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Biochemistry

Optimiertes Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus dem menschlichen Mitralventil

doi: 10.3791/55762 Published: June 14, 2017

Summary

Die Proteinzusammensetzung des menschlichen Mitralklappens ist noch teilweise unbekannt, weil seine Analyse durch niedrige Zellularität und damit durch eine geringe Proteinbiosynthese kompliziert wird. Diese Arbeit liefert ein Protokoll zur effizienten Extraktion von Protein für die Analyse des Mitralklappenproteoms.

Abstract

Die Analyse des zellulären Proteoms kann dazu beitragen, die molekularen Mechanismen, die den Krankheiten zugrunde liegen, durch die Entwicklung von Technologien zu erhellen, die die großflächige Identifizierung und Quantifizierung der in komplexen biologischen Systemen vorhandenen Proteine ​​ermöglichen. Das Wissen, das aus einem proteomischen Ansatz gewonnen wird, kann möglicherweise zu einem Ein besseres Verständnis der pathogenen Mechanismen, die Krankheiten zugrunde liegen, die die Identifizierung von neuartigen diagnostischen und prognostischen Krankheitsmarkern und hoffentlich von therapeutischen Zielen ermöglichen. Allerdings stellt das Herz-Mitralklappen eine sehr anspruchsvolle Probe für die proteomische Analyse aufgrund der geringen Zellularität in der Proteoglycan- und Kollagen-angereicherten extrazellulären Matrix dar. Dies macht es schwierig, Proteine ​​für eine globale Proteomanalyse zu extrahieren. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, das mit der nachfolgenden Proteinanalyse kompatibel ist, wie z. B. quantitative Proteomik und Immunoblotting. Dies kann die Korrelation der Daten betreffenG Proteinexpression mit Daten über die quantitative mRNA-Expression und nicht-quantitative immunhistochemische Analyse. In der Tat werden diese Ansätze, wenn sie zusammen durchgeführt werden, zu einem umfassenderen Verständnis der molekularen Mechanismen führen, die Krankheiten zugrunde liegen, von mRNA zu posttranslationaler Proteinmodifikation. So kann diese Methode für Forscher relevant sein, die sich für die Untersuchung der Herz-Ventil-Physiopathologie interessieren.

Introduction

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Der jüngste Beweis hat das Verständnis der Rollen der vielen regulatorischen Mechanismen, die nach der mRNA-Synthese auftreten, verändert. In der Tat können translatorische, posttranskriptionelle und proteolytische Prozesse die Proteinabundanz und -funktion regulieren. Das Dogma - das sagt, dass mRNA-Konzentrationen Proxies zu denen der entsprechenden Proteine ​​sind, unter der Annahme, dass Transkript-Ebenen die Hauptdeterminante der Protein-Häufigkeit sind - wurde teilweise überarbeitet. In den Transkript-Ebenen nur teilweise prognostizieren Protein-Fülle, was darauf hindeutet, dass post-Transkription Ereignisse Um die Proteine ​​innerhalb der Zellen 1 , 2 zu regulieren .

Darüber hinaus diktieren Proteine ​​schließlich die Funktion der Zelle und diktieren daher ihren Phänotyp, der dynamische Veränderungen in Reaktion auf autokrine, parakrine und endokrine Faktoren erfahren kann; Blutübertragene Vermittler; Temperatur; Medikamentöse Behandlung; Und krankheit entwickeln sich. So ist eine Expressionsanalyse, die auf die Proteinebene fokussiert ist, nützlich, um das Proteom zu charakterisieren und die kritischen Veränderungen, die ihm als Teil der Krankheitspathogenese auftreten, zu entschlüsseln.

Daher sind die Chancen, die die Proteomik zur Klärung von Gesundheits- und Krankheitsverhältnissen bietet, trotz der bestehenden technologischen Herausforderungen furchtbar. Die besonders vielversprechenden Forschungsgebiete, denen die Proteomik beitragen kann, beinhalten: die Identifizierung der veränderten Proteinexpression auf jeder Ebene ( dh ganze Zellen oder Gewebe, subzelluläre Kompartimente und biologische Flüssigkeiten); Die Identifizierung, Überprüfung und Validierung von neuartigen Biomarkern, die für die Diagnose und Prognose von Krankheiten nützlich sind; Und hoffentlich die Identifizierung neuer Proteinziele, die für therapeutische Zwecke verwendet werden können, sowie für die Beurteilung der Arzneimittelwirksamkeit und Toxizität 4 .

Erfassen der Komplexität vonDas Proteom stellt eine technologische Herausforderung dar. Die aktuellen Proteomwerkzeuge bieten die Möglichkeit, eine groß angelegte Hochdurchsatzanalyse zur Identifizierung, Quantifizierung und Validierung veränderter Proteingehalte durchzuführen. Darüber hinaus hat die Einführung von Fraktionierungs- und Anreicherungstechniken, die darauf abzielen, die Interferenz zu vermeiden, die durch die am häufigsten vorkommenden Proteine ​​verursacht wird, auch die Proteinidentifizierung verbessert, indem sie die am wenigsten vorhandenen Proteine ​​einschließen. Schließlich wurde die Proteomik durch die Analyse von posttranslationalen Modifikationen ergänzt, die schrittweise als wichtige Modulatoren der Proteinfunktion auftauchen.

Allerdings bleiben die Probenvorbereitung und die Proteingewinnung in den untersuchten biologischen Proben nach wie vor die begrenzenden Schritte im proteomischen Arbeitsablauf und erhöhen das Potenzial für mögliche Fallstricke 5 . In der Tat, in den meisten der molekularbiologischen Techniken, die optimiert werden müssen, sind die ersten Schritte Gewebe HomogenisierungIonen- und Zelllyse, insbesondere während der Analyse von Proteinen mit geringer Häufigkeit, für die keine Amplifikationsmethoden existieren. Darüber hinaus kann die chemische Natur von Proteinen ihre eigene Erholung beeinflussen. Zum Beispiel ist die Analyse von hoch hydrophoben Proteinen sehr schwierig, da sie während der isoelektrischen Fokussierung leicht ausfallen, während trans-Membranproteine ​​nahezu unlöslich sind (siehe Referenz 5). Darüber hinaus schafft die Gewebszusammensetzungsvariabilität eine signifikante Barriere für die Entwicklung eines universellen Extraktionsverfahrens. Schließlich, da fast alle klinischen Proben von begrenzter Menge sind, ist es unerlässlich, die Proteinpräparation mit maximaler Wiedergewinnung und Reproduzierbarkeit aus minimalen Probenmengen zu ermöglichen 6 .

Diese Arbeit beschreibt ein optimiertes Protokoll für die Proteinextraktion aus dem normalen menschlichen Herzrhythmusventil, das eine sehr anspruchsvolle Probe für die proteomische Analyse darstellt. Das normale Mitralklappe ist ein KompLex-Struktur, die zwischen dem linken Vorhof und dem linken Ventrikel des Herzens liegt (Abbildung 1 ). Es spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Blutflusses vom Atrium zum Ventrikel, verhindert den Rückfluss und sorgt für die richtige Sauerstoffversorgung des ganzen Körpers, wodurch ein adäquates Herzzeitvolumen aufrechterhalten wird. Allerdings wird es oft als ein "inaktives" Gewebe betrachtet, mit einer geringen Zellularität und wenigen Komponenten, hauptsächlich in der extrazellulären Matrix. Dies liegt daran, dass unter normalen Bedingungen die residenten valvularen interstitiellen Zellen (VICs) einen ruhigen Phänotyp mit einer niedrigen Proteinbiosyntheserate 7 darstellen.

Es wurde jedoch gezeigt, dass in einem pathologischen Zustand die Anzahl der VICs in der Spongiosa zunimmt und ihre Proteinsynthese zusammen mit anderen funktionellen und phänotypischen Veränderungen aktiviert wird. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die minimalen Daten inDie Literatur konzentriert sich auf die Analyse der pathologischen Mitralklappen 9 , 10 , bei denen die erhöhte Anzahl aktivierter VICs die relativ hohe Anzahl identifizierter Proteine ​​erklären könnte.

Abschließend kann das vorliegende Protokoll dazu dienen, das Verständnis der pathogenen Mechanismen, die für Mitral-Ventil-Erkrankungen verantwortlich sind, durch die Untersuchung von Mitralklappen-Protein-Komponenten zu entwickeln. In der Tat könnte ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden pathologischen Prozesse dazu beitragen, das klinische Management von Ventilkrankheiten zu verbessern, deren derzeitige Indikationen für die Intervention weitgehend auf hämodynamische Überlegungen beruhen.

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Protocol

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In diesem Protokoll werden die menschlichen Herzen während der Multiorgan-Explantation (kalte Ischämiezeit von 4-12 h, Mittelwert 6 ± 2 h) von Multiorganspendern, die aus der Organtransplantation aus technischen oder funktionalen Gründen ausgeschlossen sind, trotz normaler echokardiographischer Parameter gesammelt. Sie werden an die Herz-Kreislauf-Tissue Bank von Mailand, Monzino Cardiologic Center (Mailand, Italien) für die Bank der Aorten- und Pulmonalventile geschickt. Die Mitral-posterioren Blättchen werden nicht für klinische Zwecke verwendet, so dass sie während der Aorten- und Lungenventilisolation gesammelt werden, nachdem eine informierte Zustimmung von den Verwandten der Spender erhalten wurde. Das Gewebe für die Transplantation und Forschung wird erst nach der elterlichen Zustimmung gesammelt; Englisch : eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUri...0053: EN: HTML Auf der Einverständniserklärung genehmigen sie die Verwendung des Herzgewebes für die Forschung nur, wenn sie nicht für den menschlichen klinischen Gebrauch ( dh mikrobiologische, funktionelle und serologische Probleme) nach den Richtlinien des Ethik - Komitees vonMonzino Kardiologisches Zentrum.

1. Mitralklappenvorbereitung

  1. Das menschliche Mitralklappe so schnell wie möglich nach der Organexplantation (kalte Ischämiezeit von 4-12 h) ernten.
  2. In einem sauberen Raum, entfernen Sie das Herz aus dem Transportbeutel mit einer kalten (4 ° C) Lösung ( dh Kochsalzlösung oder ausgewogene Medium Eurocollins oder Wisconsin). Legen Sie es in einen Eimer und legen Sie ihn in einen Biosicherheitsschrank (Biohazard-Vertikal-Luftstrom, Klasse A, Good Manufacturing Practices (GMP) Klassifizierung), um mit der Ventilvorbereitung fortzufahren.
  3. Legen Sie das Herz auf eine sterile Einweg-Tuch im Schrank. Mit einem sterilen Einweg-Skalpell, schneide das Herz ganz, senkrecht zu seiner Hauptachse, auf der Ebene der linken und rechten Ventrikel, etwa 4 cm entfernt von der Spitze.
  4. Bewegen Sie die aufsteigende Aorta und die pulmonale Arterie, um das linke Vorhofdach anzuzeigen.
  5. Mit sterilen autoklavierbaren Pinzetten und Picks, um die linke Ohrmuschel schneidenLinks atriales Dach, so dass das Mitralklappe sichtbar und ermöglicht die große Mitral-Prospekt (anterior) und die kleine Mitral-Broschüre (posterior) identifiziert werden.
    HINWEIS: Antero-laterale und hintere mediale Kommissuren definieren die Grenze der vorderen Broschüre und des hinteren Bereichs.
  6. Mit sterilen autoklavierbaren Scheren und nichttraumatischen Zangen sezieren Sie den linken Vorhof und die Ventrikelwanddicke um den Umfang des gesamten Mitralklappens .
  7. Identifizieren Sie die Mitro-Aortenklappen-Kontinuität.
    HINWEIS: Der linke Ventrikel enthält das ganze Mitralklappe und Akkorde.
  8. Trennen Sie die vordere Mitralklappe aus dem hinteren Mitralklappenblatt, schneiden Sie die hintere Blättchen entlang der Einfügung mit dem Ventrikel (Commissure).
  9. Waschen Sie die hintere Broschüre in der Kochsalzlösung. Schneiden Sie die Broschüre in kleine Stücke (<1 cm 2 ) und wickeln Sie sie einzeln in Aluminiumfolie ein. Snap-freeze sie mit flüssigem Stickstoff.
    Achtung: Bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff die organisatorischen Sicherheitsmaßnahmen beachten.
    1. Den Tisch des Schrankes mit einer 70% igen Isopropylalkohollösung und einer 6% igen Wasserstoffperoxidlösung am Ende des Verfahrens abgeben.

2. Proteinextraktion

  1. Verwenden Sie Pinzette, um die in flüssigem Stickstoff gespeicherte Probe aufzunehmen und sofort auf Trockeneis zu legen, während sie noch in die Aluminiumfolie eingewickelt ist. Lassen Sie die Probe nicht während der Transfers auftauen.
  2. Vor dem Schleifen den Porzellan / Zirkonium-Mörser und die Stößel eines Mahlsystems ( z. B. CryoGrinder) zusammen mit der Probe kühlen, indem man sie in einen Dewar-Kolben mit flüssigem Stickstoff (~ 500 ml) bringt.
    Achtung: Bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff die organisatorischen Sicherheitsmaßnahmen beachten.
  3. Setzen Sie den Mörser und die Pistillen in eine Polystyrol-Box mit Trockeneis. Entfernen Sie die Probe von der Aluminiumfolie und stecken Sie sie in den Mörtel.
  4. Schleifen tEr Probe mit der großen Stößel gegen den Mörtel 15-20 mal, mit dem Schraubendreher, um die Stößel zu drehen. Mischen Sie die Probe mit der Spitze eines vorgekühlten Spatels während des Mahlprozesses.
    1. Wiederholen Sie mit der kleinen Stößel.
  5. Übertragen Sie die Bodenprobe auf ein zuvor gewogenes Rohr ( z. B. 15 mL Zentrifugenröhrchen), indem Sie das Röhrchen umkehren, über den Mörtel legen und umdrehen, um die Probe in die Röhre zu bewegen. Verwenden Sie einen vorgekühlten Spatel, um alle Materialien aus dem Mörser zu erholen.
    1. Halten Sie das Röhrchen mit der Probe auf Trockeneis, um Probenproben während der Übertragung zu vermeiden.
  6. Berechnen Sie das Nettogewicht der Probe.
  7. Reinigen Sie den Mörser und die Pistillen nach jeder Probe und dekontaminieren sie durch Autoklavieren oder Erwärmen bei 200 ° C für 2 h.
  8. Übertragen Sie die pulverförmige Probe aus dem Zentrifugenröhrchen in die Glasröhre eines Homogenisators durch Inversion.
  9. Füge gefilterten Harnstoff zu(8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% G / V CHAPS, 20 mM Tris und 55 mM Dithiotreitol) zum Glasröhrchen, 200 μl Harnstoffpuffer für je 10 mg pulverförmiges Gewebe.
    HINWEIS: Die im Zentrifugenröhrchen verbleibende Restpulverprobe kann unter Verwendung eines Teils des berechneten Harnstoffpaketes zurückgewonnen werden.
  10. Homogenisieren der Probe unter Verwendung eines Rührers, der mit einem Borosilikatglasmörtel und einem Polytetrafluorethylen (PTFE) Pistill ausgestattet ist. Langsam die Pistille mit einer Drallbewegung (1.500 U / min) 10 mal auf die Probe drücken.
  11. Den Überstand wiederherstellen und in ein sauberes 1,7-ml-Zentrifugenröhrchen überführen. Wiederholen Sie die restliche Probe mit frischem Harnstoffpuffer, indem Sie die Hälfte des bei der ersten Extraktion verwendeten Volumens hinzufügen.
  12. Wiederholen Sie Schritt 2.10.
  13. Erholen Sie den Überstand und kombinieren Sie ihn mit dem Überstand aus Schritt 2.11. Den zusammengesetzten Überstand für 30 min auf einen Rohrrotator stellen.
  14. Das Röhrchen für 30 min bei 13.000 xg und 4 ° C zentrifugieren.
  15. Den Überstand wiederherstellenD messen die Proteinkonzentration unter Verwendung des Bradford-Protein-Assays nach den Anweisungen des Herstellers. Die Probe bei -80 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren.

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Representative Results

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Die Extraktion und Auflösung von Proteinen im Harnstoffpuffer ist direkt mit proteomischen Methoden auf der Basis von Isoelektrofokussierung (zweidimensionale Elektrophorese (2-DE) 11 und Flüssigphasen-isoelektrische Fokussierung (IEF) 12 ) und mit Immunoblotting nach Verdünnung im Laemmli-Puffer 13 verträglich Mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail 14 .

Für gelfreie Massenspektrometrie-basierte Methoden ( dh Flüssigchromatographie gekoppelt an datenunabhängige Massenspektrometrieanalyse (LC / MS E ) und zweidimensionale LC / MS E (2D-LC / MS E )) 15 wurden die Proben extrahiert In dem beschriebenen Harnstoffpuffer müssen weiter behandelt werden, um den Harnstoff und Thioharnstoff zu eliminieren, was die anschließende Proteinverdauung und die Flüssigchromatographie-Trennung beeinträchtigen könnte. ThiDer Entsalzungsschritt kann unter Verwendung der kommerziellen Protein-Präzipitations-Kits durchgeführt werden, wobei die Anweisungen des Herstellers folgen, um die Proteine ​​auszufällen. Die Probe kann dann in 25 mM NH 4 HCO 3 gelöst werden, das 0,1% spaltbare Reinigungsmittel für die Proteinverdauung enthält. Die Ausfällung der Proteine ​​kann Pufferkomponenten eliminieren, die den Proteingehalt minimal beeinflussen (Proteinrückgewinnung:> 85%), wodurch die Probe für jede Art von Analyse geeignet ist.

Die Anwendung dieses Protokolls auf die Proteinextraktion aus menschlichen Mitralklappen ermöglichte die Identifizierung von insgesamt 422 Proteinen, wobei vier verschiedene Proteomikansätze kombiniert wurden, die zuvor im Detail beschrieben wurden 11 , 15 . Speziell wurden 169 Proteine ​​durch 2-DE, 330 Proteine ​​durch Flüssigphasen-IEF, 96 Proteine ​​durch LC / MS E und 148 Proteine ​​identifiziertDurch 2D-LC / MS E (Tabelle 1).

Um die 422 identifizierten Proteine ​​hinsichtlich der subzellulären Lokalisation zu klassifizieren, wurde eine Software für die Gen-Ontologie (GO) -Analyse ( z. B. Cytoscape) verwendet. Das Netzwerk, das mit der Software und dem entsprechenden Plug-In erstellt wurde, zeigte, dass neben den erwarteten Proteinen, die in der extrazellulären Region lokalisiert sind (siehe oben rechts von Abbildung 2 ), die meisten Proteine, die durch die proteomischen Ansätze identifiziert wurden, aus dem intrazellulären Bereich stammten ( Dh Zytoplasma, Organellen, Vesikel und Zytoskelett). Zelloberflächenproteine ​​wurden ebenfalls identifiziert (Abbildung 2 ).

Die Ergebnisse wurden in drei unabhängigen Mitralklappenproben weiter bestätigt. Immunoblotting wurde verwendet, um eine Gruppe von vier Proteinen ( dh Septin-11, vier und ein halbes LIM-Domänen-Protein 1 (FHL-1), derMatopontin und Alpha-Kristallin B (CryAB)), die noch nie im normalen Mitralklappen identifiziert wurden (Abbildung 3 ).

Abbildung 1
Abbildung 1: Mitralklappenstruktur. Draufsicht auf das menschliche Herz zeigt das geschlossene ( A ) oder offene ( B ) menschliche Mitralklappe. Vorderansicht des linken Ventrikels eines menschlichen Herzens ( C ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Analyse der identifizierten Mitralklappenproteine ​​im Sinne der Zellverteilung. Cytoscape und das Plugin BiNGO wurden verwendet, um obtaiN die Verteilung der Gen-Ontologie (GO) Begriffe aus den zellulären Komponenten Kategorien. Die Kreisgröße ist proportional zur Anzahl der Proteinkomponenten, die mit den ausgewählten GO-Termen assoziiert sind, und die Farbskala für den p-Wert der Überdarstellung wird berichtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Immunoblotting-Analyse von Septin-11, FHL-1, Dermatopontin und CryAB in ganzem Extrakt aus drei menschlichen normalen Mitralklappenblättern. Das Immunoblotting wurde unter Verwendung eines monoklonalen Maus-Antikörpers gegen CryAB- und Kaninchen-polyklonale Antikörper gegen die Septin-11-, FHL-1- und Dermatopontin-Antikörper durchgeführt. BitteKlicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

<Td> x <Td> <Td> Proteasom Untereinheit Beta Typ 4 Vorläufer <Td> </ Tr> <Td> Transgelin 2 <Td> <Tr> <Td>
Beitritt Beschreibung 2-DE 2D-LC LC-MS E Flüssigphase IEF
A6NMZ7 Kollagen alpha VI X
O00151 PDZ und LIM Domäne Protein 1 X
O00299 Chlorid intrazelluläres Kanalprotein 1 X
O00764 Pyridoxalkinase X
O14558 Hitzeschockprotein Beta 6 X
O43399 Tumorprotein D54 X
O43488 Aflatoxin B1 Aldehydreduktaseelement 2 X
O43707 Alpha actinin 4 X X
O43866 CD5-Antigen wie Vorläufer X
O60493 Sortierung nexin 3 X
O60701 UDP-Glucose-6-dehydrogenase X
O75223 Uncharakterisiertes Protein X
O75368 SH3 Domäne Bindung Glutaminsäure reich wie Protein X
O75390 Citratsynthase mitochondrialer Vorläufer X
O75489 NADH-Dehydrogenase-Ubichinon-Eisen-Schwefel-Protein 3 mitochondrialer Vorläufer X X
O75608 Acyl-Protein-Thioesterase 1 X
O75828 Carbonylreduktase NADPH 3 X
O75874 Isocitratdehydrogenase NADP zytoplasmatisch X
O75955 Flotillin X
O94760 NG NG Dimethylarginindimethylaminohydrolase 1 X
O94788 Retinale Dehydrogenase 2 X
O95865 NG NG Dimethylarginindimethylaminohydrolase 2 X X
P00325 Alkoholdehydrogenase 1B X X
P00338 L-Lactat-Dehydrogenase Eine Kette X
P00352 Netzhautdehydrogenase 1 X
P00441 Superoxid-Dismutase Cu Zn X X
P00450 Ceruloplasmin Vorläufer X X
P00488 Koagulationsfaktor XIII A Kettenvorläufer X
P00491 Purin-Nukleosid-Phosphorylase X
P00492 Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase X
P00558 Phosphoglycerat-Kinase 1 X X
P00568 Adenylat-Kinase-Isoenzym 1 X
P00734 Prothrombin X X
P00738 Haptoglobin X X X X
P00739 Haptoglobin-verwandter Proteinvorläufer X
P00751 Komplementfaktor B X X X
P00915 Kohlensäureanhydrase 1 X
P00918 Kohlensäureanhydrase 2 X
P01008 Antithrombin-III-Vorläufer X X X
P01009 Alpha 1 Antitrypsin X X X X
P01011 Alpha 1 Antichymotrypsin X X X X
P01019 Angiotensinogenvorläufer X X
P01023 Alpha 2 -Makroglobulin X X
P01024 Ergänzung C3 X X X X
P01033 Metalloproteinase-Inhibitor 1-Vorläufer X
P01042 Kininogen 1 Vorläufer X
P01593 Ig Kappa Kette VI Region AG X
P01598 Ig Kappa Kette VI Region EU X
P01600 Ig Kappa Kette VI Region Hau X X
P01611 Ig Kappa Kette VI Region Wes X
P01620 Ig Kappa Kette V III Region SIE X
P01625 Ig Kappa Kette V IV Region Len X
P01766 Ig schwere Kette V III Region BRO X X
P01781 Ig schwere Kette V III Region GAL X
P01834 Ig Kappa Kette C Region X X X X
P01842 Ig Lambda Kette C Regionen X X X
P01857 Ig Gamma 1 Kette C Region X X X X
P01859 Ig Gamma 2 Kette C Region X X X X
P01860 Ig Gamma 3 Kette C Region X X X
P01861 Ig Gamma 4 Kette C Region X X X
P01871 Ig mu Kette C Region X X X
P01876 Ig alpha 1 Kette C Region X X X X
P01877 Ig alpha 2 Kette C Region X
P02144 Myoglobin X X
P02452 Kollagen alpha 1 I Kette X X X X
P02511 Alpha-Kristallin-B-Kette X
P02545 Lamin AC 70 kDa Laminat X X X X
P02647 Apolipoprotein AI X X X X
P02649 Apolipoprotein E X X X X
P02671 Fibrinogen alpha Kette X X X X
P02675 Fibrinogen beta Kette X X X X
P02679 Fibrinogen-Gammakette X X X X
P02689 Myelin P2-Protein X
P02735 Serum-Amyloid Ein Proteinvorläufer X
P02741 C reaktive Proteinvorstufe X
P02743 Serum-Amyloid-P-Komponente X X X X
P02746 Ergänzung C1q Unterkomponente Untereinheit B X X
P02747 Komplement C1q Unterkomponente Untereinheit C Vorläufer X
P02748 Ergänzungskomponente C9 X X X
P02749 Beta 2 Glykoprotein 1 X X X X
P02750 Leucin-reiche Alpha-2-Glykoprotein-Vorstufe X
P02751 Fibronectin X X
P02760 AMBP-Proteinvorläufer X X X X
P02763 Alpha-1-Säure-Glykoprotein 1 X X X
P02765 Alpha 2 HS-Glykoproteinvorläufer X
P02766 Transthyretinvorläufer X X X
P02768 Serumalbumin X X X X
P02774 Vitamin D bindende Proteinvorstufe X
P02787 Serotransferrin X X X X
P02788 Lactotransferrinvorläufer X
P02790 Hemopexin X X X X
P02792 Ferritin leichte Kette X
P04004 Vitronectin X X X X
P04075 Fructosebisphosphataldolase A X
P04083 Anhang A1 X X X X
P04179 Superoxid-Dismutase Mn mitochondrialer Vorläufer X
P04196 Histidin-reiche Glykoprotein-Vorstufe X
P04217 Alpha-1B-Glykoprotein-Vorläufer X X
P04350 Tubulin beta 4 Kette X
P04406 Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase X X X X
P04792 Hitzeschock-Protein Beta 1 X X X X
P05091 Aldehyddehydrogenase mitochondrialer Vorläufer X X
Plasmaprotease C1-Inhibitor-Vorläufer X
P05156 Komplementfaktor I Vorläufer X
P05413 Fettsäure bindende Protein Herz X
P05452 Tetranectinvorläufer TN X X
P05787 Keratin Typ II Zytoskelett 8 X
P06396 Gelsolin X X X X
P06576 ATP-Synthase-Untereinheit beta mitochondrialer Vorläufer X X
P06732 Creatinkinase M-Typ X X
P06733 Alpha-Enolase X X X X
P06753 Tropomyosin alpha 3 Kette X X
P07108 Acyl-CoA-bindendes Protein X
P07195 L-Lactat-Dehydrogenase-B-Kette X X X
P07196 Neurofilament Licht Polypeptid X
P07197 Neurofilament-Medium-Polypeptid X X
P07237 Protein-Disulfid-Isomerase-Vorläufer X X
P07339 Cathepsin D Vorläufer X X
P07355 Anhang A2 X X X X
P07360 Komplementkomponente C8-Gamma-Kettenvorläufer X
P07437 Tubulin beta Kette X X X X
P07585 Decorin X X X X
P07737 Profilin 1 X
P07858 Cathepsin B Vorläufer X
P07900 Hitzeschockprotein HSP 90 alpha X X
P07951 Tropomyosin-beta-Kette X
P07954 Fumarat-Hydratase-Mitochondrien-Vorläufer X
P07996 Thrombospondin 1 X X X
P08107 Hitzeschock 70 kDa Protein 1A 1B X X X X
P08123 Kollagen alpha 2 I Kette X X X X
P08133 Anhang A6 X X
P08238 Hitzeschockprotein HSP 90 beta X X
P08253 72 kDa Typ IV Kollagenase Vorläufer X
P08294 Extrazelluläre Superoxid-Dismutase Cu Zn vorUrsor X X X
P08590 Myosin-Lichtpolypeptid 3 X X
P08603 Ergänzungsfaktor H X X X X
P08670 Vimentin X X X X
P08729 Keratin Typ II Zytoskelett 7 X
P08758 Anhang A5 X X X X
P09211 Glutathion S Transferase P X X X
P09382 Galectin 1 X X X
P09417 Dihydropteridin-Reduktase X
P09493 Tropomyosin-1-alpha-Kette X X
P09525 Anhang A4 X X
P09651 Heterogenes nukleares Ribonukleoprotein A1 X
P09871 Ergänzung C1s Unterkomponente Vorläufer X
P09936 Ubiquitin-Carboxyl-terminales Hydrolase-Isozyme L1 X
P09972 Fructosebisphosphat-Aldolase C X
P0C0L4 Ergänzung C4 Ein Vorläufer X
P0CG05 Ich GLambda 2 Kette C Regionen X
P0CG38 POTE Ankyrin Domain Familienmitglied I X
P10515 Dihydrolipoyllysinrest-Acetyltransferase-Komponente des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes X
P10768 S Formylglutathionhydrolase X
P10809 60 kDa Hitzeschock Protein mitochondrialen Vorläufer X
P10909 Clusterin X X X X
P10915 Hyaluronan und Proteoglycan Link Protein 1 Vorläufer X X
P11021 78 kDa gLucose-reguliertes Protein X X X
P11047 Laminin Untereinheit Gamma 1 Vorläufer X
P11142 Hitzeschock cognate 71 kDa Protein X X X X
P11177 Pyruvat-Dehydrogenase-E1-Komponenten-Untereinheit beta mitochondrialer Vorläufer X
P11217 Glykogenphosphorylase-Muskelform X
P11310 Mittelketten-spezifische Acyl-CoA-Dehydrogenase mitochondriale Vorstufe X
P11413 Glucose-6-phosphat-1-dehydrogenase X
P11766 Alkohol Dehydrogenase Klasse 3 Chi Kette X
P12036 Neurofilament schweres Polypeptid X
P12109 Kollagen alpha 1 VI Kette X X X X
P12110 Kollagen alpha 2 VI Kette X X X X
P12111 Kollagen alpha 3 VI Kette X X X
P12277 Creatinkinase B-Typ X
P12429 Anhang A3 X X
P12814 Alpha actinin 1 X X
P12829 Myosin-Lichtpolypeptid 4 X
P12882 Myosin 1 X
P12883 Myosin 7 X X
P12955 Xaa Pro Dipeptidase X
P13489 Ribonuclease-Inhibitor X
P13533 Myosin 6 X X
P13611 Versican Kernprotein Vorläufer X X
P13639 Dehnungsfaktor 2 X
P13716 Delta-Aminolävulinsäure-Dehydratase X
P13796 Plastin 2 X
P13804 Elektronentransfer-Flavoprotein-Untereinheit alpha mitochondrialer Vorläufer X
P13929 Beta-Enolase X X
P14136 Glial fibrillärer saurer Protein Astrozyt X
P14314 Glucosidase 2 Untereinheit Beta Vorläufer X
P14550 Alkohol Dehydrogenase NADP X
P14618 Pyruvat-Kinase-Isozyme M1 M2 X X X
P14625 </ Td> Endoplasmin-Vorläufer X X
P15121 Aldose-Reduktase X
P15259 Phosphoglycerat-Mutase 2 X
P16152 Carbonylreduktase NADPH 1 X
P17066 Hitzeschock 70 kDa Protein 6 X X X
P17174 Aspartat-Aminotransferase zytoplasmatisch X
P17540 Creatin-Kinase-Sarkom-Mitochondrien-Vorläufer X
P17661 Desmin X X X X
P17980 26S-Protease-regulatorische Untereinheit 6A X
P17987 T-Komplex-Protein 1 Untereinheit alpha X
P18206 Vinculin X X
P18428 Lipopolysaccharid-bindende Proteinvorstufe X
P18669 Phosphoglycerat-Mutase 1 X
P19105 Myosin regulatorische Lichtkette 2 X X
P19623 Spermidin-Synthase X
P19652 Alpha 1 Säure Glykoprotein 2 Vorläufer X X
P19823 Inter alpha Trypsin-Inhibitor schwere Kette H2 X
P19827 Inter alpha Trypsin-Inhibitor schwere Kette H1 X X
P20073 Anhang A7 X
P20618 Proteasom Untereinheit Beta Typ 1 Vorläufer X
P20774 Mimecan X X X X
P21266 Glutathion S Transferase Mu 3 X
P21333 Filamin A X X
P21796 Spannungsabhängiges anionselektives Kanalprotein1 X
P21810 Biglycan X X X X
P21980 Protein Glutamin Gamma Glutamyltransferase 2 X X
P22105 Tenascin X X X
P22314 Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1 X
P22352 Glutathionperoxidase 3 Vorläufer X X
P22626 Heterogene nukleare Ribonucleoproteine ​​A2 B1 X
P22695 Ubiquinol-Cytochrom-c-Reduktase-Komplex-Kernprotein 2 mitochondrialer Vorläufer X
P23141 Leber Carboxylesterase 1 Vorläufer X
P23142 Fibulin 1 X X X X
P23284 Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase-B-Vorläufer X
P23381 Tryptophanyl-tRNA-Synthetase-Zytoplasma X
P23526 Adenosylhomocysteinase X X
P23528 Cofilin 1 X
P24752 Acetyl-CoA-Acetyltransferase-mitochondrialen Vorläufers X
P25311 Zink Alpha 2 GlykoproteiN Vorläufer X
P25705 ATP-Synthase-Untereinheit alpha mitochondrial X
P25788 Proteasom Untereinheit Alpha Typ 3 X X
P25789 Proteasom Untereinheit Alpha Typ 4 X
P26447 Protein S100 A4 X
P27348 14 3 3 Protein-Theta X X
P27797 Calreticulin-Vorläufer X
P28066 Proteasom Untereinheit Alpha Typ 5 X
P28070 X X
P28072 Proteasom Untereinheit Beta Typ 6 Vorläufer X
P28074 Proteasom Untereinheit Beta Typ 5 Vorläufer X
P28331 NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase 75 kDa-Untereinheit mitochondrialer Vorläufer X
P28838 Cytosolaminopeptidase X
P29218 Inositolmonophosphatase X
P29401 Transketolase X
P29692 Dehnungsfaktor 1 Delta X
P29966 Myristoyliertes alaninreiches C-Kinase-Substrat X
P30040 Endoplasmatisches Retikulumprotein ERp29 Vorläufer X
P30041 Peroxiredoxin 6 X X
P30043 Flavin-Reduktase X
P30044 Peroxiredoxin 5 mitochondrialer Vorläufer X
P30085 UMP CMP Kinase X
P30086 Phosphatidylethanolamin-bindendes Protein 1 X
P30101 ProteiN-Disulfid-Isomerase-A3-Vorläufer X X X
P30613 Pyruvat-Kinase-Isozyme RL X
P30740 Leukozytenelastase-Inhibitor X
P31025 Lipocalin 1 Vorläufer X
P31937 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase-mitochondrialen Vorläufers X
P31942 Heterogenes nukleares Ribonukleoprotein H3 X
P31943 Heterogenes nukleares Ribonukleoprotein H X
P31946 14 3 3 Protein beta alpha X X
P31948 Stress induziertes Phosphoprotein 1 X
P31949 Protein S100 A11 X
P32119 Peroxiredoxin 2 X X
P34931 Hitzeschock 70 kDa Protein 1 wie X X
P34932 Hitzeschock 70 kDa Protein 4 X
P35232 Prohibitin X
P35237 Serpin B6 X
P35443 Thrombospondin 4 X
P35555 Fibrillin 1 X X
P35579 Myosin 9 X X X
P35580 Myosin 10 X X
P35609 Alpha actinin 2 X
P35625 Metalloproteinase-Inhibitor 3 X X
P35998 26S-Protease-regulatorische Untereinheit 7 X
P36871 Phosphoglucomutase 1 X X
P36955 Pigment-Epithel abgeleitet Faktor X X
P37802 X X
P37837 Transaldolase X
P38117 Elektronentransfer-Flavoprotein-Untereinheit beta X
P38646 Stress 70 Protein mitochondrialen Vorläufer X X
P39687 Acidisches Leucin-reines Kernphosphoprotein 32 Familienmitglied A X
P40121 Makrophagen-Verschlussprotein X
P40925 Malat dehydrogenase zytoplasmatisch X
P40926 Malch-Dehydrogenase-Mitochondrienvorläufer X
P41219 Peripherin X
P42330 Aldo Keto Reduktase Familie 1 Mitglied C3 X
P45880 Spannungsabhängiges anionselektives Kanalprotein 2 X
P47755 F Aktin Capping Protein Untereinheit Alpha 2 X X
P47756 F-Aktin-Verschluss-Protein-Untereinheit beta X X
P47985 Ubiquinol Cytochrom c Reduktase Eisen Schwefel Untereinheit mitochondrialen Vorläufer X
P48047 ATP-Synthase O-Untereinheit mitochondrialen Vorläufer X
P48637 Glutathion-Synthetase X
P48741 Hitzeschock 70 kDa Protein 7 X X
P49189 4 Trimethylaminobutyraldehyddehydrogenase X
P49368 T-Komplex-Protein 1 Untereinheit Gamma X
P49747 Knorpel-oligomere Matrixprotein X X X X
P49748 Sehr langkettige spezifische Acyl-CoA-Dehydrogenase-mitochondriale Vorstufe X
P50395 Rab BIP-Dissoziation Inhibitor Beta X X </ Td>
P50454 Serpin H1 Vorläufer X
P50995 Anhang A11 X
P51452 Duale Spezifität Protein Phosphatase 3 X
P51884 Lumican X X X X
P51888 Prolargin Vorläufer X X X X
P52565 Rho-BIP-Dissoziationsinhibitor 1 X
P52566 Rho-BIP-Dissoziationsinhibitor 2 X
P54652 Hitzeschock im Zusammenhang mit 70 kDa Protein 2 X X X X
P55072 Übergangsendoplasmatisches Retikulum ATPase X
P55083 Mikrofibrillen-assoziiertes Glykoprotein-4-Vorläufer X X
P57053 Histon H2B Typ F X
P60174 Triosephosphat-Isomerase X X X
P60660 Myosin-Lichtpolypeptid 6 X X
P60709 Actin zytoplasmatisch 1 X X X X
P60981 Destrin X
P61086 Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2 25 kDa X
P61088 Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2 X
P61224 Ras verwandter Protein Rap 1b Vorläufer X
P61978 Heterogenes nukleares Ribonukleoprotein K X X
P61981 14 3 3 Protein-Gamma X X X
P62258 14 3 3 Protein epsilon 14 3 3E X
P62491 Ras verwandtes Protein X
P62714 Serin-Threonin-Protein-Phosphatase 2A katalytische Untereinheit Beta-Isoform X
P62736 Actin Aorta glatte Muskulatur X X X
P62805 Histone H4 X
P62826 GTP-Bindungs-Kernprotein Ran X
P62873 Guanin-Nukleotid-Bindungsprotein GIGSGT-Untereinheit beta 1 X
P62879 Guanin-Nukleotid-Bindungsprotein GIGSGT-Untereinheit beta 2 X
P62937 Peptidylprolylcis-trans-Isomerase A X X
P62987 Ubiquitin 60S ribosomales Protein L40 X
P63104 14 3 3 proTein zeta delta X X X X
P63241 Eukaryotischer Translationsinitiierungsfaktor 5A 1 X
P63244 Guanin-Nukleotid-bindende Protein-Untereinheit beta 2 wie 1 X
P63267 Actin gamma enterischen glatten Muskel X X
P67936 Tropomyosin alpha 4 Kette X
P68032 Actin alpha Herzmuskel 1 X
P68104 Dehnungsfaktor 1 alpha 1 X X X
P68133 Aktin-Alpha-Skelettmuskel
P68363 Tubulin alpha 1B Kette X X X
P68371 Tubulin beta 2C Kette X X X
P68402 Plättchenaktivierungsfaktor Acetylhydrolase IB Untereinheit beta X
P68871 Hämoglobin-Untereinheit beta X X X
P69905 Hämoglobin-Untereinheit alpha X X
P78371 T-Komplex-Protein 1 Untereinheit beta X
P78417 Glutathion transferase omega 1 X X
P80748 Ig Lambda Kette VIII Region LOI X
P98095 Fibulin 2 X X
Q01082 Spectrin Beta Ketten Gehirn 1 X
Q01449 Myosin regulatorische leichte Kette 2 atriale Isoform X
Q01518 Adenylylcyclase assoziiertes Protein 1 X
Q01995 Transgelin Glattes Muskelprotein 22 alpha X
Q03252 Lamin B2 X X
Q03591 Komplementfaktor H-verwandter Protein 1-Vorläufer X
Q04917 14 3 3 Protein eta X X
Q06323 Proteasom Aktivator komplexe Untereinheit 1 X
Q06828 Fibromodulin X X X X
Q06830 Peroxiredoxin 1 X X
Q07507 Dermatopontin X X X X
Q07960 Rho GTPase Aktivierungsprotein 1 X
Q08257 Quinone Oxidoreduktase X
Q08431 Lactadherin X X
Q12765 SEcernin 1 X
Q13011 Delta 3 5 Delta 2 4 Dienoyl CoA Isomerase mitochondrialer Vorläufer X X
Q13228 Selen bindendes Protein 1 X X
Q13404 Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2-Variante 1 X
Q13409 Cytoplasmatische Dynein 1 Zwischenkette 2 X
Q13509 Tubulin beta 3 Kette X X X
Q13642 Vier und eine halbe LIM Domänen Protein 1 X
Q13765 Nascent Polypeptid assoziierte komplexe Untereinheit alpha X
Q13885 N Tubulin beta 2A Kette X X
Q14194 Dihydropyrimidinase-verwandtes Protein 1 X
Q14195 Dihydropyrimidinase-verwandtes Protein 3 X X X X
Q14624 Inter alpha Trypsin-Inhibitor schwere Kette H4 Vorläufer X
Q14697 Neutrale Alpha-Glucosidase-AB-Vorstufe X
Q14764 Großes Gewölbeprotein X
Q14767 Latentes transformierendes Wachstumsfaktor Beta-Bindungsprotein 2 X X
Q14894 Mu-Kristallin-Homolog-NADP-reguliertes Schilddrüsenhormon-bindendes Protein X
Q15063 Periostinvorläufer X X X X
Q15084 Protein-Disulfid-Isomerase A6-Vorläufer X
Q15113 Prokollagen C Endopeptidase Enhancer 1 Vorläufer X
Q15181 Anorganische Pyrophosphatase X
Q15365 Poly-rC-bindendes Protein 1 X
Q15366 Poly-rC-bindendes Protein 2 X
Q15582 Umwandlungswachstumsfaktor beta-induziertes Protein X X X
Q15819 Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2-Variante 2 X
Q16352 Alpha-Internexin X
Q16473 Putative Tenascin XA X
Q16555 Dihydropyrimidinase-verwandtes Protein 2 X X X
Q16698 2 4 Dienoyl-CoA-Reduktase-mitochondrialen Vorläufer X
Q16891 Mitochondriale innere Membran X
Q562R1 Beta Aktin wie Protein 2 X
Q6S8J3 POTE Ankyrin Domain Familienmitglied E X
Q6UWY5 Olfactomedin wie Protein 1 Vorläufer X X
Q71U36 Tubulin alpha 1A Kette X X X
Q7Z7G0 Ziel von Nesh SH3 Vorläufer X X X
Q8WUM4 Programmierter Zelltod 6 wechselwirkendes Protein X
Q8WWX9 Thioredoxin wie Selenoprotein M Vorläufer X
Q92597 Protein NDRG1 X
Q92945 Weites stromaufwärtiges Element Bindungsprotein 2 X
Q96CN7 Isochorismatase-Domäne mit Protein 1 X
Q96CX2 BTB POZ Domäne mit Protein X
Q96KK5 Histon H2A Typ 1 H X X
Q96KP4 Cytosolische unspezifische Dipeptidase X
Q99426 Tubulinspezifischer Chaperon B X
Q99497 Protein DJ 1 X X
Q99536 Synaptisches Vesikelmembranprotein X X X
Q99714 3 Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase Typ 2 X
Q99715 Kollagen alpha 1 XII Kette X X
Q99798 Aconitate Hydratase mitochondrialen Vorläufer X
Q9BQE3 Tubulin alpha 6 Kette X
Q9BUF5 Tubulin beta 6 Kette X X
Q9BUT1 3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase Typ 2 X
Q9BVA1 Tubulin beta 2B Kette X X X
Q9BXN1 Asporin X X </ Td> X X
Q9H0W9 Ester Hydrolase C11orf54 X
Q9H4B7 Tubulin beta 1 Kette X
Q9NRN5 Olfactomedin wie Protein 3 Vorläufer X X
Q9NRV9 Heme-bindendes Protein 1 X
Q9NSB2 Keratin Typ II cuticular Hb4 X X
Q9NVA2 Septin 11 X
Q9UBR2 Kathepsin-Z-Vorläufer X
Q9UBX5 Fibulin 5 X X
Q9UK22 F-Box nur Protein 2 X
Q9Y277 Spannungsabhängiges anionselektives Kanalprotein 3 X
Q9Y281 Cofilin 2 X
Q9Y490 Talin 1 X
Q9Y696 Chlorid intrazelluläres Kanalprotein 4 X
Q9Y6C2 EMILIN 1 X X

Tabelle 1: Liste der im Mitralklappengewebeextrakt identifizierten Proteine, wenn vier verschiedene proteomische Ansätze angewendet wurden: zweidimensionale Elektrophorese (2-DE), zweidimensionale LC-MS E (2D-LC / MS E ), LC / MS E und Flüssigphasen-IEF. Die Methode, mit der jedes Protein identifiziert wurde, wird berichtet.

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Discussion

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Ein kritischer Schritt dieses Protokolls ist die Verwendung von flüssigem Stickstoff, um die Probe einzufrieren und das Mahlsystem zu kühlen. Die Verwendung von flüssigem Stickstoff verhindert biologischen Abbau und ermöglicht eine effiziente Pulverisierung, erfordert aber eine spezielle Schulung für eine sichere Handhabung.

In diesem Protokoll ist ein Schleifsystem für das Probenschleifen, da kleine Proben schwer von Standardmörtel und Stößeln zu erholen sind. In diesem Fall breiten sich kleine Proben als feines Pulver über die Mörteloberfläche aus und machen die Sammlung schwierig. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Schleifmaschine motorisiert wird, wodurch eine größere Anzahl von Proben reproduzierbar und ohne zusätzliche Ermüdung verarbeitet werden kann. Eine Begrenzung der Verwendung einer Schleifmaschine ist, dass die Größe der Probe, die klein sein muss (100 mg oder weniger) für die Stößel wirksam gegen den Mörtel gedrückt werden muss. Darüber hinaus müssen die Schleiferkomponenten auf Raumtemperatur zwischen den Verwendungen für die Reinigung erwärmt werden G. Folglich ist das Verfahren zeitaufwendig und wenn viele Proben täglich verarbeitet werden, werden viele Sätze benötigt.

Ein weiterer kritischer Schritt ist die Vorbereitung des Extraktionspuffers. Die Salzkonzentrationen, besonders für den Harnstoff (8 M) und Thioharnstoff (2 M), sind recht hoch; So ist das Salzvolumen fast die Hälfte des Gesamtvolumens der Lösung. Darüber hinaus ist die Auflösung nicht leicht zu bedenken, dass Wärme vermieden werden muss, da bei mehr als 37 ° C Harnstoff zu Protein-Carbamylierung an den N-Termini von Proteinen / Peptiden und an den Seitenketten-Aminogruppen von Lysin- und Argininresten führen kann . Sobald es gelöst ist, muss der Harnstoffpuffer mit 0,22 μm Filtern filtriert werden und kann bei -80 ° C für 4 Wochen gelagert werden, ohne seine Extraktionswirksamkeit zu beeinträchtigen, aber er muss vor dem Gebrauch auf mehr als 15 ° C erwärmt werden, um eine vollständige Auflösung zu ermöglichen .

Änderungen und Fehlersuche

In diesem Protokoll wird die Proteinextraktion unter Verwendung des beschriebenen Harnstoffpuffers durchgeführt, da es eine der am häufigsten verwendeten Proteinextraktionslösungen für proteomische Untersuchungen aufgrund ihrer Kompatibilität mit der Isoelektrofokussierung und deren Effizienz bei der Solubilisierung schwerlöslicher Proteine ​​ist Dass dieser Puffer sehr sparsam lösliche Proteine, wie z. B. integrale Membranproteine 19 , oder Proteine, die stark anfällig für Aggregation sind, wie Tubulin 18 , sehr gut löslich sind. Weiterhin ist dieser Puffer voll kompatibel mit dem Bradford-Assay zur Bestimmung der Proteinkonzentration und Es kann direkt in 2-DE- und Flüssigphasen-IEF-Analysen eingesetzt werden.

Dieser Puffer ist jedoch nicht ideal für die Solubilisierung aller in einer Probe vorhandenen Proteine. Es ist möglich, dass verschiedene Extraktionspuffer Proteine ​​zeigen konnten, die durch dieses Protokoll nicht nachweisbar waren. Zum Beispiel ist es gut knoMit welchen ribosomalen und nuklearen Proteinen mit Säureextraktion oder Trichloressigsäure / Aceton-Präzipitation 20 besser extrahiert werden können, während alkalische pH-Werte für die Membranproteine 21 , 22 besser geeignet sind. Daher kann die Verwendung von alternativen Puffern zusätzliche Schritte zur Proteinausfällung erfordern, um Salze zu eliminieren, die mit 2-DE oder Flüssigphasen-IEF interferieren.

Einschränkungen der Technik

Die Anzahl der durch dieses Protokoll identifizierten Proteine ​​ist relativ gering, aber die Anzahl der Identifikationen und die Abdeckung der Proteomanalyse können durch den Einsatz modernerer Instrumente weiter erhöht werden, deren Massengenauigkeit und Sequenzgeschwindigkeit in den letzten Jahren dramatisch angestiegen sind Es ist möglich, einen großen Teil des Proteoms ohne jegliche Vorbeugungsschritte zu decken, indem man einen langen Gradienten für flüssige ChRomatographische Trennungen gekoppelt mit einem hochauflösenden MS-Instrument mit einer schnellen Sequenzgeschwindigkeit 24 .

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / alternative Methoden

Die Fähigkeit, Proteine ​​in den menschlichen Herzklappen zu identifizieren und zu quantifizieren, wie das Mitralklappen, ist eine wichtige und herausfordernde Aufgabe, die dazu beitragen wird, die Mechanismen der physiologischen / pathologischen Prozesse bei Ventilkrankheiten aufzuklären. Die Definition der Veränderungen des Mitralklappen-Proteoms wird das Verständnis der Natur der biologischen Prozesse, die mit dem Krankheitszustand des Gewebes verbunden sind, stark erhöhen.

Das aktuelle Wissen über die Physiopathologie des Mitralklappens ist begrenzt und wird in der Regel durch die Analyse einzelner Proteine, die an spezifischen Prozessen beteiligt sind, wie z. B. extrazelluläre Matrix-Remodellierung, Hämostase, Entzündungen oder oxidativer Stress, erhalten 9 , 10 .

Der Mangel an umfassenden proteomischen Studien kann der Komplexität dieses niederzellulären Gewebes zugeschrieben werden, das hochgradig reich an extrazellulären Matrixproteinen ( dh Proteoglykanen, Kollagen und Elastin) ist. Diese Proteine ​​machen etwa 80% der Gesamtmenge aus und behindern die Analyse von Proteinen mit geringer Häufigkeit 26 .

So war es notwendig, ein effizientes Extraktionsprotokoll zu etablieren, um die Protein-Solubilisierung zu maximieren, um das Proteom dieses Gewebes zu beschreiben. Dieses Protokoll erlaubte die Extraktion von ~ 50 μg Protein aus 1 mg Gewebe. Dies ist eine relativ geringe Ausbeute im Vergleich zu "weichem" GewebeAls Leber (~ 135 μg aus 1 mg Gewebe), aber es genügt, eine Proteinanalyse an einzelnen Proben durchzuführen. Dies ist besonders relevant bei der Definition der intraindividuellen Variabilität eines Phänomens.

Darüber hinaus hat diese Methode den Vorteil, mit vielen analytischen Anwendungen kompatibel zu sein. Die in dem vorgeschlagenen Extraktionspuffer gelösten Mitralklappenproteine ​​können direkt für die Immunoblotting- und Proteomanalyse auf Basis der zweidimensionalen Elektrophorese und der Flüssigphasen-Isoelektrophorese 11 , 12 oder nach der Proteinausfällung zur Beseitigung der Pufferkomponenten-Interferenz für andere Assays, wie z Gel-freie Massenspektrometrie 15 .

Mit der Anwendung dieses Extraktionsprotokolls wurde eine erschöpfende Charakterisierung der Proteinkomponenten des normalen Mitralklappengewebes durch die Identifizierung von vielen intracel erhaltenLose Proteine. Diese Proteine ​​sind im Cytosol oder in Organellen nicht nur in der extrazellulären Matrix lokalisiert und haben unterschiedliche molekulare und biologische Funktionen. Andere interessante Proteine ​​( dh CryAB, Septin-11, FHL-1 und Dermatopontin) wurden ebenfalls identifiziert. Diese Proteine ​​haben im Mitralklappen unbekannte Funktionen, aber ihre biologischen Eigenschaften deuten auf eine mögliche Rolle bei Ventilkrankheiten hin.

Zukünftige Anwendungen oder Richtungen nach der Beherrschung dieser Technik

Mit diesem Protokoll ist es möglich, Daten bezüglich der Proteinexpression mit Daten über die quantitative mRNA-Expression und nicht-quantitative immunhistochemische Analysen zu korrelieren. In der Tat, wenn sie zusammen verwendet werden, werden diese Ansätze zu einem umfassenderen Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Krankheit zugrunde liegen, von der mRNA bis zur posttranslationalen Proteinmodifikation führen. So kann diese Methode für Forscher von Interesse sein, die sich auf die Herz-Ventil-Physiopathologie konzentrieren. FlosseKann dieses Protokoll auch auf das Schweine-Mitralklappen angewendet werden, das eine enge Ähnlichkeit mit dem menschlichen Ventil 27 hat und als experimentelles Modell für die Ventilfunktionsbewertung verwendet wird.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Das italienische Gesundheitsministerium unterstützte diese Studie (RC 2013-BIO 15). Wir danken Barbara Micheli für ihre hervorragende technische Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

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References

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Optimiertes Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus dem menschlichen Mitralventil
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Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).More

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

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