом после разбавления в буфере Лаэмми 13 Содержащий коктейль ингибитора протеазы 14 .

Для методов , не содержащих геля, на основе масс-спектрометрии ( т.е. жидкостной хроматографии, связанной с независимым от данных масс-спектрометрическим анализом (LC / MS E ) и двумерным LC / MS E (2D-LC / MS E )) 15 , извлеченные образцы В описанном буфере мочевины необходимо дополнительно обработать, чтобы удалить мочевину и тиомочевину, которые могут препятствовать последующему расщеплению белка и жидкостной хроматографии. ThiЭтап обессоливания может быть выполнен с использованием коммерческих наборов для осаждения белков, следуя инструкциям производителя для осаждения белков. Затем образец может быть растворен в 25 мМ NH 4 HCO 3, содержащем 0,1% расщепляемых моющих средств для расщепления белка 16 . Осаждение белков может устранить буферные компоненты, минимально влияя на содержание белка (восстановление белка:> 85%), что делает образец подходящим для любого анализа.

Применение этого протокола для извлечения белка из митральных клапанов человека позволило идентифицировать в общей сложности 422 белка, объединив четыре разных подхода протеомики, которые были описаны выше подробно 11 , 15 . В частности, 169 белков были идентифицированы белками 2-DE, 330 белками IEF, 96 белков жидкой фазы с помощью LC / MS E и 148 белковПо 2D-LC / MS E (таблица 1).

Чтобы классифицировать 422 идентифицированных белка с точки зрения субклеточной локализации, программное обеспечение использовалось для анализа онтологии генов (GO) ( например, Cytoscape). Сеть, созданная с помощью программного обеспечения и соответствующего соответствующего подключаемого модуля, показала, что помимо ожидаемых белков, локализованных во внеклеточной области (см. Верхнюю правую часть фиг. 2 ), большинство белков, идентифицированных протеомными подходами, были получены из внутриклеточной области (Т. Е. Цитоплазма, органеллы, везикулы и цитоскелет). Были идентифицированы белки клеточной поверхности ( рис. 2 ).

Результаты были дополнительно подтверждены в трех независимых образцах митрального клапана. Иммуноблоттинг использовали для анализа группы из четырех белков ( например, септина-11, четырех с половиной белка LIM-домена 1 (FHL-1), derМатопонтин и альфа-кристаллин B (CryAB)), которые никогда не были идентифицированы в нормальном митральном клапане ( рис. 3 ).

Рисунок 1
Рисунок 1: Структура клапанов Mitral. Вид сверху человеческого сердца, показывающий закрытый ( A ) или открытый ( B ) митральный клапан человека. Вид спереди левого желудочка сердца человека ( C ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Анализ идентифицированных белков митрального клапана в терминах клеточного распределения. Cytoscape и плагин BiNGO использовались для обтаиN распределение терминов онтологии генов (GO) из категорий клеточных компонентов. Размер круга пропорционален количеству компонентов белка, связанным с выбранными условиями GO, и сообщается цветовая шкала для p-значения избыточного представления. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Иммуноблоттинг-анализ септина-11, FHL-1, дерматопонтина и CryAB в целом экстракт из трех человеческих нормальных митральных клапанов. Иммуноблоттинг проводили с использованием мышиного моноклонального антитела против CryAB и кроличьих поликлональных антител против антител септина-11, FHL-1 и дерматопонтина. пожалуйстаНажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

<тд> х <TD> <Td> Препарат предшественника бета-типа 4 протеасомы <TD> </ TR> <Td> Трансгелин 2 <TD> <TR> <TD>
присоединение Описание 2-DE 2D-LC LC-MS E Жидкая фаза IEF
A6NMZ7 Коллаген альфа VI Икс
O00151 PDZ и белок домена LIM 1 Икс
O00299 Хлоридный внутриклеточный протеин 1 Икс
O00764 Пиридоксальная киназа Икс
O14558 Белки теплового шока бета 6 Икс
O43399 Опухоль белка D54 Икс
O43488 Афлатоксин B1 альдегидредуктазный член 2 Икс
O43707 Альфа-актинин 4 Икс Икс
O43866 Антиген CD5 как предшественник Икс
O60493 Сортировка нексина 3 Икс
O60701 UDP глюкоза 6 дегидрогеназа Икс
O75223 Нехарактерный белок Икс
O75368 Связывание домена SH3 с глутаминовой кислотой, богатой белком Икс
O75390 Митохондриальный предшественник цитратной синтазы Икс
O75489 NADH-дегидрогеназа убихинон-белок железа 3 митохондриальный предшественник Икс Икс
O75608 Ацилбетон тиоэстераза 1 Икс
O75828 Карбонилредуктаза NADPH 3 Икс
O75874 Изоцитратдегидрогеназа NADP цитоплазматическая Икс
O75955 Flotillin Икс
O94760 NG NG диметиларгининдиметиламиногидролаза 1 Икс
O94788 Сетчатая дегидрогеназа 2 Икс
O95865 NG NG диметиларгининдиметиламиногидролаза 2 Икс Икс
P00325 Алкогольная дегидрогеназа 1В Икс Икс
P00338 L лактатдегидрогеназа Цепочка Икс
P00352 Сетчатая дегидрогеназа 1 Икс
P00441 Супероксиддисмутаза Cu Zn Икс Икс
P00450 Препарат Ceruloplasmin Икс Икс
P00488 Коагуляционный фактор XIII Прекурсор цепи Икс
P00491 Пуриновая нуклеозидфосфорилаза Икс
P00492 Гипоксантин гуанинфосфорибозилтрансфераза Икс
P00558 Фосфоглицераткиназа 1 Икс Икс
P00568 Аденилат-киназный изофермент 1 Икс
P00734 протромбин Икс Икс
P00738 Гаптоглобин Икс Икс Икс Икс
P00739 Предшественник белка, связанный с гаптоглобином Икс
P00751 Фактор комплемента B Икс Икс Икс
P00915 Углеродная ангидраза 1 Икс
P00918 Углеродная ангидраза 2 Икс
P01008 Прекурсор антитромбина III Икс Икс Икс
P01009 Альфа-1 антитрипсин Икс Икс Икс Икс
P01011 Альфа 1 антихимотрипсин Икс Икс Икс Икс
P01019 Препарат ангиотензиногена Икс Икс
P01023 Макроглобулин Alpha 2 Икс Икс
P01024 Дополнение C3 Икс Икс Икс Икс
P01033 Препарат ингибитора 1 металлопротеиназы Икс
P01042 Препарат Kininogen 1 Икс
P01593 Цепочка Ig каппа VI область AG Икс
P01598 Цепочка Ig каппа VI регион ЕС Икс
P01600 Цепочка Ig каппа VI область Хау Икс Икс
P01611 Цепь Ig каппа VI область Wes Икс
P01620 Цепочка Ig kappa V III область SIE Икс
P01625 Цепь Ig каппа V IV область Лен Икс
P01766 Ig тяжелая цепь V III область BRO Икс Икс
P01781 Ig тяжелая цепь V III область GAL Икс
P01834 Цепочка цепи k каппа Икс Икс Икс Икс
P01842 Ig лямбда-цепи C-области Икс Икс Икс
P01857 Ig-1-цепь-цепь Икс Икс Икс Икс
P01859 Ig-гамма-цепь 2-цепи Икс Икс Икс Икс
P01860 Ig-3-цепь C-области Икс Икс Икс
P01861 Ig-гамма-цепь 4-цепи Икс Икс Икс
P01871 Ig-цепь цепи C Икс Икс Икс
P01876 Ig альфа 1 цепь C Икс Икс Икс Икс
P01877 Ig-2-цепь C-область Икс
P02144 Миоглобин Икс Икс
P02452 Коллагеновая альфа-1 I цепь Икс Икс Икс Икс
P02511 Альфа-кристаллин B-цепь Икс
P02545 Lamin AC 70 кДа ламин Икс Икс Икс Икс
P02647 Аполипопротеин AI Икс Икс Икс Икс
P02649 Аполипопротеин Е Икс Икс Икс Икс
P02671 Фибриногенная альфа-цепь Икс Икс Икс Икс
P02675 Бета-цепь фибриногена Икс Икс Икс Икс
P02679 Гамма-цепь фибриногена Икс Икс Икс Икс
P02689 Миелин Р2-белок Икс
P02735 Сывороточный амилоид Прекурсор белка Икс
P02741 C-реактивный белок Икс
P02743 Сывороточный амилоидный компонент Икс Икс Икс Икс
P02746 Подкомпонент субкомпонентного компонента комплемента Libq B Икс Икс
P02747 Компонент субкомпонентный субкомпонент Cq субкомбината Cq Икс
P02748 Компонент дополнения C9 Икс Икс Икс
P02749 Бета 2 гликопротеин 1 Икс Икс Икс Икс
P02750 Лейцин-богатый альфа-2-гликопротеиновый предшественник Икс
P02751 фибронектина Икс Икс
P02760 Препарат белка AMBP Икс Икс Икс Икс
P02763 Альфа-1-гликопротеин 1 Икс Икс Икс
P02765 Препарат гликопротеина альфа-2 HS Икс
P02766 Прекурсор транстиретина Икс Икс Икс
P02768 Сывороточный альбумин Икс Икс Икс Икс
P02774 Препарат белка связывания витамина D Икс
P02787 Serotransferrin Икс Икс Икс Икс
P02788 Препарат лактотрансферрина Икс
P02790 гемопексина Икс Икс Икс Икс
P02792 Ферритовая легкая цепь Икс
P04004 витронектин Икс Икс Икс Икс
P04075 Фруктоза-бисфосфат-альдолаза А Икс
P04083 Приложение А1 Икс Икс Икс Икс
P04179 Супероксиддисмутаза Mn митохондриальный предшественник Икс
P04196 Препарат, богатый гистидином гликопротеина Икс
P04217 Препарат гликопротеина альфа 1B Икс Икс
P04350 Тубулин бета-4 цепи Икс
P04406 Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа Икс Икс Икс Икс
P04792 Белки теплового шока бета 1 Икс Икс Икс Икс
P05091 Препарат митохондрий альдегиддегидрогеназы Икс Икс
Прекурсор ингибитора плазменной протеазы С1 Икс
P05156 Дополняющий фактор I предшественник Икс
P05413 Жирная кислота, связывающая белковое сердце Икс
P05452 Препарат Тетрантектина TN Икс Икс
P05787 Цитоскелет типа II кератина Икс
P06396 Gelsolin Икс Икс Икс Икс
P06576 Субстрат субъединицы АТФ бета-митохондриального предшественника Икс Икс
P06732 Тип креатинкиназы M Икс Икс
P06733 Альфа-энолаза Икс Икс Икс Икс
P06753 Тропомиозиновая альфа-3-цепь Икс Икс
P07108 Ацил-СоА-связывающий белок Икс
P07195 L-лактатдегидрогеназа B-цепь Икс Икс Икс
P07196 Нейрофиламентный легкий полипептид Икс
P07197 Полипептид среды нейрофиламента Икс Икс
P07237 Препарат предшественника дисульфида протеина Икс Икс
P07339 Препарат катепсина D Икс Икс
P07355 Приложение А2 Икс Икс Икс Икс
P07360 Компонент предшественника гамма-цепи компонента C8 Икс
P07437 Бета-цепь тубулина Икс Икс Икс Икс
P07585 декорин Икс Икс Икс Икс
P07737 Профилин 1 Икс
P07858 Препарат катепсина В Икс
P07900 Белки теплового шока HSP 90 alpha Икс Икс
P07951 Бета-цепь тропомиозина Икс
P07954 Митохондриальный предшественник фумарата гидратазы Икс
P07996 Тромбоспондин 1 Икс Икс Икс
P08107 Тепловой удар 70 кДа белка 1А 1В Икс Икс Икс Икс
P08123 Коллаген альфа 2 I цепи Икс Икс Икс Икс
P08133 Приложение А6 Икс Икс
P08238 Теплый белок HSP 90 beta Икс Икс
P08253 Препарат коллагеназы типа IV типа 72 кДа Икс
P08294 Внеклеточная супероксиддисмутаза Cu Znursor Икс Икс Икс
P08590 Миозиновый легкий полипептид 3 Икс Икс
P08603 Фактор комплемента H Икс Икс Икс Икс
P08670 Виментин Икс Икс Икс Икс
P08729 Цитоскелет II типа кератина Икс
P08758 Приложение А5 Икс Икс Икс Икс
P09211 Трансплантация глутатиона S P Икс Икс Икс
P09382 Галектин 1 Икс Икс Икс
P09417 Дигидроптеридинредуктаза Икс
P09493 Тропомиозин 1 альфа-цепь Икс Икс
P09525 Приложение А4 Икс Икс
P09651 Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин A1 Икс
P09871 Дополнитель субкомпонента комплемента C1s Икс
P09936 Ubiquitin карбоксильный терминал гидролаза isozyme L1 Икс
P09972 Фруктоза-бисфосфат-альдолаза C Икс
P0C0L4 Дополнение C4 A-предшественник Икс
P0CG05 IgЛямбда 2 цепи С Икс
P0CG38 POTE анкирин домен член семьи I Икс
P10515 Дигидролипоиллизиновый остаток ацетилтрансферазного компонента комплекса пируватдегидрогеназы Икс
P10768 S формилглютатионгидролаза Икс
P10809 60 кДа митохондриального предшественника белка теплового шока Икс
P10909 Clusterin Икс Икс Икс Икс
P10915 Гиалуронан и протеогликан связывают белок 1-предшественник Икс Икс
P11021 78 кДа гБелковый регулируемый белок Икс Икс Икс
P11047 Предшественник субъединицы ламинина 1 Икс
P11142 Тепловой удар соответствует 71 кДа белка Икс Икс Икс Икс
P11177 Пируватдегидрогеназа E1 субъединица бета-митохондриального предшественника Икс
P11217 Мышечная форма гликогенфосфорилазы Икс
P11310 Среднеконтактный ацил-CoA-дегидрогеназа-митохондриальный предшественник Икс
P11413 Глюкоза-6-фосфат-1-дегидрогеназа Икс
P11766 Алкогольная дегидрогеназа класса 3 chi chain Икс
P12036 Нейрофиламентный тяжелый полипептид Икс
P12109 Цепочка коллагена альфа 1 VI Икс Икс Икс Икс
P12110 Цепочка коллагена альфа 2 VI Икс Икс Икс Икс
P12111 Цепочка коллагена альфа 3 VI Икс Икс Икс
P12277 Тип креатинкиназы B Икс
P12429 Приложение А3 Икс Икс
P12814 Альфа-актинин 1 Икс Икс
P12829 Миозиновый легкий полипептид 4 Икс
P12882 Миозин 1 Икс
P12883 Миозин 7 Икс Икс
P12955 Дипептидаза Xaa Pro Икс
P13489 Ингибитор рибонуклеазы Икс
P13533 Миосин 6 Икс Икс
P13611 Экспериментальный предшественник первичного белка Икс Икс
P13639 Коэффициент удлинения 2 Икс
P13716 Дегидратаза дельта аминолевулиновой кислоты Икс
P13796 Пластин 2 Икс
P13804 Экспрессия субъединицы альфа-митохондриального субъединицы транскрипта Икс
P13929 Бета-энолаза Икс Икс
P14136 Глиальный фибриллярный кислый белковый астроцит Икс
P14314 Препарат субъединицы глюкозидазы 2 Икс
P14550 Алкогольная дегидрогеназа NADP Икс
P14618 Изоферменты пируват-киназы M1 M2 Икс Икс Икс
P14625 </ TD> Препарат эндоплазмина Икс Икс
P15121 Альдезоредуктаза Икс
P15259 Фосфоглицериновая мутация 2 Икс
P16152 Карбонилредуктаза NADPH 1 Икс
P17066 Тепловой удар 70 кДа белка 6 Икс Икс Икс
P17174 Аспартат аминотрансфераза цитоплазматическая Икс
P17540 Креатин-киназный саркоммерный митохондриальный предшественник Икс
P17661 Desmin Икс Икс Икс Икс
P17980 26S-регуляторная субъединица 6A Икс
P17987 T комплексный белок 1 субъединица альфа Икс
P18206 винкулина Икс Икс
P18428 Препарат предшественника липополисахарида Икс
P18669 Фосфоглицериновая мутация 1 Икс
P19105 Контрольная легкая цепь миозина 2 Икс Икс
P19623 Синтеза спермидина Икс
P19652 Альфа-1 кислотный гликопротеин 2-предшественник Икс Икс
P19823 Ингибитор альфа-трипсина тяжелой цепи H2 Икс
P19827 Тяжелая цепь ингибитора альфа-трипсина H1 Икс Икс
P20073 Приложение А7 Икс
P20618 Протеазома субъединица бета-типа 1-предшественник Икс
P20774 Mimecan Икс Икс Икс Икс
P21266 Трансплантация глутатиона S Mu 3 Икс
P21333 Филамин А Икс Икс
P21796 Напряжение, зависимое от анионного белка белка1 Икс
P21810 бигликан Икс Икс Икс Икс
P21980 Протеин глутамин гамма глутамилтрансфераза 2 Икс Икс
P22105 Tenascin X Икс Икс
P22314 Ubiquitin активирующий фермент E1 Икс
P22352 Препарат глутатионпероксидазы 3 Икс Икс
P22626 Гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины A2 B1 Икс
P22695 Ubiquinol цитохром c редуктазы комплексный основной белок 2 митохондриальный предшественник Икс
P23141 Препарат печени карбоксиэстеразы 1 Икс
P23142 Фибулин 1 Икс Икс Икс Икс
P23284 Префект пептидилпролилцис-транс-изомеразы В Икс
P23381 Триптофанильная тРНК-синтетаза цитоплазматическая Икс
P23526 Adenosylhomocysteinase Икс Икс
P23528 Кофилин 1 Икс
P24752 Ацетил-CoA-ацетилтрансфераза митохондриального предшественника Икс
P25311 Цинк альфа 2 гликопротеидN предшественник Икс
P25705 АТФ-синтазная субъединица альфа-митохондриальная Икс
P25788 Протеасома субъединица альфа-типа 3 Икс Икс
P25789 Протеасома субъединица альфа-типа 4 Икс
P26447 Протеин S100 A4 Икс
P27348 14 3 3 белка тета Икс Икс
P27797 Предшественник калькретинулина Икс
P28066 Протеасома субъединица альфа-типа 5 Икс
P28070 Икс Икс
P28072 Протеасома субъединица бета-типа 6-предшественник Икс
P28074 Препарат предшественника бета-типа 5 протеасомы Икс
P28331 NADH убиквинон-оксидоредуктаза 75 кДа субъединица митохондриального предшественника Икс
P28838 Цитозол аминопептидаза Икс
P29218 Иноситол монофосфатаза Икс
P29401 транскетолаза Икс
P29692 Коэффициент удлинения 1 дельта Икс
P29966 Миристоилированный аланин-богатый C-киназный субстрат Икс
P30040 Эндоплазматический ретикулярный белок ERp29-предшественник Икс
P30041 Пероксиредоксин 6 Икс Икс
P30043 Флавин-редуктаза Икс
P30044 Пероксиредоксин 5 митохондриальный предшественник Икс
P30085 Киназа UMP CMP Икс
P30086 Фосфатидилэтаноламинсвязывающий белок 1 Икс
P30101 ПротейN дисульфид-изомераза A3-предшественник Икс Икс Икс
P30613 Пироват-киназные изозимы RL Икс
P30740 Ингибитор лейкоцитарной эластазы Икс
P31025 Препарат липокалина 1 Икс
P31937 3 митохондриального предшественника гидроксиизобутиратдегидрогеназы Икс
P31942 Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин H3 Икс
P31943 Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин H Икс
P31946 14 3 3 белок beta alpha Икс Икс
P31948 Стресс-индуцированный фосфопротеин 1 Икс
P31949 Протеин S100 A11 Икс
P32119 Пероксиредоксин 2 Икс Икс
P34931 Тепловой удар 70 кДа белка 1, как Икс Икс
P34932 Тепловой удар 70 кДа белка 4 Икс
P35232 прохибитин Икс
P35237 Serpin B6 Икс
P35443 Тромбоспонпин 4 Икс
P35555 Фибриллин 1 Икс Икс
P35579 Миозин 9 Икс Икс Икс
P35580 Миозин 10 Икс Икс
P35609 Альфа-актинин 2 Икс
P35625 Ингибитор металлопротеиназы 3 Икс Икс
P35998 26S-регуляторная субстанция 7 Икс
P36871 Фосфоглюкомутаза 1 Икс Икс
P36955 Фактор, вызванный пигментным эпителием Икс Икс
P37802 Икс Икс
P37837 трансальдолазы Икс
P38117 Транспондерная субъединица флавопротеинов переноса электронов бета Икс
P38646 Претендент митохондриального протеина 70 стресса Икс Икс
P39687 Кислотный лейцин-богатый ядерный фосфопротеин 32 член семьи A Икс
P40121 Макрофаговый укупоривающий белок Икс
P40925 Малетодегидрогеназа цитоплазматическая Икс
P40926 Митохондриальный предшественник малетдегидрогеназы Икс
P41219 Peripherin Икс
P42330 Семейство Aldo keto reductase 1 член C3 Икс
P45880 Напряжение, зависящее от анионного избирательного канала белка 2 Икс
P47755 F-актин-укупорочная белковая субъединица альфа-2 Икс Икс
P47756 F-актин-укупорочный белок субъединицы бета Икс Икс
P47985 Ubiquinol цитохром c редуктазы субстрата субъединицы железа, митохондриального предшественника Икс
P48047 Субстрат митохондриальной субъединицы АТФ-синтазы Икс
P48637 Глутатионсинтетаза Икс
P48741 Тепловой удар 70 кДа белка 7 Икс Икс
P49189 4 триметиламинобутиральдегиддегидрогеназа Икс
P49368 T комплексный белок 1 субъединица гамма Икс
P49747 Хлорированный олигомерный матричный белок Икс Икс Икс Икс
P49748 Очень длинноцепочечный ацил-CoA-дегидрогеназа-митохондриальный предшественник Икс
P50395 Rab ингибитор диссоциации Икс х </ TD>
P50454 Предшественник Serpin H1 Икс
P50995 Приложение А11 Икс
P51452 Двойная специфическая белковая фосфатаза 3 Икс
P51884 люмикан Икс Икс Икс Икс
P51888 Проларгин-предшественник Икс Икс Икс Икс
P52565 Ингибитор диссоциации Rho ВВП 1 Икс
P52566 Ингибитор диссоциации Rho ВВП 2 Икс
P54652 Связанный с тепловым шоком 70 кДа белок 2 Икс Икс Икс Икс
P55072 Переходная эндоплазматическая ретикулярная АТФаза Икс
P55083 Микрофибрил ассоциированный гликопротеин 4 предшественник Икс Икс
P57053 Histone H2B тип F Икс
P60174 Триозофосфатная изомераза Икс Икс Икс
P60660 Миозиновый легкий полипептид 6 Икс Икс
P60709 Актин цитоплазматический 1 Икс Икс Икс Икс
P60981 Destrin Икс
P61086 Конъюгирующий фермент Ubiquitin E2 25 кДа Икс
P61088 Конъюгирующий фермент Ubiquitin E2 Икс
P61224 Ras-связанный белок Rap 1b-предшественник Икс
P61978 Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин К Икс Икс
P61981 14 3 3 белка гамма Икс Икс Икс
P62258 14 3 3 белок эпсилон 14 3 3E Икс
P62491 Расовый белок Икс
P62714 Сыворотка треонина белковая фосфатаза 2А каталитическая субъединица бета-изоформа Икс
P62736 Актив аортальная гладкая мышца Икс Икс Икс
P62805 Histone H4 Икс
P62826 GTP-связывающий ядерный белок Ran Икс
P62873 Гуаниновый нуклеотидный связывающий белок GIGSGT субъединица бета 1 Икс
P62879 Гуаниновый нуклеотидный связывающий белок GIGSGT субъединица бета 2 Икс
P62937 Пептидилпролилцис-транс-изомераза А Икс Икс
P62987 Ubiquitin 60S рибосомальный белок L40 Икс
P63104 14 3 3 proTein zeta delta Икс Икс Икс Икс
P63241 Фактор инициации эукариотического трансляции 5A 1 Икс
P63244 Гуаниновая нуклеотидная связывающая белковая субъединица бета 2, как 1 Икс
P63267 Актин-гамма-кишечная гладкая мышца Икс Икс
P67936 Тропомиозиновая альфа-4-цепь Икс
P68032 Актина альфа-сердечная мышца 1 Икс
P68104 Коэффициент удлинения 1 альфа 1 Икс Икс Икс
P68133 Актина альфа-скелетная мышца
P68363 Тубулин альфа-1B-цепь Икс Икс Икс
P68371 Целлюлоза бета 2C Икс Икс Икс
P68402 Активирующий фактор тромбоцитов ацетилгидролаза IB субъединица бета Икс
P68871 Гемоглобин субъединицы бета Икс Икс Икс
P69905 Гемоглобиновая субъединица альфа Икс Икс
P78371 T комплексный белок 1 субъединица бета Икс
P78417 Глутатионтрансфераза омега 1 Икс Икс
P80748 Ig лямбда-цепь VIII регион LOI Икс
P98095 Фибулин 2 Икс Икс
Q01082 Цепь бета-цепи Spectrin 1 Икс
Q01449 Контрольная легкая цепь миозина 2 изоформы предсердий Икс
Q01518 Связанный с аденилилциклазой белок 1 Икс
Q01995 Трансгелин Гладкий мышечный белок 22 альфа Икс
Q03252 Ламин B2 Икс Икс
Q03591 Фактор комплемента фактора H, связанный с белком 1 Икс
Q04917 14 3 3 белок eta Икс Икс
Q06323 Субстрат комплекса активатора протеасомы 1 Икс
Q06828 Фибромодулин Икс Икс Икс Икс
Q06830 Пероксиредоксин 1 Икс Икс
Q07507 Dermatopontin Икс Икс Икс Икс
Q07960 Rho GTPase-активирующий белок 1 Икс
Q08257 Хиноноксидоредуктаза Икс
Q08431 Lactadherin Икс Икс
Q12765 SEcernin 1 Икс
Q13011 Delta 3 5 Delta 2 4 диеноил-CoA-изомераза митохондриальный предшественник Икс Икс
Q13228 Селенсвязывающий белок 1 Икс Икс
Q13404 Конъюгирующий фермент Ubiquitin E2 вариант 1 Икс
Q13409 Цитоплазматическая динеин 1 промежуточная цепь 2 Икс
Q13509 Тубулин бета-3-цепь Икс Икс Икс
Q13642 Четыре с половиной белка LIM белка 1 Икс
Q13765 Связанная с полипептидом комплексная субъединица альфа Икс
Q13885 N-тубулин бета-2А-цепь Икс Икс
Q14194 Связанный с дигидропиримидазой белок 1 Икс
Q14195 Связанный с дигидропиримидазой белок 3 Икс Икс Икс Икс
Q14624 Препарат H4 тяжелой цепи ингибитора альфа-трипсина Икс
Q14697 Нейтральная альфа-глюкозидаза AB-предшественник Икс
Q14764 Основной белок-хранилище Икс
Q14767 Скрытый трансформирующий фактор роста бета-связывающий белок 2 Икс Икс
Q14894 Mu crystalin homolog NADP регулирует тиреоидный гормон-связывающий белок Икс
Q15063 Перистиновый предшественник Икс Икс Икс Икс
Q15084 Прекурсор предшественника дисульфид-изомеразы белка A6 Икс
Q15113 Проколлаген C энтопептидаза-энхансер 1 предшественник Икс
Q15181 Неорганическая пирофосфатаза Икс
Q15365 Полиинверсионный белок 1 Икс
Q15366 Полиинверсионный белок 2 Икс
Q15582 Трансформирующий белок, индуцированный бета-фактором роста Икс Икс Икс
Q15819 Конъюгирующий фермент Ubiquitin E2 вариант 2 Икс
Q16352 Альфа-интернейсин Икс
Q16473 Предполагаемый tenascin XA Икс
Q16555 Связанный с дигидропиримидазой белок 2 Икс Икс Икс
Q16698 2 4 митохондриального предшественника диеноил-CoA-редуктазы Икс
Q16891 Митохондриальная внутренняя мембрана Икс
Q562R1 Бета-актин, как белок 2 Икс
Q6S8J3 POTE член семьи ankyrin член E Икс
Q6UWY5 Олфактомедин, как белок 1, предшественник Икс Икс
Q71U36 Тубулин альфа-1А-цепь Икс Икс Икс
Q7Z7G0 Цель предшественника Nesh SH3 Икс Икс Икс
Q8WUM4 Запрограммированный клеточный гибель 6 взаимодействующих белков Икс
Q8WWX9 Тиоредоксин, как предшественник селенопротеина М Икс
Q92597 Белки NDRG1 Икс
Q92945 Фармацевтический белок 2 Икс
Q96CN7 Область Isochorismatase, содержащая белок 1 Икс
Q96CX2 BTB POZ домен, содержащий белок Икс
Q96KK5 Histone H2A тип 1 H Икс Икс
Q96KP4 Цитозольная неспецифическая дипептидаза Икс
Q99426 Тубулин специфический шаперон B Икс
Q99497 Протеиновый DJ 1 Икс Икс
Q99536 Синаптический мембранный белок пузырьков Икс Икс Икс
Q99714 3 гидроксиацил-CoA-дегидрогеназа типа 2 Икс
Q99715 Коллаген альфа 1 XII цепь Икс Икс
Q99798 Митохондриальный предшественник аконата гидратазы Икс
Q9BQE3 Тубулин альфа-6-цепь Икс
Q9BUF5 Тубулин бета 6 цепь Икс Икс
Q9BUT1 3 гидроксибутиратдегидрогеназы типа 2 Икс
Q9BVA1 Тубулин бета-2B-цепь Икс Икс Икс
Q9BXN1 Asporin Икс х </ TD> Икс Икс
Q9H0W9 Эфирная гидролаза C11orf54 Икс
Q9H4B7 Тубулин бета 1 цепь Икс
Q9NRN5 Олфактомедин, подобный предшественнику белка 3 Икс Икс
Q9NRV9 Хемсвязывающий белок 1 Икс
Q9NSB2 Кутикулярный кубик типа Кератин Hb4 Икс Икс
Q9NVA2 Септик 11 Икс
Q9UBR2 Препарат катепсина Z Икс
Q9UBX5 Фибулин 5 Икс Икс
Q9UK22 F box только белок 2 Икс
Q9Y277 Зависимый от напряжения анион-избирательный белок канала 3 Икс
Q9Y281 Кофилин 2 Икс
Q9Y490 Талин 1 Икс
Q9Y696 Хлоридный внутриклеточный протеин 4 Икс
Q9Y6C2 EMILIN 1 Икс Икс

Таблица 1: Список белков, идентифицированных в экстракте ткани митрального клапана при применении четырех различных протеомических подходов: двухмерный электрофорез (2-DE), двумерный LC-MS E (2D-LC / MS E ), LC / MS E и жидкофазный IEF. Сообщается о способе идентификации каждого белка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Одним из важных шагов этого протокола является использование жидкого азота для замораживания образца и охлаждения системы измельчителя. Использование жидкого азота предотвращает биологическую деградацию и позволяет эффективно напылять, но требует специальной подготовки для безопасного обращения.

В этом протоколе представлена ​​система измельчителя для шлифования образцов, поскольку небольшие образцы трудно восстановить из стандартных растворов и пестиков. В этом случае небольшие образцы распространяются как мелкий порошок поверх поверхности раствора, что затрудняет сбор. Другим преимуществом является то, что измельчитель моторизирован, что позволяет обрабатывать большее количество образцов воспроизводимым образом и без дополнительной усталости. Одно ограничение на использование дробилки заключается в том, что размер образца, который должен быть небольшим (100 мг или менее) для пестика, эффективно прижиматься к ступке. Кроме того, компоненты шлифовального станка должны быть нагреты до комнатной температуры между использованием для очистки г. Следовательно, процедура занимает много времени, и, если многие образцы обрабатываются ежедневно, требуется множество наборов.

Дополнительным критическим шагом является подготовка экстракционного буфера. Концентрации соли, особенно для мочевины (8 М) и тиомочевины (2 М), довольно высоки; Таким образом, объем соли составляет почти половину общего объема раствора. Кроме того, растворение нелегко, учитывая, что необходимо избегать тепла, поскольку при температуре выше 37 ° C мочевина может приводить к карбамилированию белков на N концах белков / пептидов и в аминогруппах боковой цепи лизиновых и аргининовых остатков 17 , После растворения буфер мочевины должен быть отфильтрован фильтрами 0,22 мкм и может храниться при -80 ° C в течение 4 недель, не влияя на его эффективность экстракции, но перед использованием его необходимо нагревать до более чем 15 ° C, чтобы обеспечить полное растворение ,

Модификации и устранение неполадок

В этом протоколе экстракция белка выполняется с использованием описанного буфера мочевины, потому что он является одним из наиболее часто используемых растворов для экстракции белков для протеомических исследований из-за его совместимости с изоэлектрофокусировкой и его эффективности при солюбилизации малорастворимых белков 18 . Продемонстрировал, что этот буфер может очень эффективно солюбилизировать малорастворимые белки, такие как интегральные мембранные белки 19 , или белки, которые сильно подвержены агрегации, такие как тубулин 18. Кроме того, этот буфер полностью совместим с анализом Брэдфорда для определения концентрации белка и Его можно использовать непосредственно в анализах 2-DE и жидкофазном IEF.

Однако этот буфер не идеален для солюбилизации всех белков, присутствующих в образце. Возможно, что различные экстракционные буферы могут выявлять белки, не поддающиеся определению по этому протоколу. Например, это хорошо knoWn, что рибосомные и ядерные белки можно было бы лучше экстрагировать кислотной экстракцией или осаждением трихлоруксусной кислоты / ацетона 20 , тогда как щелочные уровни рН более подходят для мембранных белков 21 , 22 . Поэтому использование альтернативных буферов может потребовать дополнительных шагов для осаждения белка для устранения солей, которые препятствуют 2-DE или жидкофазной IEF.

Ограничения техники

Количество белков, идентифицированных по этому протоколу, относительно невелико, но количество идентификаций и охват протеомного анализа может быть дополнительно увеличено за счет использования более современных инструментов, чья точность и скорость секвенирования значительно увеличились за последние несколько лет 23. Можно покрыть большую часть протеома без каких-либо шагов префракционирования, используя длинный градиент для жидкого chРазделение роматографии в сочетании с прибором MS высокого разрешения, который имеет быструю скорость 24 секвенирования.

Значение метода в отношении существующих / альтернативных методов

Способность идентифицировать и количественно определять белки в сердечных клапанах человека, таких как митральный клапан, является важной и сложной задачей, которая поможет выявить механизмы физиологических / патологических процессов при заболеваниях клапанов. Определение изменений протеома митрального клапана значительно увеличит понимание природы биологических процессов, связанных с болезненным состоянием ткани.

Современные знания о физиопатологии митрального клапана ограничены и обычно получают путем анализа отдельных белков, участвующих в конкретных процессах, таких как ремоделирование внеклеточного матрикса, гемостаз, воспаление или окислительный стресс 25 9 , 10 .

Отсутствие всесторонних протеомных исследований может быть связано со сложностью этой ткани с низкой клеткой, которая богата белками внеклеточного матрикса ( т.е. протеогликанами, коллагеном и эластином). Эти белки составляют около 80% от общего количества, что затрудняет анализ белков с низким уровнем обилия 26 .

Таким образом, необходимо было установить эффективный протокол экстракции, чтобы максимизировать солюбилизацию белка для описания протеома этой ткани. Этот протокол позволил выделить 50 мкг белка из 1 мг ткани. Это относительно низкий выход по сравнению с «мягкой» тканью, такойКак печень (~ 135 мкг из 1 мг ткани), но достаточно выполнить анализ белка на отдельных образцах. Это особенно актуально при определении внутриличностной изменчивости явления.

Кроме того, этот метод имеет то преимущество, что он совместим со многими аналитическими приложениями. Белки митрального клапана, растворенные в предлагаемом экстракционном буфере, могут быть непосредственно использованы для иммуноблоттинга и протеомического анализа на основе двумерного электрофореза и изоэлектрофореза в жидкой фазе 11 , 12 или после осаждения белка для устранения интерференции буферных компонентов для других анализов, таких как Масс-спектрометрия без геля 15 .

С применением этого протокола экстракции более полная характеристика белковых компонентов нормальной ткани митрального клапана была получена путем идентификации многих внутрицепочечных. Эти белки локализуются в цитозоле или органеллах не только во внеклеточном матриксе, но и имеют различные молекулярные и биологические функции. Также были идентифицированы другие интересные белки ( например, CryAB, септин-11, FHL-1 и дерматопонтин). Эти белки имеют неизвестные функции в митральном клапане, но их биологические свойства указывают на возможную роль в заболеваниях клапанов.

Будущие приложения или направления после освоения этой техники

С помощью этого протокола можно сопоставить данные об экспрессии белка с данными о количественной экспрессии мРНК и не количественных иммуногистохимических анализах. Действительно, при совместном использовании эти подходы приведут к более полному пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе болезни, от мРНК до посттрансляционной модификации белка. Таким образом, этот метод может представлять интерес для исследователей, ориентированных на физиопатологию сердечного клапана. ПлавникЭтот протокол также может быть применен к митральному клапану свиньи, который имеет близкое сходство с человеческим клапаном 27 и используется в качестве экспериментальной модели для оценки функции клапана.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Министерство здравоохранения Италии поддержало это исследование (RC 2013-BIO 15). Мы благодарим Барбару Мишели за ее отличную техническую помощь.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5, (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422, (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4, (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62, (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104, (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15, (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38, (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9, (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193, (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85, (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37, (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18, (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21, (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2, (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93, (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10, (8), M110.003699 (2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151, (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118, (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53, (5), 432-438 (2014).
Оптимизированный протокол для извлечения белков из митрального клапана человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).More

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter