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Chemistry

Intégration de l'extraction de phase solide miniaturisée et détection de la LC-MS / MS de la 3-nitrotyrosine dans l'urine humaine pour les applications cliniques

doi: 10.3791/55778 Published: July 14, 2017

Summary

Une méthode de spectrométrie de masse en tandem en masse (LC-MS / MS) sélective et sensible couplée à une extraction efficace en phase solide sur une microplaque à 96 puits d'échange de cations (MCX) à mode mixte a été développée pour la mesure de la 3-nitrotyrosine libre ( 3-NT) dans l'urine humaine à haut débit, ce qui convient aux applications cliniques.

Abstract

La 3-nitrotyrosine gratuite (3-NT) a été largement utilisée comme biomarqueur possible pour le stress oxydatif. Des niveaux accrus de 3-NT ont été rapportés dans une grande variété de pathologies. Cependant, les méthodes existantes ne présentent pas suffisamment de sensibilité et / ou de spécificité nécessaire pour mesurer le faible niveau endogène de 3-NT de manière fiable et sont trop lourdes pour les applications cliniques. Par conséquent, une amélioration analytique est nécessaire de manière urgente pour quantifier avec précision les niveaux de 3-NT et vérifier le rôle du 3-NT dans les pathologies. Ce protocole présente le développement d'une nouvelle détection par spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS) en chromatographie en phase liquide associée à une extraction miniaturisée en phase solide (SPE) pour la mesure rapide et précise de 3-NT dans l'urine humaine en tant que biomarqueur non invasif Pour le stress oxydatif. SPE à l'aide d'une plaque à 96 puits a nettement simplifié le processus en combinant le nettoyage des échantillons et l'enrichissement de l'analyte sans dégradation fastidieuse et les étapes d'évaporation, Réduisant la consommation de solvants, l'élimination des déchets, le risque de contamination et le temps de traitement global. L'emploi d'acétate d'ammonium 25 mM (NH 4 OAc) à pH 9 lorsque la solution d'élution SPE a considérablement amélioré la sélectivité. La réponse du signal de spectrométrie de masse a été améliorée grâce au réglage des transitions de surveillance de réaction multiple (MRM). L'utilisation de 0,01% de HCOOH comme additif sur une colonne de pentafluorophényle (PFP) (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) a amélioré la réponse du signal d'autre 2,5 fois et a raccourci le temps de fonctionnement global à 7 min. Une limite de quantification inférieure (LLOQ) de 10 pg / mL (0,044 nM) a été obtenue, ce qui représente une amélioration significative de la sensibilité par rapport aux dosages rapportés. Cette méthode simplifiée, rapide, sélective et sensible permet de traiter deux plaques d'échantillons d'urine (n = 192) dans une période de 24 heures. Compte tenu de la performance analytique nettement améliorée et de l'échantillonnage d'urine non invasif et peu coûteux, l'analyse proposée est bénéfique pour les études précliniques et cliniquesétudes.

Introduction

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Les effets du stress oxydatif sur la présentation clinique ont été poussés au premier plan ces dernières années 1 . L'un des biomarqueurs à explorer est la 3-nitrotyrosine (3-NT), un produit final stable formé lorsque des espèces réactives d'azote (RNS) interagissent avec la tyrosine, un précurseur de neurotransmetteur de catécholamine. Alors que 3-NT peut avoir une valeur clinique comme biomarqueur pour RNS in vivo, les changements substantiels des propriétés et des fonctions de la tyrosine peuvent affecter négativement les protéines correspondantes et les fonctions cellulaires 1 , 2 . Des recherches émergentes ont suggéré que le 3-NT peut jouer un rôle important dans les conditions inflammatoires 3 , les troubles neurodégénératifs 4 , 5 , les maladies cardiovasculaires 6 et le diabète 7 , ainsi que les conditions liées au stress oxydatif. Cependant, ces obseLes retombées sont basées sur les résultats de méthodologies dépourvues de sensibilité et / ou de sélectivité 8 , 9 , 10 , 11 . Les énormes plages de concentration de 3-NT pour les échantillons biologiques précédemment rapportés dans la littérature révèlent que des problèmes d'analyse sérieux sont associés à ces tests et que des améliorations techniques sont nécessaires pour quantifier avec précision les niveaux de 3-NT et vérifier son rôle dans la pathologie de ces conditions .

La quantification de 3-NT libre dans les matrices biologiques présente un défi spécial pour l'homme et l'instrument 8 , 9 , 10 , 11 . Tout d'abord, le niveau de traces du 3-NT endogène exige une détection ultra-sensible; Deuxièmement, l'existence de nombreux analogues structurellement similaires, en particulier la tyrosine, qui est présente dansVaste excès, nécessite un degré élevé de sélectivité; Troisièmement, la formation artefactuelle de 3-NT par nitration de tyrosine avec nitrate et nitrite omniprésent nécessite une attention particulière lors de la préparation de l'échantillon afin d'éviter une fausse surestimation de 3-NT.

Parmi une grande variété de méthodologies utilisées pour mesurer 3-NT, la MS / MS a été considérée comme la méthode de l'étalon-or en raison de sa sensibilité et de sa sélectivité supérieures 11 , 12 , 13 , 14 . La MS / MS couplée à la chromatographie en phase gazeuse (GC) offre la meilleure sensibilité, cependant, les étapes indispensables de dérivatisation de l'échantillon sont trop fastidieuses et nécessitent beaucoup de temps pour être efficaces pour l'utilité clinique 15 , 16 . LC-MS / MS n'exige pas une dérivation complexe de l'échantillon, ce qui en fait l'option la plus prometteuse. Néanmoins, il existe plusieurs obstacles à surmonter tels que le seLa sensibilité aux méthodes de LC-MS / MS rapportées dans la littérature doit être améliorée pour la mesure de 3-NT 7 , 17 , 18 à faible abondance et le temps de retournement relativement long doit être raccourci pour les applications à haut débit 12 , 13 , 17 , 19 .

En outre, en considérant les applications cliniques, la matrice biologique utilisée joue un rôle important. Il devrait être facile et peu coûteux d'obtenir et non invasif si possible 20 , 21 , 22 . Le plasma, l'échantillon traditionnellement utilisé dans la littérature, n'est pas une matrice cliniquement souhaitable, donc une méthodologie utilisant une urine non invasive et rentable a été recherchée.

Plusieurs tentatives de développement relDes méthodologies LC-MS / MS spécifiques et spécifiques ont été faites en utilisant l'urine 9 , 10 , 11 . Cependant, ils sont tous dépourvus d'être sélectifs, fiables ou efficaces pour une utilisation clinique. L'efficacité de la SPE prédominante à l'aide d'une cartouche traditionnelle en phase inversée (type C18) en tant que nettoyage d'échantillon pour l'analyse 3-NT a été mise en doute et une SPE séquentielle d'échange de cations (SCX) et de phase inverse C18-OH a été proposée 6 , 7 , 19 . Une méthode de LC-MS / MS récemment développée a utilisé un processus de purification multi-étapes de C18 SPE manuelle, chromatographie liquide à haute pression préparative (HPLC) et SPE en ligne pour l'analyse de 3-NT 23 . Bien que cette méthode soit assez sensible à des fins cliniques, avec un LLOQ de 0,041 nM, le processus de nettoyage était intensif et fastidieux et requiRouge 3 mL d'urine, ce qui limite sa faisabilité à un débit élevé. Un polymère à empreinte moléculaire a été utilisé comme sorbant de SPE pour améliorer l'efficacité du processus de nettoyage 14 , mais le LLOQ (0,7 μg / mL) résultant n'était pas assez faible pour les spécimens cliniques. Une autre méthode requiert une LC-MS / MS bidimensionnelle (2D) et une chromatographie par immunoaffinage pour le nettoyage de l'échantillon afin d'atteindre une limite de détection (LOD) de 0,022 nM 24 . Bien que toutes ces méthodes aient fait des progrès dans l'évaluation de 3-NT, aucune n'a atteint la sensibilité, la fiabilité et l'efficacité nécessaires aux applications cliniques.

Afin d'étudier la pathologie du 3-NT libre et son rôle de biomarqueur du stress oxydatif dans les milieux cliniques, nous avons développé une méthodologie simple, efficace, précise et précise permettant des applications cliniques à haut débit 25 . Une excitation de mode mixte miniaturisé excLa microplaque d'extraction à 96 puits (MCX) a été mise en place pour réaliser un nettoyage et un enrichissement simple et efficace de l'échantillon de 3-NT dans une seule extraction en contournant les inconvénients observés dans les méthodes existantes qui nécessitent une dérivation, une évaporation et une 2D-LC. La Chromatographie liquide avec 0,02% de HCOOH en tant qu'additif en phase mobile offrait une réponse de signal améliorée avec un temps de cycle rapide. La sélectivité a été améliorée par l'application d'une solution d'élution NH 4 OAc légère pour l'élution sélective de 3-NT et l'utilisation de la transition MRM à la fois pour 3-NT et l'étalon interne (IS). L'effet de la matrice a été compensé en utilisant une quantité réduite d'un isotope préféré 13 marqué C-IS pour la quantification. Avec l'avènement de cette méthodologie, les chercheurs et les cliniciens pourront vérifier le rôle du 3-NT dans les conditions cliniques et explorer davantage l'impact du stress oxydatif.

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Protocol

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Toutes les études impliquant des échantillons d'urine humaine ont été menées conformément à la procédure approuvée par Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB).

1. Collecte d'échantillon d'urine et détermination de la créatinine (Cr)

  1. Recueillir 5 mL du lendemain des échantillons d'urine après environ ca. 10 h jeûne pendant la nuit dans un tube de transport de 5 mL A contenant 250 μL de HCl 3 N comme conservateur et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
  2. Décongélation et vortex 5 mL d'urine de transport Un tube et une centrifugeuse dans une centrifugeuse ( par ex. Sorvall) (2297 xg, 10 min).
  3. Aliquoter 1 mL d'urine deux fois dans le tube de transport de 5 mL A.
  4. Déterminer Cr par une méthode de la créatinine urinaire 26 .

2. Préparation des échantillons standard, IS et de contrôle qualité (QC)

  1. Préparer une solution mère de 3-NT à 100 ug / ml dans de l'eau avec 0,01% de phase mobile HCOOH A (MA) et stocker à -20 ° C.
  2. FaireUne solution standard de travail 3-NT à une concentration de 100 ng / mL en diluant la solution stock de 3-NT de 100 μg / mL avec MA.
  3. Générer des normes allant de 5 à 2500 pg / mL par dilution de la norme de travail de 100 ng / mL avec de l'urine vierge acidifiée à 0,15 M HCl sans 3-NT avec des échantillons vierges et doubles en blanc.
  4. Préparer une solution stock de IS 13 C 9 -3-NT à 100 μg / mL dans de l'eau avec MA et conserver à -20 ° C.
  5. Faire une solution de travail IS à 500 pg / mL par dilution de la solution mère de 100 μg / mL 13 C 9 -3-NT IS avec MA.
  6. Établissez cinq niveaux d'échantillons de QC couvrant les niveaux LLOQ, faible, moyen et élevé ( c.-à - d. , 10, 25, 100, 500 et 1 250 pg / mL), par dilution du standard de travail 3-NT dans l'urine vierge acidifiée.

3. Procédure d'extraction en phase solide

  1. Des échantillons d'urine de décongélation et de vortex, des normes et des échantillons de QC.
  2. Ajouter des échantillons d'urine, des normes et QC sampLes (250 μL chacun) à 32 puits d'une plaque de collecte de 96 ml propre.
  3. Présentez la solution de travail de 500 pg / mL IS (50 μL) à chaque puits, sauf un double échantillon vierge. Ajouter 0,01% de HCOOH (50 μL) au puits d'échantillon blanc double.
  4. Ajouter l'eau LC-MS / MS avec 0,1% de HCOOH (250 μL).
  5. Mélanger le mélange ci-dessus avec une pipette à 8 canaux trois fois.
  6. Couvrez la plaque jusqu'à ce que la SPE soit chargée.
  7. Placez une plaque d'extraction MCX à 96 puits et un réservoir de collecte sur un processeur à pression positive.
  8. Conditionner la plaque d'extraction avec du MeOH en écoulement (200 μl) à travers le sorbant.
  9. Equilibrer par l'écoulement d'eau avec 2% de HCOOH (200 μL) à travers le sorbant.
  10. Chargez le volume total de chacun des échantillons pré-mélangés sur la plaque d'extraction pré-conditionnée avec une pipette à 8 canaux.
  11. Réglez une pression positive faible ( p . Ex. , 3 psi) sur le processeur de pression positive pour permettre au mélange de coulerSortez lentement le sorbant, ajustez la pression si nécessaire.
  12. Laver les puits en courant d'eau avec 2% de HCOOH (200 μL) à travers le sorbant.
  13. Lavez les puits en faisant couler du méthanol (200 μl) à travers le sorbant.
  14. Laver les puits en courant d'eau (200 μl) à travers le sorbant.
  15. Séchez les puits complètement avec un réglage de pression positive élevé ( p . Ex. , 40 psi) sur le processeur à pression positive.
  16. Remplacer le réservoir avec une plaque de collecte propre de 2 ml de 96 po.
  17. Appliquer 25 mM NH 4 OAc à pH 9 (50 μL) pour éluer l'analyte retenu et IS à partir de la plaque d'extraction.
  18. Pipetter de l'eau LC-MS avec 5% de HCOOH (50 μL) pour neutraliser l'éluat.
  19. Mélanger avec la pipette 8 canaux trois fois et soumettre à la station LC-MS / MS pour analyse.

4. Analyse LC-MS / MS

  1. Mesurer avec précision 2 000 ml d'eau LC-MS avec un cylindre gradué et le transférer dans une bouteille de 2 L.
  2. PIpette 200 μL de HCOOH pur dans la bouteille ci-dessus contenant de l'eau LC-MS.
  3. Mélanger soigneusement et étiqueter comme phase mobile A (MA). Inclure les initiales, la date de préparation et la date d'expiration.
  4. Prenez une bouteille de LC de 2 litres de méthanol et étiquetez la phase mobile B (MB) avec la date de début et la date d'expiration.
  5. Réglez la température de l'auto-échantillonnage à 4 ° C.
  6. Placez la plaque de collecte avec des échantillons préparés dans l'auto-échantillonneur.
  7. Placez une colonne PFP (150 mm x 2,1 mm id, 3 μm) et une colonne de protection au four.
  8. Réglez la température du four à 30 ° C.
  9. Equilibrer 10 min en utilisant la méthode d'acquisition avec l'élution en gradient LC comme indiqué dans le tableau 1 .
Temps (min) Module Événements Paramètre
0 Pompes Pompe B Conc. 5
0,5 Pompes Pompe B Conc. 20
1 Pompes Pompe B Conc. 50
3 Pompes Pompe B Conc. 80
4 Pompes Pompe B Conc. 90
4.01 Pompes Pompe B Conc. 95
5.5 Pompes Pompe B Conc. 95
5.6 Pompes Pompe B Conc. 5
7 Manette Arrêtez

Tableau 1: Conditions d'élution du gradient de chromatographie liquide

  1. Créez une liste de lots incluantNormes, QC et échantillons d'urine.
  2. Commencer le lot par injection des échantillons préparés (12 μL).

5. Identification de pointe, intégration et processus de données

  1. Contrôlez l'acquisition et le traitement des données à l'aide du logiciel.
  2. Identifiez et intégrez les sommets 3-NT et IS pour tous les échantillons.
  3. Établissez une courbe standard de 10-2,500 pg / mL pour la quantification 3-NT par régression linéaire du rapport de surface de pic de 3-NT et IS par rapport à la concentration nominale de 3-NT avec un facteur de pondération de 1 / x.
  4. Quantifier tous les échantillons en utilisant la courbe standard.
  5. Déterminer si les échantillons de QC tombent dans la plage établie.
  6. Convertissez les concentrations détectées d'échantillons d'urine en résultats finaux dans l'unité de nM ou nmol / mmol Cr.

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Representative Results

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La figure 1 illustre que le 3-NT est complètement séparé par chromatographie d'autres analogues de tyrosine structurellement similaires sous l'état LC optimisé, ce qui élimine les interférences co-éluant en raison de ces composés très excessifs et par conséquent améliore le degré de sélectivité du dosage. En outre, l'élution en gradient avec 0,02% de HCOOH comme additif dans le MA et le méthanol à un débit de 0,45 ml / min permet une élution rapide de 3-NT ( c'est -à- dire 3 minutes avec un temps de réponse de 7 minutes).

Figure 1
Figure 1: Séparation chromatographique LC de base de 3-NT d'autres analogues de tyrosine dans une solution standard. ( A ) p- Toyrosine; ( B ) m- Toyrosine; ( C ) o -Tyrosine; ( D ) Cl-Tyrosine; ( E ) 3-NT. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La figure 2 montre qu'aucun signal 3-NT n'est observé dans l'échantillon blanc double, ce qui indique aucune formation de 3-NT artefactuel pendant l'ensemble du processus. La figure 3 illustre les chromatogrammes MRM représentatifs de 3-NT et IS pour un individu sain. Comme on le voit, aucun signal parasite n'est observé aux temps de rétention de 3-NT et d'IS. En outre, on a observé moins de ± 6% de différence dans le 3-NT entre les échantillons d'urine rassemblés sans addition de pointes et de pointes avec du nitrite (50 μM), du nitrate (50 μM) et de la tyrosine (50 mg / L) 25 , ce qui appuie davantage À la spécificité de l'analyse.


Figure 2: Chromatogrammes MRM de 3-NT et IS dans un échantillon Double Double représentatif. ( A ) quantificateur MRM 3-NT 227,0> 90,0; ( B ) EST MRM quantificateur 236.0> 189.0. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: Chromatogrammes MRM de 3-NT et IS dans un échantillon d'urine représentatif de personnes en bonne santé. ( A ) quantificateur MRM 3-NT 227,0> 90,0; ( B ) EST MRM quantificateur 236.0> 189.0. Cliquez sur luiRe à voir une version plus grande de ce chiffre.

La courbe standard a été établie par extraction d'urine vierge acidifiée avec 3-NT dans la gamme de 10-2,500 pg / mL en traçant le rapport de surface de pic de 3-NT et IS par rapport à la concentration nominale de 3-NT avec un ajustement linéaire De 1 / x pondération. Une courbe standard représentative est démontrée à la figure 4 . Le LOD, défini comme la concentration la plus basse avec un rapport signal sur bruit supérieur à trois, a été déterminé comme étant de 2 pg / mL (0,0088 nM). On a déterminé que LLOQ était de 10 pg / mL (0,044 nM) par définition, la concentration la plus basse à mesurer à ± 20% de l'imprécision et de la précision avec un rapport signal sur bruit supérieur à dix.

Figure 4
Figure 4: Une courbe standard représentative 3-NT dans leGamme de 10-2,500 pg / mL. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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Des variations substantielles des concentrations précédemment rapportées dans la littérature pour le 3-NT endogène libre dans les échantillons d'urine humaine révèlent des problèmes méthodologiques associés aux dosages disponibles 8 , 9 , 10 , 11 . La détermination précise du faible niveau basal de 3-NT dans l'urine humaine reste une tâche difficile qui nécessite des précautions particulières pour la préparation des échantillons et l'analyse LC-MS / MS. Ce protocole décrit une nouvelle procédure SPE combinée à une détection sélective LC-MS / MS qui permet la détermination spécifique et sensible du 3-NT urinaire avec un débit élevé.

Une sélection minutieuse des paramètres MRM a amélioré la sélectivité pour la détection de 3-NT. La transition MRM m / z 236.0> 96.0 de IS pour 3-NT dans le plasma 27 a causé une contamination grave pour les échantillons d'urine. Un nettoyeur, une augmentation de 9 fois du signalLa réponse a été obtenue avec la transition MRM m / z 236.0> 189.0. La transition MRM m / z 227.0> 90.0 a été sélectionnée pour la quantification 3-NT en raison d'une interférence grave en utilisant la transition la plus intensive m / z 227.0> 181.0. Les transitions MRM détaillées et les paramètres composés sont résumés dans le tableau 2 .

Analyser Transition MRM (m / z) DP (V) EP (V) CE (eV) CXP (V)
3-NT (quantificateur) 227,0> 90,0 50 dix 38 13
3-NT (qualificatif) 227,0> 103,9 50 dix 45 16
13 C 9 -NT (IS) 236,0> 189,0 50 dix 21 14
Une tension de pulvérisation ionique: 2200 V; Température: 600 ° C; Rideaux: 35; Gaz de CAO: 9; Gaz nébuliseur (GS1): 50; Gaz de chauffage (GS2): 55.

Tableau 2: Conditions MRM optimisées.

La colonne traditionnelle de type C18 couramment utilisée pour la séparation chromatographique en LC de 3-NT dans la littérature 12 , 13 , 17 , 19 nécessitait habituellement un long délai pour réduire les interférences, ce qui la rendait non propice à un débit élevé. Dans ce protocole, une colonne PFP a été employée pour l'optimisation de la séparation chromatographique en LC de 3-NT en fonction de sa rétention améliorée de composés polaires 22 ,> 27 , 28 . La concentration des additifs de phase mobile a une influence importante sur l'intensité du signal 25 , 28 . On a trouvé que HCOOH à 0,01% était l'additif optimal dans le MA, car il a entraîné un gain de signal de 2,5 fois supérieur à 0,1% de la concentration et des diminutions supplémentaires de la réponse de réduction de la concentration réduite. Un profil d'élution en gradient utilisant 0,01% de HCOOH dans de l'eau (MA) et du méthanol (MB) a été établi avec un débit de 0,45 ml / min, obtenant une séparation optimale et une élution rapide de 3-NT en 3 minutes avec un temps d'exécution total de Seulement 7 min, permettant une analyse beaucoup plus rapide de 3-NT dans des matrices biologiques compliquées que celles rapportées dans la littérature 12 , 13 , 17 , 19 .

Pour remédier à l'inefficacité de la cartouche traditionnelle en phase inversée (type C18) predominantly utilisé pour la SPE d'échantillons biologiques 6, 7, nous avons récemment développé un procédé LC-MS / MS pour déterminer 3-NT dans le plasma humain par SPE sur un 96 puits à fonction double plaque unique MCX 27, qui a abouti à l' amélioration de la SPE Efficacité et sélectivité. Cependant, un inconvénient distinct de toutes les approches de la SPE dans la littérature est une étape laborieuse et des éléments d'évaporation et de reconstitution associés aux risques. De plus, la méthode du plasma nécessitait un pré-lavage supplémentaire de la plaque d'extraction pour éliminer la contamination du sorbant. Dans ce protocole, ces inconvénients ont été éliminés par une SPE sur mesure à l'aide d'une microplaque à 96 puits miniaturisée. La sélection de la solution d'élution a été jugée cruciale pour l'efficacité d'extraction. Des interférences substantielles ont été observées dans les échantillons d'urine en appliquant la solution d'élution NH 4 OH commune avec une composition variée de MeOH. On a émis l'hypothèse que interferLes substances chimiques ont été co-éluées avec l'analyte en raison de la forte puissance d'élution de la solution d'élution méthanolique NH 4 OH, ce qui entraîne une faible sélectivité. Pour améliorer la sélectivité, il fallait identifier une solution suffisamment forte pour éluer 3-NT et assez faible pour ne pas provoquer l'élution de composés interférants. Après étude des OAc NH 4 moins basique détaillées à différents pH et la concentration, une solution NH OAc 25 mM pH 4 à 9 a été jugée optimale en tant que solution d'élution. Avec la solution d'élution optimisée, la question des composés interférants a été résolue et un gain de sensibilité de 40% a été obtenu par rapport à la solution régulière d'élution méthanolique NH 4 OH.

Le tableau 3 présente un résumé détaillé de la performance analytique de ce protocole 25 par rapport à d'autres méthodes disponibles pour la détermination du 3-NT libre dans les matrices biologiques. Ce protocole de Présente plusieurs avantages distincts par rapport aux analyses rapportées précédemment. Tout d'abord, en utilisant la microplaque d'extraction de 96 puits, une seule étape pour le nettoyage des échantillons et l'enrichissement des analytes a été réalisée, en évitant les 1 à 5 cycles d'évaporation et de reconstitution généralement requis dans les méthodes 3-NT impliquant SPE. Deuxièmement, l'utilisation de solvants par échantillon pour SPE a été considérablement réduite, passant de 5,5 à 118 mL à 1,1 mL, ce qui représente une réduction de 5-107 fois dans l'élimination des solvants et des déchets. Troisièmement, le temps de réponse LC par échantillon a été diminué de 2 à 7 fois par rapport à d'autres essais et était 30% plus rapide que notre méthode plasma précédente. Quatrièmement, une quantité 10-3 000 fois plus faible de l'ES préféré de 13 C a été requise pour compenser l'effet matriciel. Enfin, ce dosage représente une amélioration significative de la sensibilité par rapport aux autres méthodes classiques de LC-MS / MS à base de SPE pour la quantification du 3-NT urinaire.

Moyens "> La préparation des échantillons Analytique
méthode
Matrice LOD (nM) LOQ (nM) LC course (min) Evap c Sol d (ml) IS (ng) Réf. SPE (C18)
+ Filtration LC-MS / MS Plasma 0,034 0.112 20 1 13 Analogique f 2 [6] SPE
(Plaque MCX) LC-MS / MS Plasma 0,0088 0,022 dix 1 5.6 13 C 9 -NT 0,25 [27] PPT + SPE (MCX) + der a HPLC-UV Sérum NA b 100 40 1 7.3 NA b NA b [12] HPLC + der a GC-MS / MS Urine 0,004 0,125 NA b 5 NA b D 3 -NT 4.6 [16] PPT + SPE (amino) + der a LC-MS / MS Urine de chat NA b 14,5 40 3 23 D 3 -NT 75 [17] PPT + hydrolyse + SPE (SCX-C18) LC-MS / MS Urine (protéine) 400 N / A 50 2 118 D 3 -NT 2 [19] IA-2D LC e LC-MS / MS Urine 0,022 N / A 14 NA b NA b 13 C 9 -NT 0,85 [24] SPE (C18) + hydrolyse HPLC-ECD Urine (total) NA b 4 40 2 5.5 NA b NA b [13] SPE (C18) + Prep LC g
+ SPE en ligne LC-MS / MS Urine 0,0088 0,041 30 2 38 D 3 -NT 5 [23] SPE (MIP) HPLC-UV Urine Spikée 700 N / A 20 18 NA b NA b [14] SPE (MCX μElution) LC-MS / MS Urine 0,0088 0,044 7 NON 1.1 13 C 9 -NT 0,03 Ce travail A der: derivatization; B NA: non disponible; C Evap: évaporation; D Sol: Solvant par échantillon; E IA-2D LC: chromatographie par immunoaffinité et LC à deux dimensions; F Analogique: o-méthyl-tyrosine; G Prep LC: purification par HPLC préparatoire.

Tableau 3: comparaisonFils de la performance analytique de ce protocole avec des essais existants pour la détection de 3-NT dans des matrices biologiques

La validité analytique et clinique du dosage proposé a encore été évaluée à partir de la détermination de l'intervalle de référence pour le 3-NT urinaire établi à partir des échantillons d'urine authentiques de 82 personnes en bonne santé 25 . La méthode de simplicité et de débit améliorée permet de traiter et analyser deux plaques d'échantillons d'urine (n = 192) dans une période de 24 heures. La méthode développée utilisant l'échantillonnage d'urine non invasif, simple, rapide, sensible et sélective, devrait être un outil puissant pour vérifier le rôle du 3-NT dans les conditions cliniques et explorer davantage l'impact du stress oxydatif. Les étapes critiques du protocole comprennent SPE sur une microplaque MCX en utilisant un NH4OAc doux comme tampon d'élution, séparation LC sur une colonne PFP avec 0,02% de HCOOH en tant qu'additif et sélection MRM pour quantifica 3-NTTion. L'application future de la méthode consiste à quantifier les concentrations de 3-NT chez les patients atteints d'affections pathologiques telles que les troubles inflammatoires et neurodégénératifs, etc. Les pièges potentiels du protocole proposé pour les applications cliniques restent à traiter.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissaient Scott Howard et Abigail Marinack pour le soutien général et la coordination de ce travail.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Nitro-L-tyrosine Sigma N7389-5g
3-Nitro-L-tyrosine-13C9 Sigma 652296-5.0mg
Mass Spec Gold Urine Golden West Biologicals MSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µElution plate Waters 186001830BA
2 mL 96 well collection plate Phenomenex   AH0-7194
96 positive processor Waters  186005521
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol   Sigma 14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV water Sigma 14263-2L
Formic acid for mass spectrometry Sigma 94318-50ML-F
Ammonium hydroxide solution Sigma 338818-1L
Ultra PFP propyl columns Restek 9179362
5500 Triple quad AB Sciex  / Contact manufacture for more detail
UFLC-XR Shimadzu  / Contact manufacture for more detail
Integra 400 Plus  Roche / Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method
LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial Waters 600000751CV
LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial Waters 186000384C
5 mL transport tube Phenix TT-3205
50 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2263
15 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2266
eLine electronic pipette Sartorius 730391
Microfuge centrifuge  Beckman Coulter A46474
OHAUS balance   Kennedy Scales, inc. 735
Vortex mixer  Bernstead Thermolyne M16715

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References

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Intégration de l'extraction de phase solide miniaturisée et détection de la LC-MS / MS de la 3-nitrotyrosine dans l'urine humaine pour les applications cliniques
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Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).More

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).

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