Een selectieve en gevoelige vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie (LC-MS / MS) methode gekoppeld aan een efficiënte vaste fase-extractie op een microplaat van 96-putjes met gemengde modus kation-uitwisseling (MCX) 96-putjes werd ontwikkeld voor het meten van vrije 3-nitrotyrosine ( 3-NT) in menselijke urine met hoge doorvoer, die geschikt is voor klinische toepassingen.
Vrij 3-nitrotyrosine (3-NT) is uitgebreid gebruikt als een mogelijke biomarker voor oxidatieve stress. Verhoogde niveaus van 3-NT zijn gerapporteerd in een grote verscheidenheid aan pathologische aandoeningen. Bestaande methoden beschikken echter niet over voldoende gevoeligheid en / of specificiteit die nodig is om het lage endogene niveau van 3-NT betrouwbaar te meten en zijn te moeizaam voor klinische toepassingen. Dientengevolge is analytische verbetering dringend nodig om de niveaus van 3-NT nauwkeurig te kwantificeren en de rol van 3-NT bij pathologische omstandigheden te verifiëren. Dit protocol presenteert de ontwikkeling van een nieuwe vloeistofdetectormetrie (LC-MS / MS) detectie gecombineerd met een miniaturized solid phase extraction (SPE) voor de snelle en nauwkeurige meting van 3-NT in menselijke urine als een niet-invasieve biomarker Voor oxidatieve stress. SPE met behulp van een 96-putje plaat zorgde voor een aanzienlijke vereenvoudiging van het proces door het verzamelen van monsteropruiming en analytverrijking zonder vervelende derivatisatie- en verdampingsstappen, Het verminderen van oplosmiddelverbruik, afvalverwijdering, risico op verontreiniging en totale verwerkingstijd. De overeenkomst van 25 mM ammoniumacetaat (NH4 OAc) bij pH 9 als SPE elutie-oplossing aanzienlijk verbeterde selectiviteit. Massaspectrometriesignaalrespons werd verbeterd door aanpassing van de multiple reaction monitoring (MRM) overgangen. Het gebruik van 0,01% HCOOH als additief op een pvaffluorfenyl (PFP) kolom (150 mm x 2,1, 3 μm) verbeterde signaalrespons nog 2,5 keer en verkort de totale looptijd tot 7 minuten. Een lagere limiet van kwantificering (LLOQ) van 10 pg / ml (0,044 nM) werd bereikt, wat een significante gevoeligheidsverbetering voor de gerapporteerde assays vertegenwoordigt. Met deze vereenvoudigde, snelle, selectieve en gevoelige methode kunnen twee platen urinemonsters (n = 192) worden verwerkt in een 24 uur tijdsperiode. Gezien de aanzienlijk verbeterde analytische prestatie, en niet-invasieve en goedkope urine steekproefneming, is de voorgestelde test voordelig voor preklinische en klinischestudies.
De effecten van oxidatieve stress op de klinische presentatie zijn de laatste jaren in de voorhoede getrokken 1 . Een van de biomarkers die worden onderzocht, is 3-nitrotyrosine (3-NT), een eindstabiel product dat wordt gevormd wanneer reactieve stikstofsoorten (RNS) interageren met tyrosine, een catecholamine neurotransmitter precursor. Terwijl 3-NT klinische waarde kan hebben als biomarker voor RNS in vivo, kunnen de substantiële veranderingen van de eigenschappen en functies van tyrosine de overeenkomstige eiwitten en cellulaire functies 1 , 2 nadelig beïnvloeden. Opkomende onderzoeken hebben voorgesteld dat 3-NT een belangrijke rol kan spelen bij ontstekingsomstandigheden 3 , neurodegeneratieve stoornissen 4 , 5 , hart- en vaatziekten 6 en diabetes 7 , alsmede de condities die verband houden met oxidatieve stress. Echter, deze obsRvations zijn gebaseerd op resultaten van methoden die niet gevoelig zijn voor en / of selectiviteit 8 , 9 , 10 , 11 . De enorme concentraties van 3 NT voor de biologische monsters die eerder in de literatuur zijn gerapporteerd, tonen aan dat er ernstige analysemethoden met deze analyses zijn geassocieerd en technische verbeteringen nodig zijn om de niveaus van 3-NT nauwkeurig te kwantificeren en de rol ervan te controleren in de pathologie van deze omstandigheden .
De kwantificering van gratis 3-NT in biologische matrices geeft een speciale uitdaging voor man en instrument 8 , 9 , 10 , 11 . Ten eerste vraagt het spoorniveau van endogeen 3-NT een ultragevoelige detectie; Ten tweede, het bestaan van tal van structureel vergelijkbare analoges, in het bijzonder tyrosine, dat aanwezig is inEnorme overmaat, vereist een hoge mate van selectiviteit; Ten derde vereist de artefactuele vorming van 3-NT door tyrosine nitrering met alomtegenwoordig nitraat en nitriet speciale aandacht tijdens de monstervoorbereiding om valse overschatting van 3-NT te vermijden.
Onder een grote verscheidenheid aan methodieken die zijn gebruikt om 3-NT te meten, is MS / MS beschouwd als de gouden standaard methode vanwege de superieure gevoeligheid en selectiviteit 11 , 12 , 13 , 14 . Gaschromatografie (GC) gekoppelde MS / MS biedt de beste gevoeligheid, maar de onontbeerlijke steekproef derivatisatie stappen zijn te vervelend en tijdrovend om efficiënt te zijn voor klinische toepassingen 15 , 16 . LC-MS / MS vereist geen complexe monster derivatisatie, waardoor het de veelbelovende optie is. Niettemin zijn er verschillende obstakels om te overwinnen, zoals de seNsitiviteit van LC-MS / MS-methoden die in de literatuur worden gerapporteerd, moet worden verbeterd voor de meting van laag overvloedig 3-NT 7 , 17 , 18 en de relatief lange omkeertijd moet worden verkort voor toepassingen met hoge doorvoer 12 , 13 , 17 , 19 .
Bovendien, bij het overwegen van klinische toepassingen, speelt de biologische matrix een belangrijke rol. Het zou makkelijk en goedkoop zijn om, indien mogelijk, 20 , 21 , 22 te verkrijgen en niet invasieve te maken. Plasma, het traditioneel gebruikte monster in de literatuur, is geen klinisch gewenste matrix, dus een methodologie die gebruik maakt van urine, die niet invasieve en kosteneffectief is, werd gezocht.
Verschillende pogingen om rel. Te ontwikkelenLable en specifieke LC-MS / MS methodologieën zijn gemaakt met behulp van urine 9 , 10 , 11 . Echter, ze zijn allemaal niet zozeer selectief, betrouwbaar of efficiënt genoeg voor klinisch gebruik. De effectiviteit van de overheersende SPE met behulp van traditionele omkeerfase cartridge (C18 type) als monsteropruiming voor de 3-NT analyse is ondervraagd en een sequentiële SPE van sterke kationuitwisseling (SCX) en omgekeerde fase C18-OH is voorgesteld 6 , 7 , 19 . Een recent ontwikkelde LC-MS / MS methode gebruikte een multi-stap zuivering proces van handmatige C18 SPE, preparatieve hogedruk vloeistofchromatografie (HPLC) en online SPE voor analyse van 3-NT 23 . Hoewel deze methode voor klinische doeleinden gevoelig genoeg was, met een LLOQ van 0,041 nM, was het opruimingsproces intensief en vervelend en vereisteRood 3 ml urine, het beperken van de haalbaarheid voor hoge doorvoer. Een molecuulgeïmprimeerd polymeer werd gebruikt als het SPE sorbent om de efficiëntie van het opruimingsproces 14 te verbeteren, maar de resulterende LLOQ (0,7 ug / ml) was niet laag genoeg voor klinische exemplaren. Een andere methode vereist tweedimensionale (2D) LC-MS / MS en immunoaffiniteitskromatografie voor het opruimen van het monster om een detectiegrens (LOD) van 0,022 nM 24 te bereiken . Hoewel al deze methoden vooruitgang hebben geboekt bij de beoordeling van 3-NT, heeft niemand de gevoeligheid, betrouwbaarheid en efficiëntie die nodig zijn voor klinische toepassingen bereikt.
Om de pathologie van gratis 3-NT en zijn rol als biomarker van oxidatieve stress in klinische instellingen te onderzoeken, hebben we een methodologie ontwikkeld die eenvoudig, efficiënt, nauwkeurig en nauwkeurig is, waardoor klinische toepassingen met hoge doorgang 25 kunnen worden toegepast . Een geminiaturiseerde gemengd mode kation exc(MCX) 96-putjes extractiemicroplate werd geïmplementeerd om eenvoudig en effectief monsteropruiming en verrijking van 3-NT in een enkele extractie te verwezenlijken die de nadelen in de bestaande methoden die derivatisatie, verdamping en 2D-LC vereisen omzeilen. Vloeistofchromatografie met 0,01% HCOOH als additief in mobiele fase bood een verbeterde signaalrespons met een snelle cyclustijd aan. Selectiviteit werd verder verbeterd door toepassing van een mild NH4 OAc elutieoplossing voor selectieve elutie van 3-NT, en het gebruik van MRM overgang voor zowel 3-NT en de interne standaard (IS). Het matrix effect werd gecompenseerd door gebruik te maken van een gereduceerde hoeveelheid van een voorkeur 13 C-gelabelde isotopische IS voor kwantificering. Met de komst van deze methodologie kunnen onderzoekers en clinici de rol van 3-NT in klinische condities verifiëren en de impact van oxidatieve stress verder onderzoeken.
Ernstige variaties in concentraties die eerder zijn gerapporteerd in de literatuur voor het endogene vrije 3-NT in menselijke urine monsters onthullen methodologische problemen in verband met beschikbare assays 8 , 9 , 10 , 11 . Een nauwkeurige bepaling van het lage basale niveau van 3-NT in menselijke urine blijft een uitdagende taak die speciale voorzorgsmaatregelen vereist voor het voorbere…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zouden Scott Howard en Abigail Marinack erkennen voor algemene ondersteuning en coördinatie van dit werk.
3-Nitro-L-tyrosine | Sigma | N7389-5g | |
3-Nitro-L-tyrosine-13C9 | Sigma | 652296-5.0mg | |
Mass Spec Gold Urine | Golden West Biologicals | MSG 5000-1L | |
Oasis MCX 96-well µElution plate | Waters | 186001830BA | |
2mL 96 well collection plate | Phenomenex | AH0-7194 | |
96 positive processor | Waters | 186005521 | |
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol | Sigma | 14262-2L | |
LC-MS Ultra CHROMASOLV water | Sigma | 14263-2L | |
Formic acid for mass spectrometry | Sigma | 94318-50ML-F | |
Ammonium hydroxide solution | Sigma | 338818-1L | |
Ultra PFP propyl columns | Restek | 9179362 | |
5500 Triple quad | AB Sciex | / | Contact manufacture for more detail |
UFLC-XR | Shimadzu | / | Contact manufacture for more detail |
Integra 400 Plus | Roche | / | Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method |
LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial | Waters | 600000751CV | |
LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial | Waters | 186000384C | |
5 mL transport tube | Phenix | TT-3205 | |
50 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2263 | |
15 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2266 | |
eLine electronic pipette | Sartorius | 730391 | |
Microfuge centrifuge | Beckman Coulter | A46474 | |
OHAUS balance | Kennedy Scales, inc. | 735 | |
Vortex mixer | Bernstead Thermolyne | M16715 |