En selektiv og følsom væskekromatografi-tandemmassespektrometri-metode (LC-MS / MS) kombineret med en effektiv fastfaseekstraktion på en mikronpladet 96-brønds mixplast med blandet tilstand (MCX) blev udviklet til måling af frit 3-nitrotyrosin ( 3-NT) i human urin med høj gennemstrømning, som er egnet til kliniske anvendelser.
Gratis 3-nitrotyrosin (3-NT) er blevet udbredt som en mulig biomarkør for oxidativ stress. Øgede niveauer af 3-NT er blevet rapporteret i en lang række patologiske tilstande. Eksisterende metoder mangler imidlertid den tilstrækkelige følsomhed og / eller specificitet, der er nødvendig for at måle det lave endogene niveau af 3-NT pålideligt og er for besværligt til kliniske anvendelser. Derfor er det nødvendigt med analytisk forbedring for nøjagtigt at kvantificere niveauerne af 3-NT og verificere 3-NTs rolle i patologiske tilstande. Denne protokol præsenterer udviklingen af en ny væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) detektion kombineret med en miniaturiseret fastfase-ekstraktion (SPE) til hurtig og præcis måling af 3-NT i human urin som en ikke-invasiv biomarkør Til oxidativ stress. SPE ved hjælp af en 96-brønds plade forenklet processen markant ved at kombinere prøveoprensning og analyt berigelse uden kedelige derivatisering og fordampningstrin, Reducering af opløsningsmiddelforbrug, bortskaffelse af affald, risiko for forurening og samlet behandlingstid. Beskæftigelse af 25 mM ammoniumacetat (NH4OAc) ved pH 9 som SPE elueringsopløsningen væsentligt forbedret selektivitet. Massespektrometrisignalrespons blev forbedret ved tilpasning af multiple reaktionsovervågning (MRM) overgange. Anvendelse af 0,01% HCOOH som additiv på en pentafluorphenyl (PFP) søjle (150 mm x 2,1 mm, 3 um) forbedrede signalresponsen en anden 2,5 gange og forkortet den samlede driftstid til 7 min. En lavere grænseværdi for kvantificering (LLOQ) på 10 pg / ml (0,044 nM) blev opnået, hvilket repræsenterer en signifikant følsomhedsforbedring over de rapporterede analyser. Denne forenklede, hurtige, selektive og følsomme metode tillader to plader af urinprøver (n = 192) at blive behandlet i en 24 h tidsperiode. I betragtning af den markant forbedrede analytiske ydeevne og ikke-invasiv og billig urinprøveudtagning er det foreslåede assay gavnligt for præklinisk og kliniskundersøgelser.
Effekten af oxidativ stress på klinisk præsentation er blevet fremmet i forkant de seneste år 1 . En af de biomarkører, der udforskes, er 3-nitrotyrosin (3-NT), et slutstabilt produkt, der dannes, når reaktive nitrogenarter (RNS) interagerer med tyrosin, en catecholamin neurotransmitterprecursor. Mens 3-NT kan have klinisk værdi som biomarkør for RNS in vivo, kan de væsentlige ændringer af tyrosins egenskaber og funktioner påvirke tilsvarende proteiner og cellefunktioner 1 , 2 . Ny forskning har antydet, at 3-NT kan spille en vigtig rolle i inflammatoriske tilstande 3 , neurodegenerative lidelser 4 , 5 , kardiovaskulær sygdom 6 og diabetes 7 samt tilstande relateret til oxidativ stress. Men disse obseRvationer er baseret på resultater fra metoder, der mangler følsomhed og / eller selektivitet 8 , 9 , 10 , 11 . De enorme 3-NT koncentrationsområder for de biologiske prøver, der tidligere er rapporteret i litteraturen, viser, at alvorlige analytiske problemer er forbundet med disse analyser, og teknisk forbedring er nødvendig for nøjagtigt at kvantificere niveauerne af 3-NT og verificere sin rolle i patologien af disse betingelser .
Kvantitering af gratis 3-NT i biologiske matricer præsenterer en særlig udfordring for mand og instrument 8 , 9 , 10 , 11 . For det første kræver sporingsniveauet for endogen 3-NT en ultrafølsom detektion; For det andet eksisterer adskillige strukturelt lignende analoger, især tyrosin, som er til stede iStort overskud kræver en høj grad af selektivitet For det tredje kræver den artefaktuelle dannelse af 3-NT ved tyrosinitrering med allestedsnærværende nitrat og nitrit særlig hensyntagen under prøvefremstilling for at undgå falsk overestimering af 3-NT.
Blandt en lang række metoder, der anvendes til at måle 3-NT, er MS / MS blevet betragtet som guldstandardmetoden på grund af sin overlegne følsomhed og selektivitet 11 , 12 , 13 , 14 . Gaskromatografi (GC) koblet MS / MS giver den bedste følsomhed, men de uundværlige prøve derivatiseringstrin er for kedelige og tidskrævende for at være effektive til klinisk nytteværdi 15 , 16 . LC-MS / MS kræver ikke kompleks prøve derivatisering, hvilket gør det mere lovende valg. Ikke desto mindre er der flere forhindringer at overvinde som seNsitiviteten af LC-MS / MS-metoder, der er rapporteret i litteraturen, skal forbedres til måling af lavt rigeligt 3-NT 7 , 17 , 18, og den relativt lange vendingstid skal afkortes for applikationer med høj gennemstrømning 12 , 13 , 17 , 19 .
Desuden spiller den anvendte biologiske matrix en vigtig rolle, når man overvejer kliniske anvendelser. Det skal være nemt og billigt at opnå og ikke-invasiv hvis det er muligt 20 , 21 , 22 . Plasma, den traditionelt anvendte prøve i litteraturen, er ikke en klinisk ønskelig matrix, så man søgte en metode, der anvender urin, som ikke er invasiv og omkostningseffektiv.
Flere forsøg på at udvikle relIable og specifikke LC-MS / MS metoder er blevet lavet ved brug af urin 9 , 10 , 11 . De har dog alle været utilstrækkelige til at være selektive, pålidelige eller effektive nok til klinisk brug. Effektiviteten af den overvejende SPE ved anvendelse af traditionel reverseret fasepatron (C18 type) som prøveoprensning til 3-NT-analysen er blevet stillet, og en sekventiel SPE af stærk kationbytter (SCX) og omvendt fase C18-OH er blevet foreslået 6 , 7 , 19 . En nyligt udviklet LC-MS / MS-metode anvendte en multi-trin rensningsproces med manuel C18 SPE, præparativ højtryksvæskekromatografi (HPLC) og online SPE til analyse af 3-NT 23 . Selvom denne metode var følsom nok til kliniske formål, med en LLOQ på 0,041 nM, var oprydningsprocessen intensiv og kedelig og krævedeRød 3 ml urin, hvilket begrænser dets gennemførlighed for høj gennemstrømning. En molekylært aftrykt polymer blev anvendt som SPE-sorbenten for at forbedre effektiviteten af oprydningsprocessen 14 , men den resulterende LLOQ (0,7 μg / ml) var ikke lav nok til kliniske prøver. En anden metode krævede todimensionel (2D) LC-MS / MS og immunaffinitetskromatografi til prøveoprensning for at opnå en detektionsgrænse (LOD) på 0,022 nM 24 . Mens alle disse metoder har gjort fremskridt i vurderingen af 3-NT, har ingen opnået følsomheden, pålideligheden og effektiviteten, der er nødvendig for kliniske anvendelser.
For at undersøge patologien omkring gratis 3-NT og dets rolle som biomarkør af oxidativ stress i kliniske omgivelser har vi udviklet en metode, der er enkel, effektiv, præcis og præcis, hvilket muliggør kliniske applikationer med høj gennemløb 25 . En miniaturiseret blandet mode kation eksk(MCX) 96-brønds ekstraktionsmikroplade blev implementeret for at opnå enkel og effektiv prøveoprensning og berigelse af 3-NT i en enkelt ekstraktion omgå de ulemper, der ses i de eksisterende metoder, der kræver derivatisering, fordampning og 2D-LC. Væskekromatografi med 0,01% HCOOH som additiv i mobilfase gav et forbedret signalrespons med en hurtig cykeltid. Selektivitet blev yderligere forbedret ved anvendelse af en mild NH4OAc elueringsopløsning til selektiv eluering af 3-NT, og anvendelse af MRM overgang for både 3-NT og den interne standard (IS). Matrixeffekten blev kompenseret ved anvendelse af en reduceret mængde af en foretrukken 13C-mærket isotopisk IS til kvantificering. Med fremkomsten af denne metode vil forskere og klinikere kunne kontrollere 3-NT's rolle i kliniske forhold og yderligere undersøge virkningen af oxidativt stress.
Væsentlige variationer i koncentrationer, der tidligere er rapporteret i litteraturen for det endogene frie 3-NT i humane urinprøver, afslører metodologiske problemer forbundet med tilgængelige analyser 8 , 9 , 10 , 11 . Nøjagtig bestemmelse af det lave basale niveau af 3-NT i human urin forbliver en udfordrende opgave, der kræver særlige forholdsregler for prøvepræparation og LC-MS /…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ville anerkende Scott Howard og Abigail Marinack for generel støtte og koordinering af dette arbejde.
3-Nitro-L-tyrosine | Sigma | N7389-5g | |
3-Nitro-L-tyrosine-13C9 | Sigma | 652296-5.0mg | |
Mass Spec Gold Urine | Golden West Biologicals | MSG 5000-1L | |
Oasis MCX 96-well µElution plate | Waters | 186001830BA | |
2mL 96 well collection plate | Phenomenex | AH0-7194 | |
96 positive processor | Waters | 186005521 | |
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol | Sigma | 14262-2L | |
LC-MS Ultra CHROMASOLV water | Sigma | 14263-2L | |
Formic acid for mass spectrometry | Sigma | 94318-50ML-F | |
Ammonium hydroxide solution | Sigma | 338818-1L | |
Ultra PFP propyl columns | Restek | 9179362 | |
5500 Triple quad | AB Sciex | / | Contact manufacture for more detail |
UFLC-XR | Shimadzu | / | Contact manufacture for more detail |
Integra 400 Plus | Roche | / | Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method |
LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial | Waters | 600000751CV | |
LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial | Waters | 186000384C | |
5 mL transport tube | Phenix | TT-3205 | |
50 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2263 | |
15 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2266 | |
eLine electronic pipette | Sartorius | 730391 | |
Microfuge centrifuge | Beckman Coulter | A46474 | |
OHAUS balance | Kennedy Scales, inc. | 735 | |
Vortex mixer | Bernstead Thermolyne | M16715 |