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Biochemistry

ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化プロトコル

doi: 10.3791/55762 Published: June 14, 2017

Summary

ヒト僧帽弁のタンパク質組成は、未分化であり、その分析は細胞密度が低く、したがって低タンパク質生合成によって複雑であるため、まだ未知である。この研究は、僧帽弁プロテオームの分析のためにタンパク質を効率的に抽出するためのプロトコールを提供する。

Abstract

細胞のプロテオームの解析は、複雑な生物システムに存在するタンパク質の大規模な同定と定量を可能にする技術の開発による疾患の根底にある分子メカニズムを解明するのに役立ちます。プロテオームアプローチから得られた知識は、疾病の根底にある病原性メカニズムをより良く理解し、新規の診断および予後の疾患マーカーの同定を可能にする。しかし、心臓僧帽弁は、プロテオグリカンおよびコラーゲン富化細胞外マトリックスの細胞性が低いため、プロテオーム分析のための非常に困難なサンプルである。これは、全体的なプロテオーム分析のためにタンパク質を抽出することを困難にする。この研究は、定量的プロテオミクスおよびイムノブロッティングのような後続のタンパク質分析と互換性のあるプロトコールを記載する。これにより、データの関連性を考慮することができますgタンパク質の発現を、定量的mRNA発現および非定量的免疫組織化学的分析に関するデータと比較した。実際、これらのアプローチは、一緒に実施されると、mRNAから翻訳後タンパク質改変まで、疾患の根底にある分子メカニズムのより包括的な理解につながるであろう。したがって、この方法は、心臓弁の生理病理学の研究に関心のある研究者に関連する可能性がある。

Introduction

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最近の証拠は、mRNA合成後に生じる多くの調節機構の役割の理解を変化させている。実際、翻訳、転写後およびタンパク質分解プロセスは、タンパク質の存在量および機能を調節することができる。転写産物レベルがタンパク質存在量の主な決定因子であると仮定して、mRNA濃度が対応するタンパク質のプロキシであると言うドグマは部分的に改訂されている。細胞1,2内のタンパク質を調節するために起こる。

さらに、タンパク質は最終的に細胞の機能を決定し、したがって自己分泌、傍分泌および内分泌因子に応答して動的変化を起こすことができるその表現型を指示する。血液媒介メディエーター;温度;薬物治療;病気が発症する。このように、タンパク質レベルに焦点を当てた発現解析は、プロテオームの特徴を明らかにするとともに、疾患病因の一部として起こる重大な変化を解明するのに有用である3

したがって、既存の技術的課題にもかかわらず、プロテオミクスが健康状態や病状を明らかにする機会が大いにあります。プロテオミクスが貢献できる研究の特に有望な分野には、以下のものが含まれる:任意のレベル( すなわち、細胞全体または組織、細胞内コンパートメントおよび生物学的液体)におけるタンパク質発現の変化の同定;疾患の診断および予後に有用な新規なバイオマーカーの同定、検証および検証;薬効と毒性の評価だけでなく、治療目的でも使用できる新しいタンパク質標的の同定4

複雑さを捉えるプロテオームは技術的な課題である。現在のプロテオミクスツールは、変化したタンパク質レベルの同定、定量化、および検証のための大規模で高スループットの分析を行う機会を提供する。さらに、最も豊富なタンパク質によって引き起こされる干渉を回避することを目的とする分画および濃縮技術の導入は、最も豊富でないタンパク質を含むことによってタンパク質同定を改善した。最後に、プロテオミクスは、タンパク質機能の重要なモジュレーターとして徐々に出現する翻訳後修飾の分析によって補完されてきた。

しかし、分析中の生物標本における試料調製およびタンパク質回収は、プロテオミクスのワークフローにおける制限的なステップのままであり、潜在的な落とし穴の可能性を高めます5 。実際、最適化されなければならない分子生物学技術の大部分において、最初のステップは、組織ホモジナイズイオンおよび細胞溶解、特に増幅方法が存在しない低濃度のタンパク質の分析中に起こる。さらに、タンパク質の化学的性質は、それら自身の回復に影響を及ぼす可能性がある。例えば、高度に疎水性のタンパク質の分析は、等電点電気泳動の間に容易に沈殿するため、膜貫通タンパク質はほとんど不溶性であるため、非常に難しい(参考文献5で検討されている)。さらに、組織組成の変動性は、普遍的な抽出方法を開発する上で重要な障壁となる。最後に、臨床検体のほとんどすべてが限られているため、最小限の検体量で最大の回収率と再現性でタンパク質を調製することが不可欠です。

この研究は、プロテオーム分析のための非常に困難なサンプルである、正常ヒト心臓僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化されたプロトコールを記載する。正常な僧帽弁は、心臓の左心房と左心室との間に横たわるレックス構造( 図1 )。心房から心室への血流を制御し、逆流を防止し、全身への適正な酸素供給を保証し、それによって十分な心拍出量を維持するのに重要な役割を果たす。しかし、それはしばしば細胞性が低く、主に細胞外マトリックス中の成分が少ない「不活性」組織であると考えられている。これは、正常な状態では、常在性の弁間質細胞(VIC)が低いタンパク質生合成速度で静止表現型を示すためである7

しかしながら、病理学的状態では、海綿体におけるVICの数が増加し、それらのタンパク質合成が他の機能的および表現型の変化と共に活性化されることが実証されている8 。したがって、驚くべきことではない文献は、増加した数の活性化VICが同定されたタンパク質の比較的高い数を説明し得る病理学的僧帽弁9,10の分析に焦点を当てている。

結論として、本プロトコールは、僧帽弁タンパク質成分の研究を通して、僧帽弁疾患に関与する病原機構の理解を発展させるのに役立つ可能性がある。事実、根底にある病理学的プロセスのより深い理解は、現在の介入適応症が血行力学的考察に主に基づいている弁疾患の臨床管理を改善するのに役立つ可能性がある。

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Protocol

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このプロトコルでは、正常な心エコー検査のパラメーターにかかわらず、技術的または機能的理由のために、臓器移植から除外された多臓器ドナーからの多臓器外植片(4〜12時間の冷虚血時間、平均6±2時間)の間にヒト心臓を収集する。彼らは、大動脈弁および肺動脈弁の銀行業務のために、ミラノの心血管組織バンクMonzino Cardiologic Centre(ミラノ、イタリア)に送られる。僧帽弁後小葉は臨床目的では使用されないので、ドナーの親族からインフォームドコンセントが得られた後、大動脈弁および肺動脈弁の隔離中に収集される。移植および研究のための組織は、親の同意の後にのみ収集される。倫理委員会のガイドラインに従い、人間の臨床使用( すなわち、微生物学的、機能的および血清学的問題)に適していない場合にのみ、同意書上で心臓組織の使用を認可する(またはしない)モンティーノ心臓病センター。

1.僧帽弁の準備

  1. 臓器の外植後(冷虚血時間は4〜12時間)、できるだけ早くヒト僧帽弁を採取する。
  2. クリーンルームでは、冷たい(4℃)溶液( すなわち、生理食塩水または平衡培地EurocollinsまたはWisconsin)を含む輸送用バッグから心臓を取り除く。それをバケツに入れて、バルブの準備を進めるために、バイオセーフティキャビネット(バイオハザード気流、クラスA、グッドマニュファクチャリングプラクティス(GMP)分類)に入れてください。
  3. キャビネット内の滅菌使い捨てドレープに心臓を置きます。滅菌使い捨てメスを使用して、心臓をその主軸に対して垂直に、心尖部から約4cm離れた左右の心室のレベルで完全に切断する。
  4. 左心房の屋根を表示するために、上行大動脈と肺動脈を動かす。
  5. 滅菌オートクレーブ可能な鉗子とピックを使用して、左耳の周りを僧帽弁を目に見えるようにし、大きな僧帽弁尖(前側)と小さい僧帽弁葉(後側)を識別することを可能にする。
    注:前側および後側の交連は、前尖および後部の境界を画定する。
  6. 滅菌オートクレーブ可能なはさみおよび非外傷性の鉗子を使用して、左心房および僧帽弁全体の周囲の心室壁の厚さを切開する
  7. 大動脈弁の連続性を確認する。
    注:左心室には、僧帽弁全体と腱索が含まれています。
  8. 前僧帽弁小葉を後僧帽弁小葉から分離し、後尖を脳室の挿入に沿って切断する(交連)。
  9. 生理食塩水中の後弁膜を洗浄する。リーフレットを小片(<1 cm 2 )に切断し、個々にアルミホイルで包んでください。液体窒素でそれらをスナップフリーズする
    注意:液体窒素を使用する場合は、組織の安全手順に従ってください。
    1. 手順の最後に、70%イソプロピルアルコール溶液と6%過酸化水素水でキャビネットのテーブルを衛生化してください。

2.タンパク質抽出

  1. 鉗子を使用して、液体窒素に保存されたサンプルをピックアップし、直ちにアルミ箔に包みながらドライアイス上に置きます。移送中にサンプルを融解させないでください。
  2. 粉砕する前に、液体窒素(約500mL)を入れたDewarフラスコに入れることによって、粉砕システム( 例えば、 CryoGrinder)の磁器/ジルコニウムモルタルおよび乳棒を試料とともに冷やす。
    注意:液体窒素を使用するときは、組織の安全手順に従ってください。
  3. ドライアイスを入れたポリスチレンボックスに乳鉢と乳棒を入れます。サンプルをアルミホイルから取り出し、モルタルに入れます。
  4. グラインドt彼は乳棒を回転させるためにドライバーを使用して、モルタルに対して大きな乳棒で15-20回サンプリングします。粉砕プロセスの間、予め冷却したスパチュラの先端と試料を混合する。
    1. 小さな乳棒で繰り返します。
  5. チューブを反転させ、モルタルの上に置き、それらを一緒に反転させてサンプルをチューブに移動させることによって、前に計量したチューブ( 例えば、 15mL遠心チューブ)に地上サンプルを移す。予備冷却されたスパチュラを使用して、モルタルからすべての材料を回収する。
    1. 移送中のサンプル解凍を避けるために、サンプルをドライアイス上に置いてください。
  6. サンプルの正味重量を計算する。
  7. 各サンプルの後に乳鉢と乳棒をきれいにし、オートクレーブまたは200°Cで2時間加熱することによってそれらを除染する。
  8. 粉末サンプルを遠心分離管からホモジナイザーのガラス管に転倒させて移す。
  9. ろ過された尿素バフを加える10mgの粉末組織につき200μLの尿素緩衝液をガラス管に添加した(8M尿素、2Mチオ尿素、4%w / v CHAPS、20mMトリス、および55mMジチオトレイトール)。
    注記:遠心チューブに残っている残留粉末サンプルは、計算された量の尿素バッファーの一部を使用して回収することができます。
  10. ホウケイ酸ガラス乳鉢およびポリテトラフルオロエチレン(PTFE)乳棒を備えた撹拌機を用いて試料を均質化する。サンプルをゆっくりと捻るような動き(1,500 rpm)で10回押します。
  11. 上清を回収し、それを清潔な1.7mL遠心管に移す。新たな尿素緩衝液で残りの試料を再度抽出し、最初の抽出の間に使用した容量の半分を加える。
  12. 手順2.10を繰り返します。
  13. 上清を回収し、それをステップ2.11の上清と合わせる。合わせた上清をチューブローテーター上に30分間置く。
  14. 13,000 xgおよび4℃で30分間チューブを遠心分離する。
  15. 上清を回収するBradfordタンパク質アッセイを用いて、製造業者の指示に従ってタンパク質濃度を測定する。サンプルを使用するまで-80℃で保存します。

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Representative Results

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ウレア緩衝液中のタンパク質の抽出および溶解は、等電点電気泳動(2次元電気泳動(2-DE) 11および液相等電点電気泳動(IEF) 12 )に基づくプロテオーム法およびLaemmli緩衝液13での希釈後のイムノブロッティングプロテアーゼ阻害剤カクテル14を含有する。

ゲルフリー質量分析法( すなわち、データ非依存性質量分析(LC / MS E )および2次元LC / MS E (2D-LC / MS E )に結合された液体クロマトグラフィー)尿素およびチオ尿素を除去するためにさらに処理される必要があり、これはその後のタンパク質消化および液体クロマトグラフィー分離を妨害する可能性がある。ティ市販のタンパク質沈殿キットを使用して、タンパク質を沈殿させるための製造者の指示に従って達成することができる。次いで、タンパク質消化のために0.1%切断可能な界面活性剤を含む25mM NH 4 HCO 3にサンプルを溶解することができる16 。タンパク質の沈殿は、タンパク質成分(タンパク質回収率> 85%)に最小限の影響を及ぼす緩衝成分を排除することができ、試料をあらゆる種類の分析に適したものにする。

ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のためのこのプロトコールの適用は、先に詳細11,15に記載された4つの異なるプロテオミクスアプローチを組み合わせて、合計422個のタンパク質の同定を可能にした。具体的には、2-DEにより169個のタンパク質、液相IEFにより330個のタンパク質、LC / MS Eにより96個のタンパク質、148個のタンパク質2D-LC / MS Eにより分析した(表1)。

細胞内局在に関して422個の同定されたタンパク質を分類するために、遺伝子オントロジー(GO)分析( 例えば、 Cytoscape)のためにソフトウェアを使用した。ソフトウェアおよび対応するプラグインを用いて作製したネットワークは、細胞外領域に局在する予想されるタンパク質( 図2の右上の部分を参照 )以外にも、プロテオミクスアプローチによって同定されたタンパク質のほとんどが細胞内領域( すなわち、細胞質、細胞小器官、小胞、および細胞骨格)。細胞表面タンパク質も同定された( 図2 )。

3つの独立した僧帽弁サンプルで結果をさらに確認した。免疫ブロッティングを用いて、4つのタンパク質( すなわち、セプチン-11,4半分のLIMドメインタンパク質1(FHL-1)、derマトポンチン、およびアルファ - クリスタリンB(CryAB))が含まれる( 図3 )。

図1
図1:僧帽弁構造。閉じた( A )または開いた( B )ヒト僧帽弁を示す人間の心臓の上面図。人間の心臓の左心室の正面図( C )。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2
図2:同定された僧帽弁タンパク質の細胞分布の分析。 CytoscapeとプラグインBiNGOを使用してobtain細胞成分カテゴリーからの遺伝子オントロジ(GO)の分布。円の大きさは、選択されたGO項に関連するタンパク質成分の数に比例し、過剰表現のp値のカラースケールが報告される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3
図3:3つのヒト正常僧帽弁尖からの全抽出物中のセプチン-11、FHL-1、デルマトポンチンおよびCryABのイムノブロッティング分析。免疫ブロッティングは、CryABに対するマウスモノクローナル抗体およびセプチン11、FHL-1およびデルマトポンチン抗体に対するウサギポリクローナル抗体を用いて行った。 お願いしますこの図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。

<td> x <td> <td>プロテアソームサブユニットベータ4型前駆体 <td> </ tr> <td>トランスゲリン2 <td> <tr> <td>
受託 説明 2-DE 2D-LC LC-MS E 液相IEF
A6NMZ7 コラーゲンアルファVI バツ
O00151 PDZおよびLIMドメインタンパク質1 バツ
O00299 塩化物細胞内チャネルタンパク質1 バツ
O00764 ピリドキサールキナーゼバツ
O14558 熱ショックタンパク質β6 バツ
O43399 腫瘍タンパク質D54 バツ
O43488 アフラトキシンB1アルデヒドリダクターゼメンバー2 バツ
O43707 アルファアクチニン4 バツバツ
O43866 前駆体のようなCD5抗原バツ
O60493 Nexin 3の並べ替えバツ
O60701 UDPグルコース6デヒドロゲナーゼバツ
O75223 特徴付けられていないタンパク質バツ
O75368 グルタミン酸に富むSH3ドメイン結合タンパク質バツ
O75390 クエン酸シンターゼミトコンドリア前駆体バツ
O75489 NADH脱水素酵素ユビキノン鉄硫黄タンパク質3ミトコンドリア前駆体バツバツ
O75608 アシルタンパク質チオエステラーゼ1 バツ
O75828 カルボニルレダクターゼNADPH 3 バツ
O75874 イソクエン酸脱水素酵素NADP細胞質バツ
O75955 フロチリンバツ
O94760 NG NGジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ1 バツ
O94788 網膜デヒドロゲナーゼ2 バツ
O95865 NG NGジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ2 バツバツ
P00325 アルコールデヒドロゲナーゼ1B バツバツ
P00338 L乳酸デヒドロゲナーゼA鎖バツ
P00351 網膜デヒドロゲナーゼ1 バツ
P00441 スーパーオキシドジスムターゼCu Zn バツバツ
P00450 セルロプラスミン前駆体バツバツ
P00488 凝固因子XIII鎖前駆体バツ
P00491 プリンヌクレオシドホスホリラーゼバツ
P00492 ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼバツ
P00558 ホスホグリセリン酸キナーゼ1 バツバツ
P00568 アデニル酸キナーゼアイソザイム1 バツ
P00734 プロトロンビンバツバツ
P00738 ハプトグロビンバツバツバツバツ
P00739 ハプトグロビン関連タンパク質前駆体バツ
P00751 補因子B バツバツバツ
P00915 炭酸脱水酵素1 バツ
P00918 炭酸脱水酵素2 バツ
P01008 アンチトロンビンIII前駆体バツバツバツ
p01009 アルファ1アンチトリプシンバツバツバツバツ
P01011 アルファ1アンチキモトリプシンバツバツバツバツ
P01019 アンギオテンシノーゲン前駆体バツバツ
P01023 アルファ2マクログロブリンバツバツ
P01024 補体C3 バツバツバツバツ
P01033 メタロプロテイナーゼ阻害剤1前駆体バツ
P01042 キニノーゲン1前駆体バツ
P01593 Igカッパ鎖VI領域AG バツ
p01598 Igカッパ鎖VI領域EU バツ
P01600 Igカッパ鎖VI領域Hau バツバツ
P01611 Igカッパ鎖VI領域Wes バツ
P01620 Igカッパ鎖V III領域SIE バツ
P01625 Igカッパ鎖V IV領域Len バツ
P01766 Ig重鎖V III領域BRO バツバツ
P01781 Ig重鎖V III領域GAL バツ
P01834 Igカッパ鎖C領域バツバツバツバツ
P01842 Igラムダ鎖C領域バツバツバツ
P01857 Igガンマ1鎖C領域バツバツバツバツ
P01859 Igガンマ2鎖C領域バツバツバツバツ
P01860 Igガンマ3鎖C領域バツバツバツ
P01861 Igガンマ4鎖C領域バツバツバツ
P01871 Igミュー鎖C領域バツバツバツ
P01876 Igα1鎖C領域バツバツバツバツ
P01877 Igアルファ2鎖C領域バツ
P02144 ミオグロビンバツバツ
P02452 コラーゲンアルファ1鎖バツバツバツバツ
P02511 アルファクリスタリンB鎖バツ
P02545 ラミンAC 70kDaラミネートバツバツバツバツ
P02647 アポリポタンパク質AI バツバツバツバツ
P02649 アポリポタンパク質E バツバツバツバツ
P02671 フィブリノーゲンα鎖バツバツバツバツ
P02675 フィブリノゲンベータ鎖バツバツバツバツ
P02679 フィブリノーゲンγ鎖バツバツバツバツ
P02689 ミエリンP2タンパク質バツ
P02735 血清アミロイドAタンパク質前駆体バツ
P02741 C反応性タンパク質前駆体バツ
P02743 血清アミロイドP成分バツバツバツバツ
P02746 補体C1qサブ成分サブユニットB バツバツ
P02747 補体C1qサブ成分サブユニットC前駆体バツ
P02748 補体成分C9 バツバツバツ
P02749 ベータ2糖タンパク質1 バツバツバツバツ
P02750 ロイシンリッチアルファ2糖タンパク質前駆体バツ
P02751 フィブロネクチンバツバツ
P02760 AMBPタンパク質前駆体バツバツバツバツ
P02763 アルファ1酸性糖タンパク質1 バツバツバツ
P02765 アルファ2 HS糖タンパク質前駆体バツ
P02766 トランスサイレチン前駆体バツバツバツ
P02768 血清アルブミンバツバツバツバツ
P02774 ビタミンD結合タンパク質前駆体バツ
P02787 セロトランスフェリンバツバツバツバツ
P02788 ラクトトランスフェリン前駆体バツ
P02790 ヘモペキシンバツバツバツバツ
P02792 フェリチン軽鎖バツ
P04004 ビトロネクチンバツバツバツバツ
P04075 フルクトースビスホスフェートアルドラーゼA バツ
P04083 アネキシンA1 バツバツバツバツ
P04179 スーパーオキシドジスムターゼMnミトコンドリア前駆体バツ
P04196 ヒスチジンに富む糖タンパク質前駆体バツ
P04217 アルファ1B糖タンパク質前駆体バツバツ
P04350 チューブリンベータ4鎖バツ
P04406 グリセロアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼバツバツバツバツ
P04792 熱ショックタンパク質β1 バツバツバツバツ
P05091 アルデヒドデヒドロゲナーゼミトコンドリア前駆体バツバツ
血漿プロテアーゼC1インヒビター前駆体バツ
P05156 補体因子I前駆体バツ
P05413 脂肪酸結合タンパク質心臓バツ
P05452 テトラネクチン前駆体TN バツバツ
P05787 ケラチンII型細胞骨格8 バツ
P06396 ゲルソリンバツバツバツバツ
P06576 ATP合成酵素サブユニットベータミトコンドリア前駆体バツバツ
P06732 クレアチンキナーゼM型バツバツ
P06733 アルファエノラーゼバツバツバツバツ
P06753 トロポミオシンα3鎖バツバツ
P07108 アシルCoA結合タンパク質バツ
P07195 L乳酸デヒドロゲナーゼB鎖バツバツバツ
P07196 神経フィラメント軽ポリペプチドバツ
P07197 神経フィラメント培地ポリペプチドバツバツ
P07237 タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ前駆体バツバツ
P07339 カテプシンD前駆体バツバツ
P07355 アネキシンA2 バツバツバツバツ
P07360 補体成分C8ガンマ鎖前駆体バツ
P07437 チューブリンベータ鎖バツバツバツバツ
P07585 デコリンバツバツバツバツ
P07737 Profilin 1 バツ
P07858 カテプシンB前駆体バツ
P07900 熱ショックタンパク質HSP90α バツバツ
P07951 トロポミオシンベータ鎖バツ
P07954 フマル酸ヒドラターゼミトコンドリア前駆体バツ
P07996 トロンボスポンジン1 バツバツバツ
P08107 熱ショック70kDaタンパク質1A 1B バツバツバツバツ
P08123 コラーゲンアルファ2 I鎖バツバツバツバツ
P08133 アネキシンA6 バツバツ
P08238 熱ショックタンパク質HSP90ベータバツバツ
P08253 72kDaのIV型コラゲナーゼ前駆体バツ
P08294 細胞外スーパーオキシドジスムターゼCu Zn precウルソルバツバツバツ
P08590 ミオシン軽ポリペプチド3 バツバツ
P08603 補数因子H バツバツバツバツ
P08670 ビメンチンバツバツバツバツ
P08729 ケラチンII型細胞骨格7 バツ
P08758 アネキシンA5 バツバツバツバツ
P09211 グルタチオンSトランスフェラーゼP バツバツバツ
P09382 ガレクチン1 バツバツバツ
P09417 ジヒドロプテリジンレダクターゼバツ
P09493 トロポミオシン1アルファ鎖バツバツ
P09525 アネキシンA4 バツバツ
P09651 異種核リボ核タンパク質A1 バツ
P09871 補体C1s副成分前駆体バツ
P09936 ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素アイソザイムL1 バツ
P09972 フルクトースビスホスフェートアルドラーゼC バツ
P0C0L4 補体C4前駆体バツ
P0CG05 Igラムダ2鎖C領域バツ
P0CG38 POTEアンキリンドメインファミリーメンバーI バツ
P10515 ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のジヒドロリポイルリジン残基アセチルトランスフェラーゼ成分バツ
P10768 Sホルミルグルタチオン加水分解酵素バツ
P10809 60kDa熱ショックタンパク質ミトコンドリア前駆体バツ
P10909 クラステリンバツバツバツバツ
P10915 ヒアルロナンとプロテオグリカンはプロテイン1前駆体を連結するバツバツ
P11021 78kDa gルコース調節タンパク質バツバツバツ
P11047 ラミニンサブユニットガンマ1前駆体バツ
P11142 熱ショックコグネイト71kDaタンパク質バツバツバツバツ
P11177 ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1成分サブユニットベータミトコンドリア前駆体バツ
P11217 グリコーゲンホスホリラーゼ筋肉形態バツ
P11310 中鎖特異的アシルCoAデヒドロゲナーゼミトコンドリア前駆体バツ
P11413 グルコース6リン酸1デヒドロゲナーゼバツ
P11766 アルコールデヒドロゲナーゼクラス3カイ鎖バツ
P12036 神経フィラメント重ポリペプチドバツ
P12109 コラーゲンアルファ1鎖バツバツバツバツ
P12110 コラーゲンα2 VI鎖バツバツバツバツ
P12111 コラーゲンアルファ3鎖バツバツバツ
P12277 クレアチンキナーゼB型バツ
P12429 アネキシンA3 バツバツ
P12814 アルファアクチニン1 バツバツ
P12829 ミオシン軽ポリペプチド4 バツ
P12882 ミオシン1 バツ
P12883 ミオシン7 バツバツ
P12955 Xaa Proジペプチダーゼバツ
P13489 リボヌクレアーゼ阻害剤バツ
P13533 ミオシン6 バツバツ
P13611 バーシカンコアタンパク質前駆体バツバツ
P13639 伸長率2 バツ
P13716 デルタアミノレブリン酸デヒドラターゼバツ
P13796 プラスティン2 バツ
P13804 電子伝達フラボタンパク質サブユニットαミトコンドリア前駆体バツ
P13929 ベータエノラーゼバツバツ
P14136 グリア線維性酸性タンパク質星状膠細胞バツ
P14314 グルコシダーゼ2サブユニットβ前駆体バツ
P14550 アルコールデヒドロゲナーゼNADP バツ
P14618 ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1 M2 バツバツバツ
P14625 </ td> エンドプラスミン前駆体バツバツ
P15121 アルドース還元酵素バツ
P15259 ホスホグリセリン酸ムターゼ2 バツ
P16152 カルボニルレダクターゼNADPH 1 バツ
P17066 熱ショック70kDaタンパク質6 バツバツバツ
P17174 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ細胞質バツ
P17540 クレアチンキナーゼサルコメアミトコンドリア前駆体バツ
P17661 デスミンバツバツバツバツ
P17980 26Sプロテアーゼ調節サブユニット6A バツ
P17987 T複合体タンパク質1サブユニットα バツ
P18206 ビンキュリンバツバツ
P18428 リポ多糖結合タンパク質前駆体バツ
P18669 ホスホグリセリン酸ムターゼ1 バツ
P19105 ミオシン制御軽鎖2 バツバツ
P19623 スペルミジン合成酵素バツ
P19652 アルファ1酸性糖タンパク質2前駆体バツバツ
P19823 インターアルファトリプシンインヒビター重鎖H2 バツ
P19827 インターアルファトリプシンインヒビター重鎖H1 バツバツ
P20073 アネキシンA7 バツ
P20618 プロテアソームサブユニットベータ1型前駆体バツ
P20774 ミメカンバツバツバツバツ
P21266 グルタチオンSトランスフェラーゼMu 3 バツ
P21333 フィラミンA バツバツ
P21796 電圧依存性陰イオン選択的チャネルタンパク質1 バツ
P21810 ビグリカンバツバツバツバツ
P21980 プロテイングルタミンガンマグルタミルトランスフェラーゼ2 バツバツ
P22105 テネイシンX バツバツ
P22314 ユビキチン活性化酵素E1 バツ
P22352 グルタチオンペルオキシダーゼ3前駆体バツバツ
P22626 異種核リボ核タンパク質A2 B1 バツ
P22695 ユビキノールシトクロムcレダクターゼ複合体コアタンパク質2ミトコンドリア前駆体バツ
P23141 肝臓カルボキシルエステラーゼ1前駆体バツ
P23142 フィブリン1 バツバツバツバツ
P23284 ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼB前駆体バツ
P23381 トリプトファニルtRNA合成酵素細胞質バツ
P23526 アデノシルホモシステナーゼバツバツ
P23528 コフィリン1 バツ
P24752 アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼミトコンドリア前駆体バツ
P25311 亜鉛アルファ2糖タンパク質n前駆体バツ
P25705 アルファミトコンドリアATPシンターゼサブユニットバツ
P25788 プロテアソームサブユニットα型3 バツバツ
P25789 プロテアソームサブユニットα型4 バツ
P26447 プロテインS100 A4 バツ
P27348 14 3 3タンパク質シータバツバツ
P27797 カルレティキュリン前駆体バツ
P28066 プロテアソームサブユニットアルファタイプ5 バツ
P28070 バツバツ
P28072 プロテアソームサブユニットβ型6前駆体バツ
P28074 プロテアソームサブユニットβ型5前駆体バツ
P28331 NADHユビキノンオキシドレダクターゼ75kDaサブユニットミトコンドリア前駆体バツ
P28838 サイトゾルアミノペプチダーゼバツ
P29218 イノシトールモノホスファターゼバツ
P29401 トランスケトラーゼバツ
P29692 伸長率1デルタバツ
P29966 ミリストイル化アラニンリッチCキナーゼ基質バツ
P30040 小胞体タンパク質ERp29前駆体バツ
P30041 ペルオキシレドキシン6 バツバツ
P30043 フラビンレダクターゼバツ
P30044 ペルオキシレドキシン5ミトコンドリア前駆体バツ
P30085 UMP CMPキナーゼバツ
P30086 ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質1 バツ
P30101 プロテウスnジスルフィドイソメラーゼA3前駆体バツバツバツ
P30613 ピルビン酸キナーゼアイソザイムRL バツ
P30740 白血球エラスターゼ阻害剤バツ
P31025 リポカリン1前駆体バツ
P31937 3ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼミトコンドリア前駆体バツ
P31942 異種核リボ核タンパク質H3 バツ
P31943 異種核リボ核タンパク質H バツ
P31946 14 3 3タンパク質ベータアルファバツバツ
P31948 ストレス誘発リンタンパク質1 バツ
P31949 プロテインS100 A11 バツ
P32119 ペルオキシレドキシン2 バツバツ
P34931 熱ショック70kDaタンパク質1様バツバツ
P34932 熱ショック70kDaタンパク質4 バツ
P35232 禁止バツ
P35237 セルピンB6 バツ
P35443 トロンボスポンジン4 バツ
P35555 フィブリリン1 バツバツ
P35579 ミオシン9 バツバツバツ
P35580 ミオシン10 バツバツ
P35609 アルファアクチニン2 バツ
P35625 メタロプロテイナーゼ阻害剤3 バツバツ
P35998 26Sプロテアーゼ調節サブユニット7 バツ
P36871 ホスホグルコムターゼ1 バツバツ
P36955 色素上皮由来因子バツバツ
P37802 バツバツ
P37837 トランスアルドラーゼバツ
P38117 電子伝達フラボタンパク質サブユニットベータバツ
P38646 ストレス70タンパク質ミトコンドリア前駆体バツバツ
P39687 酸性ロイシン富化核リンタンパク質32ファミリーメンバーA バツ
P40121 マクロファージキャッピングタンパク質バツ
P40925 マレートデヒドロゲナーゼ細胞質バツ
P40926 マレイン酸脱水素酵素ミトコンドリア前駆体バツ
P41219 ペリフェリンバツ
P42330 アルドケトレダクターゼファミリー1メンバーC3 バツ
P45880 電圧依存性陰イオン選択的チャネルタンパク質2 バツ
P47755 Fアクチンキャッピングタンパク質サブユニットα2 バツバツ
P47756 Fアクチンキャッピングタンパク質サブユニットβ バツバツ
P47985 ユビキノールシトクロムcレダクターゼ鉄硫黄サブユニットミトコンドリア前駆体バツ
P48047 ATP合成酵素Oサブユニットミトコンドリア前駆体バツ
P48637 グルタチオン合成酵素バツ
P48741 熱ショック70kDaタンパク質7 バツバツ
P49189 4トリメチルアミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼバツ
p49368 T複合タンパク質1サブユニットγ バツ
P49747 軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質バツバツバツバツ
P49748 非常に長い鎖特異的アシルCoAデヒドロゲナーゼミトコンドリア前駆体バツ
P50395 Rab GDP解離阻害剤ベータバツ x </ td>
P50454 セルピンH1前駆体バツ
P50995 アネキシンA11 バツ
P51452 二重特異性タンパク質ホスファターゼ3 バツ
P51884 ルミカンバツバツバツバツ
P51888 プロラギン前駆体バツバツバツバツ
P52565 Rho GDP解離阻害剤1 バツ
P52566 Rho GDP解離阻害剤2 バツ
P54652 熱ショック関連70kDaタンパク質2 バツバツバツバツ
P55072 移行小胞体ATPアーゼバツ
P55083 マイクロフィブリル関連糖タンパク質4前駆体バツバツ
P57053 ヒストンH2BタイプF バツ
P60174 トリオースリン酸イソメラーゼバツバツバツ
P60660 ミオシン軽ポリペプチド6 バツバツ
P60709 アクチン細胞質1 バツバツバツバツ
P60981 デストリンバツ
P61086 ユビキチン結合酵素E2 25kDa バツ
P61088 ユビキチン結合酵素E2 バツ
P61224 Ras関連タンパク質Rap 1b前駆体バツ
P61978 異種核リボ核タンパク質K バツバツ
P61981 14 3 3タンパク質γ バツバツバツ
P62258 14 3 3タンパク質イプシロン14 3 3E バツ
P6249 Ras関連タンパク質バツ
P62714 セリントレオニンタンパク質ホスファターゼ2A触媒サブユニットβアイソフォームバツ
P62736 アクチン大動脈平滑筋バツバツバツ
P62805 ヒステロンH4 バツ
P62826 GTP結合核タンパク質ランバツ
P62873 グアニンヌクレオチド結合タンパク質GIGSGTサブユニットベータ1 バツ
P62879 グアニンヌクレオチド結合タンパク質GIGSGTサブユニットベータ2 バツ
P62937 ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼA バツバツ
P62987 ユビキチン60Sリボソームタンパク質L40 バツ
P63104 14 3 3 proテインゼータデルタバツバツバツバツ
P63241 真核生物翻訳開始因子5A 1 バツ
P63244 1のようなグアニンヌクレオチド結合タンパク質サブユニットベータ2 バツ
P63267 アクチンガンマ腸平滑筋バツバツ
P67936 トロポミオシンα4鎖バツ
P68032 アクチンα心筋1 バツ
P68104 伸長率1アルファ1 バツバツバツ
P68133 アクチンα骨格筋
P68363 チューブリンα1B鎖バツバツバツ
P68371 チューブリンベータ2C鎖バツバツバツ
P68402 血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼIBサブユニットβ バツ
P68871 ヘモグロビンサブユニットベータバツバツバツ
P69905 ヘモグロビンサブユニットアルファバツバツ
P78371 T複合体タンパク質1サブユニットベータバツ
P78417 グルタチオントランスフェラーゼオメガ1 バツバツ
P80748 Igラムダ鎖VIII領域LOI バツ
P98095 フィブリン2 バツバツ
Q01082 スペクトリンβ鎖脳1 バツ
Q01449 ミオシン制御軽鎖2心房アイソフォームバツ
Q01518 アデニリルシクラーゼ関連タンパク質1 バツ
Q01995 トランスジェリン平滑筋タンパク質22α バツ
Q03252 ラミンB2 バツバツ
Q03591 補体因子H関連タンパク質1前駆体バツ
Q04917 14 3 3タンパク質η バツバツ
Q06323 プロテアソームアクチベーター複合体サブユニット1 バツ
Q06828 フィブロモジュリンバツバツバツバツ
Q06830 ペルオキシレドキシン1 バツバツ
Q07507 Dermatopontin バツバツバツバツ
Q07960 Rho GTPase活性化タンパク質1 バツ
Q08257 キノンオキシドレダクターゼバツ
Q08431 ラクタドヘリンバツバツ
Q12765 Sエーセレン1 バツ
Q13011 デルタ3デルタ2 4ジエノイルCoAイソメラーゼミトコンドリア前駆体バツバツ
Q13228 セレン結合タンパク質1 バツバツ
Q13404 ユビキチン結合酵素E2変異体1 バツ
Q13409 細胞質ダイニン1中間鎖2 バツ
Q13509 チューブリンベータ3鎖バツバツバツ
Q13642 4および半分のLIMドメインタンパク質1 バツ
Q13765 新生ポリペプチド関連複合体サブユニットα バツ
Q13885 Nチューブリンベータ2A鎖バツバツ
Q14194 ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質1 バツ
Q14195 ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3 バツバツバツバツ
Q14624 インターアルファトリプシン阻害剤重鎖H4前駆体バツ
Q14697 ニュートラルアルファグルコシダーゼAB前駆体バツ
Q14764 主要なボールトタンパク質バツ
Q14767 潜在的形質転換成長因子β結合タンパク質2 バツバツ
Q14894 MuクリスタリンホモログNADPは甲状腺ホルモン結合タンパク質を調節するバツ
Q15063 ペリオスチン前駆体バツバツバツバツ
Q15084 プロテインジスルフィドイソメラーゼA6前駆体バツ
Q15113 プロコラーゲンCエンドペプチダーゼエンハンサー1前駆体バツ
Q15181 無機ピロホスファターゼバツ
Q15365 ポリrC結合タンパク質1 バツ
Q15366 ポリrC結合タンパク質2 バツ
Q15582 トランスフォーミング増殖因子ベータ誘導タンパク質バツバツバツ
Q15819 ユビキチン結合酵素E2変異体2 バツ
Q16352 アルファインターエクスチェンジバツ
Q16473 推定テネイシンXA バツ
Q16555 ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質2 バツバツバツ
Q16698 2 4ジエノイルCoAレダクターゼミトコンドリア前駆体バツ
Q16891 ミトコンドリア内膜バツ
Q562R1 タンパク質2のようなβアクチンバツ
Q6S8J3 POTEアンキリンドメインファミリーメンバーE バツ
Q6UWY5 プロテイン1前駆体のようなオルフファトメジンバツバツ
Q71U36 チューブリンアルファ1A鎖バツバツバツ
Q7Z7G0 Nesh SH3前駆体のターゲットバツバツバツ
Q8WUM4 プログラムされた細胞死6相互作用タンパク質バツ
Q8WWX9 セレノプロテインM前駆体のようなチオレドキシンバツ
Q92597 プロテインNDRG1 バツ
Q92945 遠い上流の要素結合タンパク質2 バツ
Q96CN7 イソコリシス酵素ドメイン含有タンパク質1 バツ
Q96CX2 BTB POZドメイン含有タンパク質バツ
Q96KK5 ヒストンH2Aタイプ1H バツバツ
Q96KP4 サイトゾル非特異的ジペプチダーゼバツ
Q99426 チューブリン特異的シャペロンB バツ
Q99497 プロテインDJ 1 バツバツ
Q99536 シナプス小胞膜タンパク質バツバツバツ
Q99714 3ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ2型バツ
Q99715 コラーゲンα1XII鎖バツバツ
Q99798 ヒドラターゼミトコンドリア前駆体バツ
Q9BQE3 チューブリンアルファ6鎖バツ
Q9BUF5 チューブリンベータ6鎖バツバツ
Q9BUT1 3ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼタイプ2 バツ
Q9BVA1 チューブリンベータ2B鎖バツバツバツ
Q9BXN1 アスポリンバツ x </ td> バツバツ
Q9H0W9 エステル加水分解酵素C11orf54 バツ
Q9H4B7 チューブリンベータ1鎖バツ
Q9NRN5 プロテオミクスバツバツ
Q9NRV9 ヘム結合タンパク質1 バツ
Q9NSB2 ケラチンII型クチクラHb4 バツバツ
Q9NVA2 セプチン11 バツ
Q9UBR2 カテプシンZ前駆体バツ
Q9UBX5 フィブリン5 バツバツ
Q9UK22 Fボックスのみのタンパク質2 バツ
Q9Y277 電圧依存性陰イオン選択的チャネルタンパク質3 バツ
Q9Y281 コフィリン2 バツ
Q9Y490 タリン1 バツ
Q9Y696 塩化物細胞内チャネルタンパク質4 バツ
Q9Y6C2 エミリン1 バツバツ

表1:4つの異なるプロテオームアプローチを適用した場合の僧帽弁組織抽出物で同定されたタンパク質のリスト:2次元電気泳動(2-DE)、二次元LC-MS E (2D-LC / MS E )、LC / MS E 、および液相IEFが挙げられる。各タンパク質が同定された方法が報告されている。

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Discussion

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このプロトコールの1つの重要なステップは、試料を凍結させ、粉砕システムを冷却するために液体窒素を使用することである。液体窒素の使用は生物分解を防ぎ、パウダー化を効率的に行うことができますが、安全な取り扱いのためには特別な訓練が必要です。

このプロトコールでは、標準的なモルタルおよび乳棒から小さなサンプルを回収することが困難であるため、サンプル粉砕用の粉砕システムが特徴です。この場合、小さな試料はモルタル表面上に微細な粉末として広がり、収集が困難になる。別の利点は、グラインダが電動化され、再現可能な方法でより多くのサンプルを処理することができ、疲労を増やさないことである。粉砕機の使用に関する1つの制限は、乳棒がモルタルに対して効果的に押されるためには小さくなければならない試料のサイズ(100mg以下)であることである。さらに、粉砕機の構成要素は、洗浄のための使用の間に室温に温めなければならない g。結果として、手順は時間がかかり、多くのサンプルが毎日処理される場合、多くのセットが必要となる。

さらなる重要なステップは抽出緩衝液の調製である。特に尿素(8M)およびチオ尿素(2M)の塩濃度はかなり高い。従って、塩の量は、溶液の総量のほぼ半分である。さらに、37℃を超えると尿素はタンパク質/ペプチドのN末端およびリシンおよびアルギニン残基の側鎖アミノ基にタンパク質カルバミル化を引き起こす可能性があるので、熱を避けなければならないことを考慮すると溶解は容易ではない。一度溶解すると、尿素バッファーは0.22μmのフィルターでろ過しなければならず、抽出効率に影響を与えずに-80℃で4週間保存することができますが、完全に溶解させるためには使用前に15℃以上に加温する必要があります。

変更とトラブルシューティング

このプロトコールでは、タンパク質抽出は、等電点電気泳動との適合性および難溶性タンパク質の可溶化効率のために、プロテオーム研究のための最も一般的に使用されるタンパク質抽出溶液の1つであるため、記載された尿素緩衝液を用いて行われる。この緩衝液は、内蔵膜タンパク質19またはチューブリン18のような凝集の傾向が非常に高いタンパク質のような難溶性タンパク質を非常に効率的に可溶化することができることを実証した。それは2-DEおよび液相IEF分析に直接使用することができる。

しかしながら、この緩衝液は、試料中に存在する全てのタンパク質の可溶化には理想的ではない。異なる抽出バッファーがこのプロトコルによって検出されないタンパク質を明らかにすることが可能である可能性がある。例えば、それはよく知られているリボソームおよび核タンパク質は、酸抽出またはトリクロロ酢酸/アセトン沈殿20により良好に抽出することができるが、アルカリ性pHレベルは、膜タンパク質21,22により適している。したがって、代替緩衝液の使用は、2-DEまたは液相IEFを妨げる塩を排除するために、タンパク質沈殿のためのさらなる工程を必要とし得る。

技術の限界

このプロトコールで同定されたタンパク質の数は比較的少ないが、数年後に質量精度とシーケンシング速度が劇的に向上したより現代的な機器を使用することにより、同定数とプロテオーム分析の適用範囲をさらに拡大することができる23。液体クロマトグラフィーのための長い勾配を用いることにより、プロテオームの大部分を予備分画工程なしでカバーすることが可能であるロマトグラフの分離と、高速シーケンシング速度24を備えた高分解能MS装置を組み合わせたものです。

既存/代替法に関する技術の意義

僧帽弁のようなヒトの心臓弁におけるタンパク質を同定および定量する能力は、弁疾患における生理学的/病理学的過程のメカニズムを解明するのに役立つ重要かつ挑戦的な課題である。僧帽弁プロテオームの変化を定義することは、組織の疾患状態に関連する生物学的プロセスの性質の理解を大きく増加させる。

僧帽弁の生理病理学に関する現在の知識は限られており、一般に、細胞外マトリクスのリモデリング、止血、炎症または酸化ストレスなどの特定のプロセスに関与する個々のタンパク質の分析によって得られる9,10 。

包括的なプロテオーム研究の欠如は、細胞外マトリックスタンパク質( すなわち、プロテオグリカン、コラーゲンおよびエラスチン)が非常に豊富なこの低細胞性組織の複雑さに帰することができる。これらのタンパク質は全量の約80%を構成し、低濃度のタンパク質の分析を妨げます。

したがって、この組織のプロテオームを記述するために、タンパク質可溶化を最大にする効率的な抽出プロトコールを確立することが必要であった。このプロトコールは、1mgの組織から約50μgのタンパク質を抽出することを可能にした。これは、「柔らかい」組織と比較して比較的低い収率である。肝臓(1mgの組織から約135μg)であるが、個々の試料についてタンパク質分析を行うことで十分である。これは、現象の個人内変動性を定義する場合に特に重要です。

さらに、この方法は、多くの分析用途に適合するという利点を有する。提案された抽出緩衝液に溶解された僧帽弁タンパク質は、2次元電気泳動および液相等電点電気泳動11,12または緩衝液成分干渉を排除するためのタンパク質沈殿後のイムノブロッティングおよびプロテオーム解析に直接使用することができ、ゲルフリー質量分析15

この抽出プロトコールの適用により、正常な僧帽弁組織のタンパク質成分のより網羅的な特徴付けが、多くのイントラセルの同定によって得られているラウルタンパク質。これらのタンパク質は、細胞外マトリックス中だけでなく、細胞質ゾルまたは細胞小器官に局在し、異なる分子および生物学的機能を有する。他の興味深いタンパク質( すなわち、 CryAB、septin-11、FHL-1、およびdermatopontin)も同定された。これらのタンパク質は、僧帽弁において未知の機能を有するが、それらの生物学的特性は、弁疾患において可能な役割を示唆する。

この技術を習得した後のアプリケーションまたは方向

このプロトコールにより、タンパク質発現に関するデータを、定量的mRNA発現および非定量的免疫組織化学的分析に関するデータと相関させることが可能である。実際、一緒に使用する場合、これらのアプローチは、mRNAから翻訳後タンパク質改変まで、疾患の根底にある分子メカニズムのより包括的な理解につながるであろう。したがって、この方法は、心臓弁の生理病理学に焦点を当てた研究者にとって興味深いものであり得る。フィンこのプロトコルは、人間の弁27に非常に類似しているブタの僧帽弁にも適用することができ、弁機能評価の実験モデルとして使用される。

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Disclosures

著者は何も開示することはない。

Acknowledgments

イタリアの保健省はこの研究を支持した(RC 2013-BIO 15)。彼女の優れた技術的支援のためにBarbara Micheliに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

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References

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  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
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ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化プロトコル
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Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).More

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

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