Optimerat protokoll för extraktion av proteiner från humanmitralventilen
Summary
Proteinkompositionen av den mänskliga mitralventilen är fortfarande delvis okänd, eftersom dess analys är komplicerad av låg celluläritet och därför genom låg proteinbiosyntes. Detta arbete ger ett protokoll för att effektivt extrahera protein för analys av mitralventilproteomen.
Abstract
Analys av det cellulära proteomet kan bidra till att belysa de molekylära mekanismer som ligger till grund för sjukdomar på grund av utvecklingen av teknik som möjliggör storskalig identifiering och kvantifiering av proteinerna som finns i komplexa biologiska system. Den kunskap som erhålls från ett proteomiskt tillvägagångssätt kan potentiellt leda till en Bättre förståelse för de patogena mekanismer som ligger till grund för sjukdomar, vilket möjliggör identifiering av nya diagnostiska och prognostiska sjukdomsmarkörer och förhoppningsvis av terapeutiska mål. Emellertid representerar hjärt mitralventilen ett mycket utmanande prov för proteomanalys på grund av den låga celluliteten i proteoglykan och kollagenberikad extracellulär matris. Detta gör det svårt att extrahera proteiner för en global proteomanalys. Detta arbete beskriver ett protokoll som är kompatibelt med efterföljande proteinanalys, såsom kvantitativ proteomik och immunoblottning. Detta kan möjliggöra korrelation av data omG-proteinuttryck med data om kvantitativt mRNA-uttryck och icke kvantitativ immunhistokemisk analys. Faktum är att dessa tillvägagångssätt, när de utförs tillsammans, kommer att leda till en mer övergripande förståelse av de molekylära mekanismerna som ligger bakom sjukdomar, från mRNA till posttranslationell proteinmodifiering. Således kan denna metod vara relevant för forskare som är intresserade av studien av hjärtfluid-fysiopatologi.
Introduction
Nya bevis har förändrat förståelsen av rollerna hos de många regleringsmekanismer som uppstår efter mRNA-syntes. I själva verket kan translations-, post-transkriptionella och proteolytiska processer reglera proteinöverflöd och -funktion. Dogmen – som säger att mRNA-koncentrationer är proxier mot de motsvarande proteinerna, förutsatt att transkriptnivåerna är huvudbestämmaren för proteinöverskridande – har delvis reviderats. Inledningsvis förutspår transkriptnivåer endast partiellt proteinöverflöd, vilket tyder på att post-transkriptionella händelser Förekommer för att reglera proteinerna i cellerna 1 , 2 .
Vidare dikterar proteiner i slutändan cellens funktion och dikterar därmed sin fenotyp, som kan genomgå dynamiska förändringar som svar på autokrina, parakrina och endokrina faktorer. Blodburna mediatorer; temperatur; Drogbehandling; Och sjukdomsutvecklingmenade. Således är en expressionsanalys inriktad på proteinnivån användbar för att karakterisera proteomen och att riva upp de kritiska förändringar som uppträder för den som en del av sjukdomspatogenes 3 .
Därför är de möjligheter som proteomik presenterar för att klargöra hälso- och sjukdomstillstånd formidabel trots de nuvarande tekniska utmaningarna. De särskilt lovande forskningsområden som proteomics kan bidra med omfattar: identifiering av förändrat proteinuttryck på vilken nivå som helst ( dvs hela celler eller vävnader, subcellulära fack och biologiska vätskor); Identifiering, verifiering och validering av nya biomarkörer användbara för diagnos och prognos av sjukdom; Och förhoppningsvis identifiering av nya proteinmål som kan användas för terapeutiska ändamål, liksom för bedömning av läkemedelseffektivitet och toxicitet 4 .
Fånga komplexiteten hosProteomen representerar en teknisk utmaning. De nuvarande proteomiska verktygen erbjuder möjlighet att utföra storskalig analys med hög genomströmning för identifiering, kvantifiering och validering av förändrade proteinnivåer. Dessutom har införandet av fraktionerings- och anrikningstekniker, som syftar till att undvika störningen orsakad av de mest rikliga proteinerna, förbättrat proteinidentifiering genom att inkludera de minst rikliga proteinerna. Slutligen har proteomics kompletterats med analysen av posttranslationella modifieringar, vilka gradvis framträder som viktiga modulatorer av proteinfunktion.
Provberedningen och proteinåtervinningen i de biologiska proverna som analyseras är emellertid fortfarande de begränsande stegen i det proteomiska arbetsflödet och ökar potentialen för möjliga fallgropar 5 . I själva verket är de första stegen i vävnadshomogenizat i de flesta molekylärbiologitekniker som måste optimerasJon och celllys, speciellt under analysen av proteiner med låg överensstämmelse för vilka amplifieringsmetoder inte existerar. Dessutom kan den kemiska naturen hos proteiner påverka sin egen återhämtning. Analysen av högt hydrofoba proteiner är till exempel mycket utmanande, eftersom de lätt fäller ut under isoelektrisk fokusering, medan trans-membranproteiner är nästan olösliga (ses i Referens 5). Dessutom skapar variationen i vävnadskompositionen en betydande barriär för att utveckla en universell extraktionsmetod. Slutligen, eftersom nästan alla kliniska prover är av begränsad mängd, är det väsentligt att möjliggöra proteinberedning med maximal återhämtning och reproducerbarhet från minimala provmängder 6 .
I det här arbetet beskrivs ett optimerat protokoll för proteinutvinning från den normala mitralventilen för mänsklig hjärt, vilket representerar ett mycket utmanande prov för proteomanalys. Den normala mitralventilen är en kompLexstrukturen ligger mellan vänstra atriumet och hjärtans vänstra kammare ( Figur 1 ). Det spelar en viktig roll i kontrollen av blodflödet från atriumet till ventrikeln, förhindrar återflöde och säkerställer den korrekta nivån av syreförsörjning till hela kroppen och därigenom upprätthålla en tillräcklig hjärtutgång. Det anses emellertid ofta vara en "inaktiv" vävnad, med låg celluläritet och få komponenter, huvudsakligen i den extracellulära matrisen. Detta beror på att, vid normala förhållanden, de invändiga valvulära interstitiella cellerna (VICs) presenterar en vilande fenotyp med en biosyntesfrekvens med låg protein 7 .
Det har emellertid visat sig att i ett patologiskt tillstånd ökar antalet VIC i spongiosa och deras proteinsyntes aktiveras tillsammans med andra funktionella och fenotypiska förändringar 8 . Därför är det inte förvånande att de minimala data som finns tillgängliga iLitteraturen fokuserar på analysen av patologiska mitralventiler 9 , 10 , där det ökade antalet aktiverade VIC kan förklara det relativt höga antalet identifierade proteiner.
Sammanfattningsvis kan föreliggande protokoll tjäna till att utveckla förståelsen för de patogena mekanismerna som är ansvariga för mitralventilsjukdomar genom studiet av mitralventilproteinkomponenter. En större förståelse för de underliggande patologiska processerna skulle kunna bidra till att förbättra den kliniska hanteringen av ventilsjukdomar, vars nuvarande indikationer för intervention i stor utsträckning beror på hemodynamiska överväganden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett kritiskt steg i detta protokoll är användningen av flytande kväve för att frysa provet och att kyla kvarnsystemet. Användningen av flytande kväve förhindrar biologisk nedbrytning och möjliggör effektiv pulverisering, men det kräver särskild träning för säker hantering.
I det här protokollet finns ett kvarnsystem för provslipning, eftersom små prov är svåra att återhämta sig från standardmortel och pistlar. I det här fallet sprids småprover som ett fint pulver öve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det italienska hälsovårdsministeriet stödde denna studie (RC 2013-BIO 15). Vi tackar Barbara Micheli för hennes utmärkta tekniska hjälp.
Materials
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?. Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
