Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Integratie van Gefinatiseerde Solid Phase Extraction en LC-MS / MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Menselijke Urine voor Klinische Toepassingen

doi: 10.3791/55778 Published: July 14, 2017

Summary

Een selectieve en gevoelige vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie (LC-MS / MS) methode gekoppeld aan een efficiënte vaste fase-extractie op een microplaat van 96-putjes met gemengde modus kation-uitwisseling (MCX) 96-putjes werd ontwikkeld voor het meten van vrije 3-nitrotyrosine ( 3-NT) in menselijke urine met hoge doorvoer, die geschikt is voor klinische toepassingen.

Abstract

Vrij 3-nitrotyrosine (3-NT) is uitgebreid gebruikt als een mogelijke biomarker voor oxidatieve stress. Verhoogde niveaus van 3-NT zijn gerapporteerd in een grote verscheidenheid aan pathologische aandoeningen. Bestaande methoden beschikken echter niet over voldoende gevoeligheid en / of specificiteit die nodig is om het lage endogene niveau van 3-NT betrouwbaar te meten en zijn te moeizaam voor klinische toepassingen. Dientengevolge is analytische verbetering dringend nodig om de niveaus van 3-NT nauwkeurig te kwantificeren en de rol van 3-NT bij pathologische omstandigheden te verifiëren. Dit protocol presenteert de ontwikkeling van een nieuwe vloeistofdetectormetrie (LC-MS / MS) detectie gecombineerd met een miniaturized solid phase extraction (SPE) voor de snelle en nauwkeurige meting van 3-NT in menselijke urine als een niet-invasieve biomarker Voor oxidatieve stress. SPE met behulp van een 96-putje plaat zorgde voor een aanzienlijke vereenvoudiging van het proces door het verzamelen van monsteropruiming en analytverrijking zonder vervelende derivatisatie- en verdampingsstappen, Het verminderen van oplosmiddelverbruik, afvalverwijdering, risico op verontreiniging en totale verwerkingstijd. De overeenkomst van 25 mM ammoniumacetaat (NH4 OAc) bij pH 9 als SPE elutie-oplossing aanzienlijk verbeterde selectiviteit. Massaspectrometriesignaalrespons werd verbeterd door aanpassing van de multiple reaction monitoring (MRM) overgangen. Het gebruik van 0,01% HCOOH als additief op een pvaffluorfenyl (PFP) kolom (150 mm x 2,1, 3 μm) verbeterde signaalrespons nog 2,5 keer en verkort de totale looptijd tot 7 minuten. Een lagere limiet van kwantificering (LLOQ) van 10 pg / ml (0,044 nM) werd bereikt, wat een significante gevoeligheidsverbetering voor de gerapporteerde assays vertegenwoordigt. Met deze vereenvoudigde, snelle, selectieve en gevoelige methode kunnen twee platen urinemonsters (n = 192) worden verwerkt in een 24 uur tijdsperiode. Gezien de aanzienlijk verbeterde analytische prestatie, en niet-invasieve en goedkope urine steekproefneming, is de voorgestelde test voordelig voor preklinische en klinischestudies.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De effecten van oxidatieve stress op de klinische presentatie zijn de laatste jaren in de voorhoede getrokken 1 . Een van de biomarkers die worden onderzocht, is 3-nitrotyrosine (3-NT), een eindstabiel product dat wordt gevormd wanneer reactieve stikstofsoorten (RNS) interageren met tyrosine, een catecholamine neurotransmitter precursor. Terwijl 3-NT klinische waarde kan hebben als biomarker voor RNS in vivo, kunnen de substantiële veranderingen van de eigenschappen en functies van tyrosine de overeenkomstige eiwitten en cellulaire functies 1 , 2 nadelig beïnvloeden. Opkomende onderzoeken hebben voorgesteld dat 3-NT een belangrijke rol kan spelen bij ontstekingsomstandigheden 3 , neurodegeneratieve stoornissen 4 , 5 , hart- en vaatziekten 6 en diabetes 7 , alsmede de condities die verband houden met oxidatieve stress. Echter, deze obsRvations zijn gebaseerd op resultaten van methoden die niet gevoelig zijn voor en / of selectiviteit 8 , 9 , 10 , 11 . De enorme concentraties van 3 NT voor de biologische monsters die eerder in de literatuur zijn gerapporteerd, tonen aan dat er ernstige analysemethoden met deze analyses zijn geassocieerd en technische verbeteringen nodig zijn om de niveaus van 3-NT nauwkeurig te kwantificeren en de rol ervan te controleren in de pathologie van deze omstandigheden .

De kwantificering van gratis 3-NT in biologische matrices geeft een speciale uitdaging voor man en instrument 8 , 9 , 10 , 11 . Ten eerste vraagt ​​het spoorniveau van endogeen 3-NT een ultragevoelige detectie; Ten tweede, het bestaan ​​van tal van structureel vergelijkbare analoges, in het bijzonder tyrosine, dat aanwezig is inEnorme overmaat, vereist een hoge mate van selectiviteit; Ten derde vereist de artefactuele vorming van 3-NT door tyrosine nitrering met alomtegenwoordig nitraat en nitriet speciale aandacht tijdens de monstervoorbereiding om valse overschatting van 3-NT te vermijden.

Onder een grote verscheidenheid aan methodieken die zijn gebruikt om 3-NT te meten, is MS / MS beschouwd als de gouden standaard methode vanwege de superieure gevoeligheid en selectiviteit 11 , 12 , 13 , 14 . Gaschromatografie (GC) gekoppelde MS / MS biedt de beste gevoeligheid, maar de onontbeerlijke steekproef derivatisatie stappen zijn te vervelend en tijdrovend om efficiënt te zijn voor klinische toepassingen 15 , 16 . LC-MS / MS vereist geen complexe monster derivatisatie, waardoor het de veelbelovende optie is. Niettemin zijn er verschillende obstakels om te overwinnen, zoals de seNsitiviteit van LC-MS / MS-methoden die in de literatuur worden gerapporteerd, moet worden verbeterd voor de meting van laag overvloedig 3-NT 7 , 17 , 18 en de relatief lange omkeertijd moet worden verkort voor toepassingen met hoge doorvoer 12 , 13 , 17 , 19 .

Bovendien, bij het overwegen van klinische toepassingen, speelt de biologische matrix een belangrijke rol. Het zou makkelijk en goedkoop zijn om, indien mogelijk, 20 , 21 , 22 te verkrijgen en niet invasieve te maken. Plasma, het traditioneel gebruikte monster in de literatuur, is geen klinisch gewenste matrix, dus een methodologie die gebruik maakt van urine, die niet invasieve en kosteneffectief is, werd gezocht.

Verschillende pogingen om rel. Te ontwikkelenLable en specifieke LC-MS / MS methodologieën zijn gemaakt met behulp van urine 9 , 10 , 11 . Echter, ze zijn allemaal niet zozeer selectief, betrouwbaar of efficiënt genoeg voor klinisch gebruik. De effectiviteit van de overheersende SPE met behulp van traditionele omkeerfase cartridge (C18 type) als monsteropruiming voor de 3-NT analyse is ondervraagd en een sequentiële SPE van sterke kationuitwisseling (SCX) en omgekeerde fase C18-OH is voorgesteld 6 , 7 , 19 . Een recent ontwikkelde LC-MS / MS methode gebruikte een multi-stap zuivering proces van handmatige C18 SPE, preparatieve hogedruk vloeistofchromatografie (HPLC) en online SPE voor analyse van 3-NT 23 . Hoewel deze methode voor klinische doeleinden gevoelig genoeg was, met een LLOQ van 0,041 nM, was het opruimingsproces intensief en vervelend en vereisteRood 3 ml urine, het beperken van de haalbaarheid voor hoge doorvoer. Een molecuulgeïmprimeerd polymeer werd gebruikt als het SPE sorbent om de efficiëntie van het opruimingsproces 14 te verbeteren, maar de resulterende LLOQ (0,7 ug / ml) was niet laag genoeg voor klinische exemplaren. Een andere methode vereist tweedimensionale (2D) LC-MS / MS en immunoaffiniteitskromatografie voor het opruimen van het monster om een ​​detectiegrens (LOD) van 0,022 nM 24 te bereiken . Hoewel al deze methoden vooruitgang hebben geboekt bij de beoordeling van 3-NT, heeft niemand de gevoeligheid, betrouwbaarheid en efficiëntie die nodig zijn voor klinische toepassingen bereikt.

Om de pathologie van gratis 3-NT en zijn rol als biomarker van oxidatieve stress in klinische instellingen te onderzoeken, hebben we een methodologie ontwikkeld die eenvoudig, efficiënt, nauwkeurig en nauwkeurig is, waardoor klinische toepassingen met hoge doorgang 25 kunnen worden toegepast . Een geminiaturiseerde gemengd mode kation exc(MCX) 96-putjes extractiemicroplate werd geïmplementeerd om eenvoudig en effectief monsteropruiming en verrijking van 3-NT in een enkele extractie te verwezenlijken die de nadelen in de bestaande methoden die derivatisatie, verdamping en 2D-LC vereisen omzeilen. Vloeistofchromatografie met 0,01% HCOOH als additief in mobiele fase bood een verbeterde signaalrespons met een snelle cyclustijd aan. Selectiviteit werd verder verbeterd door toepassing van een mild NH4 OAc elutieoplossing voor selectieve elutie van 3-NT, en het gebruik van MRM overgang voor zowel 3-NT en de interne standaard (IS). Het matrix effect werd gecompenseerd door gebruik te maken van een gereduceerde hoeveelheid van een voorkeur 13 C-gelabelde isotopische IS voor kwantificering. Met de komst van deze methodologie kunnen onderzoekers en clinici de rol van 3-NT in klinische condities verifiëren en de impact van oxidatieve stress verder onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle studies waarbij menselijke urinemonsters werden uitgevoerd, werden gevolgd aan de procedure die is goedgekeurd door de Pharmasan / Neuroscience Institutionele Review Board (IRB).

1. Urine Monster Collection en Creatinine (Cr) Determination

  1. Verzamel 5 ml van de volgende morgen urine monsters na ca. 10 uur 's nachts vast in een 5 ml transportbuis A die 250 μl 3 N HC1 bevat als conserveermiddel en opslaan bij -20 ° C tot gebruik.
  2. Ontdooi en draaikolk 5 ml transport urine Een buis en centrifuge in een centrifuge ( bijv. Sorvall) (2297 xg, 10 min).
  3. Aliquot 1 ml urine tweemaal uit de 5 ml transportbuis A.
  4. Bepaal Cr door middel van een urine creatinine methode 26 .

2. Bereiding van standaard, IS en Quality Control (QC) monsters

  1. Bereid een voorraadoplossing van 3-NT bij 100 μg / ml in water met 0,01% HCOOH mobiele fase A (MA) op en opslaan bij -20 ° C.
  2. MakenEen 3-NT werk standaard oplossing bij concentratie van 100 ng / mL door het verdunnen van de 100 μg / mL 3-NT voorraadoplossing met MA.
  3. Genereren normen variërend van 5 tot 2500 pg / ml door verdunning van de 100 ng / mL werkstandaard met 0,15 M HCl verzuurde lege urine vrij van 3-NT, samen met lege en dubbele lege monsters.
  4. Bereid een voorraadoplossing van IS 13 C 9 -3-NT bij 100 μg / ml in water met MA en sla de bij -20 ° C op.
  5. Maak een IS-werkoplossing op 500 pg / ml door verdunning van de 100 μg / ml 13 C 9 -3-NT IS-voorraadoplossing met MA.
  6. Bepaal vijf niveaus van QC-monsters die de LLOQ, laag, medium en hoog niveau ( d.w.z. 10, 25, 100, 500 en 1.250 pg / ml) omvatten, door verdunning van de 3-NT werkstandaard in de verzuurde lege urine.

3. Fase-extractieprocedure

  1. Ontdooien en vortex urine monsters, normen en QC monsters.
  2. Voeg urine monsters, normen en QC samp toeLes (250 μl elk) naar 32 putjes van een schone 2 ml 96-putjes collectieplaat.
  3. Introduceer de 500 pg / mL IS werkoplossing (50 μL) aan elke put, behalve dubbele lege monsterput. Voeg 0,01% HCOOH (50 μL) toe aan de dubbele blanco monsterput.
  4. Voeg LC-MS / MS water toe met 0,1% HCOOH (250 μl).
  5. Meng het bovenstaande mengsel drie keer met een 8-kanaalspipet.
  6. Bedek de plaat tot SPE laadt.
  7. Plaats een MCX 96-puts extractieplaat en een verzamelreservoir op een positieve drukprocessor.
  8. Conditie de extractieplaat met vloeibare MeOH (200 μL) door het sorbent.
  9. Equilibreer door stromend water met 2% HCOOH (200 μL) door het sorbent.
  10. Breng het gehele volume van elk van de vooraf gemengde monsters met een 8-kanaalspipette zorgvuldig op de voorgekookte extractieplaat.
  11. Stel een lage positieve druk ( bijv . 3 psi) op ​​de positieve drukprocessor om het mengsel te laten stromenDoe het sorbent langzaam aan, pas de druk zo nodig aan.
  12. Was de putjes door water met 2% HCOOH (200 μL) door het sorbent te stromen.
  13. Was de putjes door methanol (200 μL) door het sorbent te stromen.
  14. Was de putjes door stromend water (200 μL) door het sorbent.
  15. Droog de putjes volledig met een hoge positieve drukinstelling ( bijv . 40 psi) op ​​de positieve drukprocessor.
  16. Vervang het reservoir met een schone 2 ml 96-putjes collectieplaat.
  17. Toepassing 25 mM NH4 OAc bij pH 9 (50 pl) aan de ingehouden analyt elueren en IS van de extractieplaat.
  18. Pipette LC-MS water met 5% HCOOH (50 μL) om het eluaat te neutraliseren.
  19. Meng met de 8-kanaalspipette drie keer en stuur voor analyse naar het LC-MS / MS-station.

4. LC-MS / MS-analyse

  1. Meet 2,000 ml LC-MS water nauwkeurig met een afgedrukte cilinder en verplaats het in een 2 liter fles.
  2. PIpette 200 μL pure HCOOH in de bovenstaande fles die LC-MS water bevat.
  3. Meng grondig en label als mobiele fase A (MA). Inclusief initialen, voorbereidingsdatum en vervaldatum.
  4. Neem een ​​2 liter fles LC-MS methanol en label als mobiele fase B (MB) met startdatum en vervaldatum.
  5. Stel de temperatuur van de auto-sampler op tot 4 ° C.
  6. Plaats de verzamelplaat met voorbereide monsters in de autosampler.
  7. Plaats een PFP-kolom (150 mm x 2.1 mm ID, 3 μm) en bescherm de kolom in de oven.
  8. Stel de oventemperatuur in op 30 ° C.
  9. Equilibreer 10 minuten met behulp van de acquisitie methode met de LC gradiënt elutie zoals getoond in Tabel 1 .
Tijd (min) module Evenementen Parameter
0 pumps Pomp B Conc. 5
0.5 pumps Pomp B Conc. 20
1 pumps Pomp B Conc. 50
3 pumps Pomp B Conc. 80
4 pumps Pomp B Conc. 90
4.01 pumps Pomp B Conc. 95
5.5 pumps Pomp B Conc. 95
5.6 pumps Pomp B Conc. 5
7 controleur Hou op

Tabel 1: Liquid Chromatography Gradient Elution Conditions

  1. Maak een batchlijst inclusiefNormen, QC en urine monsters.
  2. Start de partij door injectie van de bereide monsters (12 μL).

5. Peak Identificatie, Integratie en Data Process

  1. Beheer de gegevensverzameling en -verwerking met behulp van de software.
  2. Identificeer en integreer 3-NT en IS pieken voor alle monsters.
  3. Bepaal een standaardkromme met een bereik van 10-2.500 pg / mL voor 3-NT kwantificering door lineaire regressie van de piek gebied verhouding van 3-NT en IS versus de nominale 3-NT concentratie met een gewicht factor van 1 / x.
  4. Kwantificeer alle monsters met behulp van de standaardkromme.
  5. Bepaal of de QC-monsters in het gevestigde bereik vallen.
  6. Omzetten van de gedetecteerde concentraties urinemonsters naar de uiteindelijke resultaten in de eenheid van nM of nmol / mmol Cr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figuur 1 illustreert dat 3-NT volledig chromatografisch gescheiden is van andere structureel vergelijkbare tyrosineanalogen onder de geoptimaliseerde LC-conditie, die de co-elutie-interferenties wegens deze veel te veel verbindingen elimineert en derhalve de mate van assayselectiviteit verbetert. Daarnaast maakt de gradiënteluctie met 0,01% HCOOH als additief in MA en methanol bij een stromingssnelheid van 0,45 ml / min een snelle elutie van 3-NT ( dwz 3 min met een omlooptijd van 7 minuten) mogelijk.

Figuur 1
Figuur 1: Baseline LC-chromatografische scheiding van 3-NT uit andere tyrosine-analogen in een standaardoplossing. ( A ) p- Tyrosine; ( B ) m- Tyrosine; ( C ) o -tyrosine; ( D ) Cl-Tyrosine; ( E ) 3-NT. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2 laat zien dat geen 3-NT-signaal in het dubbele blanco-monster wordt waargenomen, waarbij geen vorming van artefactueel 3-NT tijdens het gehele proces wordt aangegeven. Figuur 3 illustreert representatieve MRM chromatogrammen van 3-NT en IS voor een gezond individu. Zoals te zien zijn, worden geen interfererende signalen waargenomen bij de retentietijden van 3-NT en IS. Bovendien werd minder dan ± 6% verschil in 3-NT tussen de urinemonsters met nitriet (50 μM), nitraat (50 μM) en tyrosine (50 mg / l) 25 waargenomen, die verder steun verlenen Naar de specificiteit van de test.


Figuur 2: MRM-chromatogrammen van 3-NT en IS in een representatieve dubbele lege voorbeeld. ( A ) 3-NT MRM-kwantificator 227.0> 90.0; ( B ) IS MRM-kwantificator 236.0> 189.0. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: MRM Chromatogrammen van 3-NT en IS in een Representatieve Urine Voorbeeld van Gezonde Mensen. ( A ) 3-NT MRM-kwantificator 227.0> 90.0; ( B ) IS MRM-kwantificator 236.0> 189.0. Klik dan op hijWeer een grotere versie van deze figuur te zien.

De standaardcurve werd vastgesteld door extractie van verzuurde blanco urine gespik met 3-NT in het bereik van 10-2.500 pg / ml door de piekoppervlakteverhouding van 3-NT en IS te vergelijken tegen de nominale concentratie van 3-NT met een lineaire montage Van 1 / x gewichten. Een representatieve standaardkromme wordt getoond in figuur 4 . Het LOD, gedefinieerd als de laagste concentratie met een signaal-ruisverhouding groter dan drie, werd vastgesteld op 2 pg / ml (0,0088 nM). De LLOQ werd bepaald per definitie 10 pg / ml (0,044 nM) als de laagste concentratie die moet worden gemeten binnen ± 20% van onnauwkeurigheid en nauwkeurigheid met de signaal-ruisverhouding groter dan tien.

Figuur 4
Figuur 4: Een representatieve 3-NT-standaardkromme in deBereik van 10-2.500 pg / ml. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ernstige variaties in concentraties die eerder zijn gerapporteerd in de literatuur voor het endogene vrije 3-NT in menselijke urine monsters onthullen methodologische problemen in verband met beschikbare assays 8 , 9 , 10 , 11 . Een nauwkeurige bepaling van het lage basale niveau van 3-NT in menselijke urine blijft een uitdagende taak die speciale voorzorgsmaatregelen vereist voor het voorbereiden van monster en LC-MS / MS analyse. Dit protocol beschrijft een nieuwe SPE procedure gecombineerd met een selectieve LC-MS / MS detectie die de specifieke en gevoelige bepaling van urine 3-NT met hoge doorvoer mogelijk maakt.

Zorgvuldige selectie van MRM-parameters verbeterde selectiviteit voor de detectie van 3-NT. De MRM-overgang m / z 236.0> 96.0 van IS voor 3-NT in plasma 27 veroorzaakte ernstige verontreiniging voor urinemonsters. Een schonere, 9-voudige toename van het signaalRespons werd bereikt met MRM overgang m / z 236,0> 189,0. MRM-overgang m / z 227,0> 90,0 werd geselecteerd voor 3-NT kwantificering door ernstige interferentie met behulp van de meest intensieve overgang m / z 227.0> 181.0. De gedetailleerde MRM-overgangen en samengestelde parameters worden samengevat in tabel 2 .

analyt MRM-overgang (m / z) DP (V) EP (V) CE (eV) CXP (V)
3-NT (kwantificator) 227,0> 90,0 50 10 38 13
3-NT (kwalificatie) 227,0> 103,9 50 10 45 16
13 C 9 -NT (IS) 236,0> 189,0 50 10 21 14
Een ionspuitspanning: 2200 V; Temperatuur: 600 ° C; Gordijngas: 35; CAD gas: 9; Nebulisatorgas (GS1): 50; Verwarmingsgas (GS2): 55.

Tabel 2: Geoptimaliseerde MRM Voorwaarden.

De traditionele C18-type kolom die gewoonlijk wordt gebruikt voor LC-chromatografische scheiding van 3-NT in de literatuur 12 , 13 , 17 , 19 vereist typisch een lange omlooptijd om interferentie te verminderen, waardoor het niet bevorderlijk is voor hoge doorvoer. In dit protocol werd een PFP-kolom toegepast voor optimalisatie van LC-chromatografische scheiding van 3-NT op basis van zijn verbeterde retentie van polaire verbindingen 22 ,> 27 , 28 . De concentratie van mobiele faseadditieven heeft een belangrijke invloed op de signaalintensiteit 25 , 28 . HCOOH bij 0,01% bleek het optimale additief in MA te zijn, aangezien het resulteerde in een 2,5 keer signaalverhoging boven 0,1% concentratie, en verder afneemt in concentratie gereduceerde signaalrespons. Een gradiënt-elutieprofiel met gebruikmaking van 0,01% HCOOH in water (MA) en methanol (MB) werd vastgesteld met een stromingssnelheid van 0,45 ml / min, waarbij een optimale scheiding en snelle elutie van 3-NT binnen 3 minuten met een totale looptijd van Slechts 7 minuten, waardoor een significante snellere analyse van 3-NT in gecompliceerde biologische matrices mogelijk is dan gerapporteerd in de literatuur 12 , 13 , 17 , 19 .

Om de ondoeltreffendheid van de traditionele omgekeerde fase cartridge (C18 type) pOverwegend gebruikt voor SPE van biologische monsters 6 , 7 , hebben we onlangs een LC-MS / MS methode ontwikkeld om 3-NT in menselijk plasma te bepalen door SPE op een enkele dubbele functionele 96-put MCX plaat 27 , die resulteerde in verbeteringen in SPE Efficiëntie en selectiviteit. Een duidelijk nadeel van alle SPE-benaderingen in de literatuur is echter moeizame en risico-geassocieerde verdampings- en reconstitutiestrappen. Daarnaast vereist de plasmamethode een extra voorwas van de extractieplaat om verontreiniging uit het sorbent te elimineren. In dit protocol zijn deze nadelen geëlimineerd door een aangepaste SPE met behulp van een geminiaturiseerde 96-putjes microplate. De selectie van elutieoplossing bleek cruciaal voor de extractie-efficiëntie. Aanzienlijke storingen werden urinemonsters genomen door toepassing van een gemeenschappelijke NH4OH elutieoplossing met gevarieerde samenstelling van MeOH. Er werd verondersteld dat het interfererening stoffen werden samen geëlueerd bij het analyt door de sterke elutie kracht van de methanolische NH4OH elutieoplossing daarmee resulterend in de lage selectiviteit. Om de selectiviteit te verbeteren, was het nodig om een ​​oplossing te identificeren die zowel sterk genoeg zou zijn om 3-NT te elueren en zwak genoeg te zijn om geen elutie van interfererende verbindingen te veroorzaken. Na grondig onderzoek van minder basische NH4 OAc bij verschillende pH en concentraties, 25 mM NH4 OAc oplossing met een pH van 9 bleek optimaal elutie-oplossing. Met de geoptimaliseerde elutieoplossing het probleem van storende verbindingen opgelost en 40% winst in gevoeligheid werd bereikt vergeleken met de reguliere methanolische NH4OH elutieoplossing.

Tabel 3 geeft een gedetailleerde samenvatting van de analytische prestatie van dit protocol 25 in vergelijking met andere beschikbare methoden voor de bepaling van het vrije 3-NT in biologische matrices. Dit protocol van Verschaft verschillende duidelijke voordelen ten opzichte van eerder gemelde analyses. Ten eerste, door gebruik te maken van de 96-putjes extractiemicroplate, werd een enkele stap bereikt voor het opruimen en analyseren van de monsters, waarbij de 1 - 5 cycli van verdamping en reconstitutie worden vermeden die typisch nodig zijn in de 3-NT-methoden die SPE betreffen. Ten tweede is het oplosmiddelverbruik per monster voor SPE drastisch verminderd, van 5,5 - 118 ml tot slechts 1,1 ml, wat een vermindering van 5-107 keer in oplosmiddel en afvalverwerking betekent. Ten derde werd de LC-omkeertijd per monster verlaagd 2-7 maal vergeleken met andere analyses en was 30% sneller dan onze vorige plasmamethode. Ten vierde was een 10-3000 vouw lagere hoeveelheid van de voorkeur 13 C-gemerkte IS nodig voor compensatie van matrix effect. Ten slotte vertegenwoordigt deze test een significante gevoeligheidsverbetering ten opzichte van andere conventionele SPE-gebaseerde LC-MS / MS methoden voor de kwantificering van urine 3-NT.

ways "> Proefbereiding analytisch
methode
Matrix LOD (nM) LOQ (nM) LC run (min) Evap c Sol d (mL) IS (ng) Ref. SPE (C18)
+ filtreren LC-MS / MS Plasma 0,034 0,112 20 1 13 Analoge f 2 [6] SPE
(MCX plaat) LC-MS / MS Plasma 0,0088 0,022 10 1 5.6 13 C 9 -NT 0.25 [27] PPT + SPE (MCX) + der a HPLC-UV Serum NA b 100 40 1 7.3 NA b NA b [12] HPLC + der a GC-MS / MS Urine 0,004 0,125 NA b 5 NA b D 3 -NT 4.6 [16] PPT + SPE (amino) + der a LC-MS / MS Kat urine NA b 14.5 40 3 23 D 3 -NT 75 [17] PPT + hydrolyse + SPE (SCX-C18) LC-MS / MS Urine (eiwit) 400 NA 50 2 118 D 3 -NT 2 [19] IA-2D LC e LC-MS / MS Urine 0,022 NA 14 NA b NA b 13 C 9 -NT 0.85 [24] SPE (C18) + hydrolyse HPLC-ECD Urine (totaal) NA b 4 40 2 5.5 NA b NA b [13] SPE (C18) + Prep LC g
+ Online SPE LC-MS / MS Urine 0,0088 0,041 30 2 38 D 3 -NT 5 [23] SPE (MIP) HPLC-UV Spiked Urine 700 NA 20 18 NA b NA b [14] SPE (MCX μElution) LC-MS / MS Urine 0,0088 0,044 7 NEE 1.1 13 C 9 -NT 0.03 Dit werk A der: derivatisering; B NA: niet beschikbaar; C Evap: Verdamping; D Sol: oplosmiddel per monster; E IA-2D LC: immunoaffiniteitskromatografie en tweedimensionale LC; F Analoog: o-methyl-tyrosine; G Prep LC: preparatieve HPLC zuivering.

Tabel 3: CompariZoon van de analytische prestatie van dit protocol met bestaande analyses voor de detectie van 3-NT in biologische matrices

De analytische en klinische validiteit van de voorgestelde test werd verder beoordeeld door de bepaling van het referentieinterval voor urine 3-NT, dat is vastgesteld uit de authentieke urinemonsters van 82 gezonde mensen 25 . Met de verbeterde eenvoud en doorvoermethode kunnen twee platen urinemonsters (n = 192) worden verwerkt en geanalyseerd in een periode van 24 uur. De ontwikkelde methode die gebruik maakt van de niet-invasieve urine steekproefneming, simpel, snel, gevoelig en selectief, wordt verwacht dat het een krachtig instrument is om de rol van 3-NT in klinische omstandigheden te verifiëren en de impact van oxidatieve stress verder te verkennen. De kritische stappen van het protocol omvatten SPE op een MCX microplate met behulp van een milde NH4OAc als elutiebuffer, LC-scheiding op een PFP-kolom met 0,01% HCOOH als additief en MRM-selectie voor 3-NT quantificatie. Toekomstige toepassing van de methode is voor het kwantificeren van 3-NT concentraties bij patiënten met pathologische aandoeningen, zoals ontstekings- en neurodegeneratieve stoornissen, enz. De mogelijke valkuilen van het voorgestelde protocol voor klinische toepassingen blijven behandeld worden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Acknowledgments

De auteurs zouden Scott Howard en Abigail Marinack erkennen voor algemene ondersteuning en coördinatie van dit werk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Nitro-L-tyrosine Sigma N7389-5g
3-Nitro-L-tyrosine-13C9 Sigma 652296-5.0mg
Mass Spec Gold Urine Golden West Biologicals MSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µElution plate Waters 186001830BA
2 mL 96 well collection plate Phenomenex   AH0-7194
96 positive processor Waters  186005521
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol   Sigma 14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV water Sigma 14263-2L
Formic acid for mass spectrometry Sigma 94318-50ML-F
Ammonium hydroxide solution Sigma 338818-1L
Ultra PFP propyl columns Restek 9179362
5500 Triple quad AB Sciex  / Contact manufacture for more detail
UFLC-XR Shimadzu  / Contact manufacture for more detail
Integra 400 Plus  Roche / Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method
LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial Waters 600000751CV
LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial Waters 186000384C
5 mL transport tube Phenix TT-3205
50 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2263
15 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2266
eLine electronic pipette Sartorius 730391
Microfuge centrifuge  Beckman Coulter A46474
OHAUS balance   Kennedy Scales, inc. 735
Vortex mixer  Bernstead Thermolyne M16715

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52, (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87, (1), 315-424 (2007).
  3. Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61, (1), 90-96 (2006).
  4. Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association? J. Clin. Invest. 111, (2), 163-169 (2003).
  5. Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
  6. Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33, (4), 697-704 (2012).
  7. Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44, (1), 67-78 (2009).
  8. Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25, (3-4), 351-361 (2003).
  9. Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851, (1-2), 160-171 (2007).
  10. Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42, (1), 45-63 (2012).
  11. Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33, (4), 237-276 (2014).
  12. Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26, (1), 41-50 (2012).
  13. Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217, (19), 3269-3274 (2010).
  14. Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40, (1), 336-341 (2013).
  15. Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276, (2), 195-203 (1999).
  16. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827, (1), 146-156 (2005).
  17. Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75, (2), 261-267 (2003).
  18. Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799, (2), 245-254 (2004).
  19. Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181, (1), 31-39 (2008).
  20. Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35, (3), 635-644 (2011).
  21. Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406, (28), 7287-7297 (2014).
  22. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
  23. Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28, (5), 997-1006 (2015).
  24. Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380, (1), 68-76 (2008).
  25. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407, (25), 7703-7712 (2015).
  26. Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. Mannheim. Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html 2011-2011 (2011).
  27. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
  28. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).
Integratie van Gefinatiseerde Solid Phase Extraction en LC-MS / MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Menselijke Urine voor Klinische Toepassingen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).More

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter