Optimalisert protokoll for ekstraksjon av proteiner fra Human Mitral Valve
Summary
Proteinsammensetningen av den humane mitralventilen er fortsatt delvis ukjent, fordi dens analyse er komplisert ved lav cellularitet og derfor ved lav proteinbiosyntese. Dette arbeidet gir en protokoll for effektivt å ekstrahere protein for analyse av mitralventilproteomet.
Abstract
Analyse av det cellulære proteomet kan bidra til å belyse de molekylære mekanismene som ligger til grunn for sykdommer på grunn av utviklingen av teknologier som tillater storskala identifisering og kvantifisering av proteiner som finnes i komplekse biologiske systemer. Viten som oppnås fra en proteomisk tilnærming kan potensielt føre til en Bedre forståelse av de patogene mekanismene som ligger til grunn for sykdommer, noe som gjør det mulig å identifisere nye diagnostiske og prognostiske sykdomsmarkører, og forhåpentligvis av terapeutiske mål. Imidlertid representerer kardial mitralventilen en meget utfordrende prøve for proteomanalyse på grunn av den lave cellulariteten i proteoglykan og kollagen-anriket ekstracellulær matrise. Dette gjør det vanskelig å ekstrahere proteiner for en global proteomanalyse. Dette arbeidet beskriver en protokoll som er kompatibel med etterfølgende proteinanalyse, som kvantitativ proteomikk og immunoblotting. Dette kan tillate korrelasjon av dataeneG-proteinuttrykk med data om kvantitativt mRNA-ekspresjon og ikke-kvantitativ immunhistokjemisk analyse. Faktisk vil disse tilnærmingene, når de utføres sammen, føre til en mer omfattende forståelse av molekylære mekanismer som ligger til grunn for sykdommer, fra mRNA til post-translasjonell proteinmodifisering. Dermed kan denne metoden være relevant for forskere som er interessert i studiet av hjerteventil-fysiopatologi.
Introduction
Nylige bevis har endret forståelsen av rollene til de mange regulatoriske mekanismer som oppstår etter mRNA-syntese. Faktisk kan translasjonelle, post-transkriptionelle og proteolytiske prosesser regulere protein overflod og funksjon. Dogmen – som sier at mRNA-konsentrasjoner er proxier til de tilsvarende proteinene, forutsatt at transkripsjonsnivåene er hovedbestemmende for protein overflod – har blitt delvis revidert. Innledningsvis forutsier transkripsjonsnivåer kun delvis overflod av protein, noe som tyder på at posttranskripsjonelle hendelser Forekommer for å regulere proteinene i cellene 1 , 2 .
Videre dikterer proteiner til slutt cellens funksjon og dikterer derfor fenotypen, som kan gjennomgå dynamiske endringer som følge av autokrine, parakrine og endokrine faktorer. Blodbårne mediatorer; temperatur; Medisinsk behandling; Og sykdomsutviklingmente. Således er en ekspresjonsanalyse fokusert på proteinnivået nyttig for å karakterisere proteomet og for å løse de kritiske forandringene som oppstår for det som en del av sykdomspatogenese 3 .
Derfor er mulighetene som proteomikkene presenterer for å klargjøre helse- og sykdomsforhold, formidabel, til tross for de eksisterende teknologiske utfordringene. De spesielt lovende forskningsområdene som proteomics kan bidra med inkluderer: identifisering av endret proteinuttrykk på noe nivå ( dvs. hele celler eller vev, subcellulære rom og biologiske væsker); Identifisering, verifisering og validering av nye biomarkører som er nyttige for diagnose og prognose av sykdom; Og forhåpentligvis identifisering av nye proteinmål som kan brukes til terapeutiske formål, samt for vurdering av narkotikapåvirkning og toksisitet 4 .
Fange kompleksiteten tilProteomet representerer en teknologisk utfordring. De nåværende proteomiske verktøyene gir mulighet til å utføre storskala, høy gjennomstrømningsanalyse for identifisering, kvantifisering og validering av endrede proteinnivåer. I tillegg har introduksjonen av fraksjonerings- og anrikningsteknikker, som har til hensikt å unngå forstyrrelser forårsaket av de mest rikelige proteiner, også forbedret proteinidentifikasjon ved å inkludere de minste rikelige proteiner. Endelig har proteomics blitt komplementert ved analyse av posttranslasjonelle modifikasjoner, som gradvis oppstår som viktige modulatorer av proteinfunksjon.
Prøvepreparasjonen og proteinutvinningen i de biologiske prøvene under analyse forblir imidlertid begrensende trinn i den proteomiske arbeidsflyten og øker potensialet for mulige fallgruver 5 . Faktisk, i de fleste molekylærbiologi teknikker som må optimaliseres, er de første trinnene vev homogenizatIon og celle lysis, spesielt under analysen av lav-overflod proteiner for hvilke amplifikasjonsmetoder ikke eksisterer. I tillegg kan proteinets kjemiske natur påvirke egen gjenoppretting. For eksempel er analysen av svært hydrofobe proteiner svært utfordrende, fordi de lett utfeller under isoelektrisk fokusering, mens trans-membranproteiner er nesten uoppløselige (omtalt i referanse 5). Videre skaper vevsammensetningsvariabiliteten en betydelig barriere for å utvikle en universell ekstraksjonsmetode. Til slutt, fordi nesten alle de kliniske prøvene er av begrenset mengde, er det essensielt å muliggjøre proteinpreparering med maksimal utvinning og reproduserbarhet fra minimale prøvebeløp 6 .
Dette arbeidet beskriver en optimal protokoll for proteinutvinning fra den normale hjerte-mitralventilen, som representerer en svært utfordrende prøve for proteomanalyse. Den normale mitralventilen er en kompLex struktur liggende mellom venstre atrium og hjerte venstre ventrikel ( figur 1 ). Det spiller en viktig rolle i kontrollen av blodstrømmen fra atriumet til ventrikkelen, hindrer tilbakestrømning og sikrer riktig oksygentilførsel til hele kroppen, og opprettholder dermed en tilstrekkelig hjerteutgang. Imidlertid regnes det ofte for å være et "inaktivt" vev, med lav cellularitet og få komponenter, hovedsakelig i den ekstracellulære matriksen. Dette skyldes at, under normale forhold, de residente valvulære interstitialceller (VICs) presenterer en hvilende fenotype med en lav proteinbiosyntesehastighet 7 .
Det har imidlertid vist seg at i en patologisk tilstand øker antall VICs i spongiosa og deres proteinsyntese aktiveres, sammen med andre funksjonelle og fenotypiske endringer 8 . Derfor er det ikke overraskende at de minimale dataene som er tilgjengelige iLitteraturen fokuserer på analysen av patologiske mitralventiler 9 , 10 , hvor det økte antallet aktiverte VICs kan forklare det relativt høye antallet identifiserte proteiner.
Som konklusjon kan foreliggende protokoll tjene til å utvikle forståelsen av de patogene mekanismene som er ansvarlige for mitralventilssykdommer gjennom studiet av mitralventilproteinkomponenter. Faktisk kan en større forståelse for de underliggende patologiske prosessene bidra til å forbedre den kliniske styringen av ventilsykdommer, hvis nåværende indikasjoner for intervensjon i stor grad er basert på hemodynamiske hensyn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et kritisk trinn i denne protokollen er bruken av flytende nitrogen for å fryse prøven og å kjøle grindersystemet. Bruken av flytende nitrogen forhindrer biologisk nedbrytning og muliggjør effektiv pulverisering, men det krever spesiell trening for sikker håndtering.
I denne protokollen finnes et grindersystem for prøvesliping, fordi små prøver er vanskelige å gjenopprette fra standard mørtel og pestler. I dette tilfellet spredes små prøver som et fint pulver over mørteloverfla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det italienske helsedepartementet støttet denne studien (RC 2013-BIO 15). Vi takker Barbara Micheli for sin gode tekniske assistanse.
Materials
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?. Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
