Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Integrasjon av miniatyrisert Solid Phase Extraction og LC-MS / MS Detection av 3-Nitrotyrosin i Human Urin for Kliniske Applications

doi: 10.3791/55778 Published: July 14, 2017

Summary

En selektiv og sensitiv væskekromatografi-tandemmassespektrometri-metode (LC-MS / MS) kombinert med en effektiv fastfase-ekstraksjon på en mikrosplatt med 96 mikrons blandet modus (MCX) ble utviklet for måling av fri 3-nitrotyrosin ( 3-NT) i human urin med høy gjennomstrømning, som er egnet for kliniske anvendelser.

Abstract

Fri 3-nitrotyrosin (3-NT) har blitt brukt som en mulig biomarkør for oksidativt stress. Økte nivåer av 3-NT har blitt rapportert i mange forskjellige patologiske forhold. Eksisterende metoder mangler imidlertid tilstrekkelig sensitivitet og / eller spesifisitet som er nødvendig for å måle det lave endogene nivået av 3-NT pålitelig og er for tungt for kliniske anvendelser. Derfor er det behov for analytisk forbedring for å nøyaktig kvantifisere nivåene av 3-NT og verifisere rollen som 3-NT i patologiske forhold. Denne protokollen presenterer utviklingen av en ny væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) deteksjon kombinert med en miniaturert fastfase-ekstraksjon (SPE) for hurtig og nøyaktig måling av 3-NT i human urin som en ikke-invasiv biomarkør For oksidativt stress. SPE ved hjelp av en 96-brønnplate forenklet prosessen markant ved å kombinere prøveopprydding og analyse-anrikning uten kjedelige derivatisering og fordampningstrinn, Reduserer løsemiddelforbruk, avfallshåndtering, risiko for forurensning og total behandlingstid. Anvendelsen av 25 mM ammoniumacetat (NH4OAC) ved pH 9 som SPE elueringsoppløsningen vesentlig forbedret selektivitet. Massespektrometrisignalrespons ble forbedret gjennom justering av multiple reaksjonsovervåking (MRM) overganger. Bruk av 0,01% HCOOH som tilsetningsstoff på en pentafluorfenyl (PFP) kolonne (150 mm x 2,1, 3 um) forbedret signalresponsen en annen 2,5 ganger og forkortet total kjøretid til 7 min. En nedre grense for kvantifisering (LLOQ) på 10 pg / mL (0,044 nM) ble oppnådd, hvilket representerer en signifikant følsomhetsforbedring over de rapporterte analysene. Denne forenklede, raske, selektive og følsomme metoden tillater to plater av urinprøver (n = 192) å behandles i en 24 h tidsperiode. Tatt i betraktning den markant forbedrede analytiske ytelsen, og ikke-invasiv og billig urinprøvetaking, er den foreslåtte analysen gunstig for preklinisk og kliniskstudier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Effektene av oksidativt stress på klinisk presentasjon har blitt fremstilt i forkant de siste årene 1 . En av biomarkørene som utforskes, er 3-nitrotyrosin (3-NT), et sluttstabil produkt dannet når reaktive nitrogenarter (RNS) interagerer med tyrosin, en katecholamin-neurotransmitter-forløper. Selv om 3-NT kan ha klinisk verdi som biomarkør for RNS in vivo, kan de betydelige endringene i tyrosins egenskaper og funksjoner påvirke tilsvarende proteiner og cellefunksjoner 1 , 2 negativt. Ny forskning har antydet at 3-NT kan spille en viktig rolle i inflammatoriske tilstander 3 , neurodegenerative lidelser 4 , 5 , kardiovaskulær sykdom 6 og diabetes 7 samt forhold knyttet til oksidativt stress. Men disse obseRvasjonene er basert på resultater fra metoder som mangler sensitivitet og / eller selektivitet 8 , 9 , 10 , 11 . De enorme 3-NT konsentrasjonsområder for de biologiske prøver som tidligere er rapportert i litteraturen, viser at alvorlige analytiske problemer er forbundet med disse analysene, og det er nødvendig med teknisk forbedring for å nøyaktig kvantifisere nivåene av 3-NT og verifisere sin rolle i patologien til disse tilstandene .

Kvantifiseringen av gratis 3-NT i biologiske matriser gir en spesiell utfordring for menneske og instrument 8 , 9 , 10 , 11 . For det første krever spornivået for endogen 3-NT en ultrafølsom deteksjon; For det andre finnes eksistensen av tallrike strukturelt liknende analoger, spesielt tyrosin, som er tilstede iStort overskudd, krever en høy grad av selektivitet; For det tredje, den artefaktuelle dannelsen av 3-NT ved tyrosinitrering med allestedsnærværende nitrat og nitritt krever spesiell vurdering under prøvepreparering for å unngå falsk overestimering av 3-NT.

Blant et bredt spekter av metoder som brukes til å måle 3-NT, har MS / MS blitt vurdert som standard for gullstandarden på grunn av sin overlegne sensitivitet og selektivitet 11 , 12 , 13 , 14 . Gaskromatografi (GC) koblet MS / MS gir den beste følsomheten, men de uunnværlige prøve derivatiseringstrinnene er for kjedelige og tidkrevende for å være effektive for klinisk bruk 15 , 16 . LC-MS / MS krever ikke komplisert prøve derivatisering, noe som gjør det mer lovende alternativ. Likevel er det flere hindringer for å overvinne, slik som seNsitiviteten til LC-MS / MS-metodene som er rapportert i litteraturen, må forbedres for måling av lite rikelig 3-NT 7 , 17 , 18, og den relativt lange ventetiden må forkortes for applikasjoner med høy gjennomstrømning 12 , 13 , 17 , 19 .

I tillegg, når man vurderer kliniske anvendelser, spiller den biologiske matrisen en betydelig rolle. Det bør være enkelt og rimelig å skaffe seg og ikke-invasiv hvis mulig 20 , 21 , 22 . Plasma, den tradisjonelt brukte prøven i litteraturen, er ikke en klinisk ønskelig matrise, så en metode som benytter urin som er ikke-invasiv og kostnadseffektiv, ble søkt.

Flere forsøk på å utvikle relIable og spesifikke LC-MS / MS metodikker har blitt gjort ved bruk av urin 9 , 10 , 11 . Imidlertid har de alle manglet å være selektive, pålitelige eller effektive nok til klinisk bruk. Effektiviteten til den overveiende SPE ved bruk av tradisjonell reversertfasepatron (C18 type) som prøveopprydding for 3-NT-analysen, er blitt undersøkt, og en sekventiell SPE med sterk kationutveksling (SCX) og reversert fase C18-OH er foreslått 6 , 7 , 19 . En nylig utviklet LC-MS / MS-metode benyttet en multi-trinns renseprosess med manuell C18 SPE, preparativ høytrykksvæskekromatografi (HPLC) og online SPE for analyse av 3-NT 23 . Selv om denne metoden var sensitiv nok til kliniske formål, med en LLOQ på 0,041 nM, var oppryddingsprosessen intensiv og kjedelig og requiRød 3 ml urin, noe som begrenser muligheten for høy gjennomstrømning. En molekylært påtrykt polymer ble anvendt som SPE-sorbenten for å forbedre effektiviteten av oppryddingsprosessen 14 , men den resulterende LLOQ (0,7 ug / ml) var ikke lav nok til kliniske prøver. En annen metode krevde todimensjonal (2D) LC-MS / MS og immunaffinitetskromatografi for prøveopprydding for å oppnå en gjenkjenningsgrense (LOD) på 0,022 nM 24 . Mens alle disse metodene har gjort fremskritt i vurderingen av 3-NT, har ingen oppnådd følsomheten, påliteligheten og effektiviteten som er nødvendig for kliniske anvendelser.

For å undersøke patologien til gratis 3-NT og dets rolle som en biomarkør av oksidativt stress i kliniske innstillinger, har vi utviklet en metodikk som er enkel, effektiv, nøyaktig og presis, og muliggjør kliniske applikasjoner med høy ytelse 25 . En miniaturisert blandet modus kation eksk(MCX) 96-brønns ekstraksjonsmikroplate ble implementert for å oppnå enkel og effektiv prøveopprensing og anrikning av 3-NT i en enkelt ekstraksjon omgåelse av ulempene sett i de eksisterende metodene som krever derivatisering, fordamping og 2D-LC. Væskekromatografi med 0,01% HCOOH som additiv i mobilfase ga et forbedret signalrespons med en rask syklus tid. Selektivitet ble ytterligere forbedret ved anvendelse av en mild NH4OAC elueringsoppløsning for selektiv eluering av 3-NT, og bruk av MRM overgang for både 3-NT og den interne standard (IS). Matrikseffekten ble kompensert ved å bruke en redusert mengde av en foretrukket 13 C-merket isotopisk IS for kvantifisering. Med fremkomsten av denne metoden vil forskere og klinikere kunne verifisere rollen som 3-NT i kliniske forhold og videre undersøke virkningen av oksidativt stress.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle studier som involverte urinprøver fra mennesker ble utført etterlevelse av prosedyren godkjent av Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB).

1. Urinprøveinnsamling og kreatinin (Cr) Bestemmelse

  1. Samle 5 ml av neste morgen urinprøver etter ca. 10 h natten fast i et 5 ml transportrør A inneholdende 250 ul 3 N HC1 som konserveringsmiddel og lagre ved -20 ° C til bruk.
  2. Tine og hvirvel 5 ml transporturin Et rør og sentrifuge i en sentrifuge ( f.eks. Sorvall) (2297 xg, 10 min).
  3. Aliquot 1 ml urin to ganger fra 5 ml transportrøret A.
  4. Bestem Cr ved en urin kreatininmetode 26 .

2. Forberedelse av standard, IS og kvalitetskontroll (QC) prøver

  1. Forbered en stamløsning av 3-NT ved 100 μg / ml i vann med 0,01% HCOOH mobil fase A (MA) og lagre ved -20 ° C.
  2. GjøreEn 3-NT arbeidsstandardløsning ved konsentrasjon på 100 ng / ml ved fortynning av 100 μg / ml 3-NT stamløsning med MA.
  3. Generer standarder som varierer fra 5 til 2500 pg / ml ved fortynning av 100 ng / ml arbeidsstandard med 0,15 M HCl surgjort blank urin fri for 3 NT sammen med blank og dobbeltblankeprøver.
  4. Forbered en stamløsning av IS 13 C 9 -3-NT ved 100 μg / mL i vann med MA og lagre ved -20 ° C.
  5. Lag en IS-arbeidsløsning ved 500 pg / ml ved fortynning av 100 μg / mL 13 C 9 -3-NT IS stamløsning med MA.
  6. Opprett fem nivåer av QC-prøver som dekker LLOQ, lavt, middels og høyt nivå ( dvs. 10, 25, 100, 500 og 1.250 pg / mL), ved fortynning av 3-NT-arbeidsstandard i surgjort blind urin.

3. Solid faseekstraksjonsprosedyre

  1. Tine og vortex urinprøver, standarder og QC-prøver.
  2. Legg til urinprøver, standarder og QC sampLes (250 μl hver) til 32 brønner av en ren 2 ml 96-brønns oppsamlingsplate.
  3. Innfør 500 pg / ml IS-arbeidsløsningen (50 μL) til hver brønn, bortsett fra dobbeltblokkprøvebrønn. Tilsett 0,01% HCOOH (50 μl) til dobbeltblokkprøvebrønnen.
  4. Tilsett LC-MS / MS vann med 0,1% HCOOH (250 μl).
  5. Bland blandingen med en 8-kanals pipette tre ganger.
  6. Dekk platen til SPE laster.
  7. Plasser en MCX 96-brønn-ekstraksjonsplate og et oppsamlingsreservoar på en positivtrykksprosessor.
  8. Tilstand ekstraksjonsplaten med flytende MeOH (200 μl) gjennom sorbenten.
  9. Equilibrere ved å rense vann med 2% HCOOH (200 μL) gjennom sorbenten.
  10. Legg hele volumet av hver av de forhåndsblandte prøvene forsiktig på den forhåndskondisjonerte ekstraksjonsplaten forsiktig med en 8-kanals pipette.
  11. Sett lavt positivt trykk ( f.eks . 3 psi) på den positive trykkprosessoren for å la blandingen strømme thrSørg sorbenten sakte, juster trykket om nødvendig.
  12. Vask brønnene ved å rense vann med 2% HCOOH (200 μL) gjennom sorbenten.
  13. Vask brønnene ved å flyte metanol (200 μl) gjennom sorbenten.
  14. Vask brønnene ved å rense vann (200 μl) gjennom sorbenten.
  15. Tørk brønnene helt med høy positiv trykkinnstilling ( f.eks . 40 psi) på positivtrykksprosessoren.
  16. Bytt reservoaret med en ren 2 ml 96-brønns oppsamlingsplate.
  17. Påfør 25 mM NH 4 OAc ved pH 9 (50 μl) for å eluere den beholdte analyten og IS fra ekstraksjonsplaten.
  18. Pipette LC-MS vann med 5% HCOOH (50 μL) for å nøytralisere eluatet.
  19. Bland med 8-kanals pipetten tre ganger og send til LC-MS / MS-stasjon for analyse.

4. LC-MS / MS-analyse

  1. Mål nøyaktig 2.000 ml LC-MS vann med en oppgradert sylinder og overfør den til en 2 L flaske.
  2. PIpette 200 μL ren HCOOH i den ovennevnte flasken som inneholder LC-MS vann.
  3. Bland grundig og merk som mobil fase A (MA). Inkluder initialer, forberedelsesdato og utløpsdato.
  4. Ta en 2 L flaske LC-MS metanol og etikett som mobil fase B (MB) med startdato og utløpsdato.
  5. Still temperaturen på auto-sampler til 4 ° C.
  6. Plasser oppsamlingsplaten med preparerte prøver i autosampleren.
  7. Sett en PFP-kolonne (150 mm x 2.1 mm ID, 3 μm) og beskytt kolonne i ovnen.
  8. Sett ovntemperaturen til 30 ° C.
  9. Equilibrere 10 minutter ved bruk av oppkjøpsmetoden med LC-gradientelueringen som vist i tabell 1 .
Tid (min) modul arrangementer Parameter
0 pumps Pumpe B Konk. 5
0.5 pumps Pumpe B Konk. 20
1 pumps Pumpe B Konk. 50
3 pumps Pumpe B Konk. 80
4 pumps Pumpe B Konk. 90
4,01 pumps Pumpe B Konk. 95
5.5 pumps Pumpe B Konk. 95
5.6 pumps Pumpe B Konk. 5
7 Controller Stoppe

Tabell 1: Væskekromatografi Gradientelueringsbetingelser

  1. Lag en batchliste inkludertStandarder, QC og urinprøver.
  2. Start batch ved injeksjon av preparerte prøver (12 μL).

5. Toppidentifikasjon, integrasjon og dataprosess

  1. Kontroller datainnsamling og prosessering ved hjelp av programvaren.
  2. Identifiser og integrere 3-NT og IS topper for alle prøvene.
  3. Opprett en standardkurve med intervallet 10-2.500 pg / ml for 3 NT-kvantifisering ved lineær regresjon av topparealforholdet på 3 NT og IS versus den nominelle 3 NT-konsentrasjonen med en vektningsfaktor på 1 / x.
  4. Kvantifiser alle prøvene ved hjelp av standardkurven.
  5. Bestem om QC-prøvene faller i det etablerte området.
  6. Konverter de påviste konsentrasjonene av urinprøver til sluttresultater i enheten av nM eller nmol / mmol Cr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 illustrerer at 3-NT er helt kromatografisk separert fra andre strukturelt lignende tyrosinanaloger under den optimaliserte LC-tilstanden, som eliminerer de sammenløpende interferensene på grunn av disse meget overdrevne forbindelser og følgelig forbedrer graden av assayselektivitet. I tillegg tillater gradientelueringen med 0,01% HCOOH som additiv i MA og metanol ved en strømningshastighet på 0,45 ml / min hurtig eluering av 3-NT ( dvs. 3 min med en omdreiningstid på 7 minutter).

Figur 1
Figur 1: Baseline LC-kromatografisk separasjon av 3-NT fra andre tyrosinanaloger i en standardløsning. ( A ) p- Tyrosin; ( B ) m- Tyrosin; ( C ) o -tyrosin; ( D ) Cl-tyrosin; ( E ) 3-NT. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2 viser at ingen 3-NT-signal observeres i dobbeltblokkprøven, noe som indikerer ingen dannelse av artefaktual 3-NT under hele prosessen. Figur 3 illustrerer representative MRM kromatogrammer av 3-NT og IS for en sunn person. Som det kan ses, observeres ingen forstyrrende signaler ved retensjonstidene for 3-NT og IS. Videre ble mindre enn ± 6% forskjell i 3-NT mellom ikke-spiked og spiked pooled urinprøver med nitrit (50 μM), nitrat (50 μM) og tyrosin (50 mg / L) 25 observert, noe som ytterligere gir støtte Til spesifisiteten til analysen.


Figur 2: MRM kromatogrammer av 3-NT og IS i en representativ dobbel blank prøve. ( A ) 3-NT MRM-kvantifier 227,0> 90,0; ( B ) ER MRM-kvantifiserer 236,0> 189,0. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: MRM-kromatogrammer av 3-NT og IS i en representativ urinprøve av sunne mennesker. ( A ) 3-NT MRM-kvantifier 227,0> 90,0; ( B ) ER MRM-kvantifiserer 236,0> 189,0. Vennligst klikk på hanÅ se en større versjon av denne figuren.

Standardkurven ble etablert ved ekstraksjon av surgjort blank urin spikket med 3-NT i området 10-2.500 pg / ml ved å plotte topparealforholdet 3 NT og IS versus den nominelle konsentrasjonen av 3 NT med en lineær montering Av 1 / x vekting. En representativ standardkurve er vist i figur 4 . LOD, definert som den laveste konsentrasjonen med et signal-til-støyforhold større enn tre, ble bestemt til å være 2 pg / ml (0,0088 nM). LLOQ ble bestemt til å være 10 pg / ml (0,044 nM) per definisjon som den laveste konsentrasjonen som skal måles innen ± 20% av usikkerhet og nøyaktighet med signal-støyforholdet større enn ti.

Figur 4
Figur 4: En representativ 3-NT standardkurve iOmråde på 10-2.500 pg / ml. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vesentlige variasjoner i konsentrasjoner som tidligere er rapportert i litteraturen for det endogene frie 3-NT i humane urinprøver, avslører metodiske problemer forbundet med tilgjengelige analyser 8 , 9 , 10 , 11 . Nøyaktig bestemmelse av det lave basale nivået av 3-NT i human urin forblir en utfordrende oppgave som krever spesielle forholdsregler for prøvepreparering og LC-MS / MS analyse. Denne protokollen skisserer en ny SPE-prosedyre kombinert med en selektiv LC-MS / MS-deteksjon som tillater den spesifikke og sensitive bestemmelsen av urin 3-NT med høy gjennomstrømning.

Forsiktig utvelgelse av MRM-parametere forbedret selektiviteten for deteksjon av 3-NT. MRM-overgangen m / z 236,0> 96,0 av IS for 3-NT i plasma 27 forårsaket alvorlig forurensning for urinprøver. En renere, 9-ganger økning i signalRespons ble oppnådd ved MRM-overgang m / z 236,0> 189,0. MRM overgang m / z 227,0> 90,0 ble valgt for 3-NT kvantifisering på grunn av alvorlig interferens ved bruk av den mest intensive overgangen m / z 227.0> 181.0. De detaljerte MRM-overgangene og sammensatte parametere er oppsummert i tabell 2 .

analytt MRM overgang (m / z) DP (V) EP (V) CE (eV) CXP (V)
3-NT (kvantifierer) 227,0> 90,0 50 10 38 1. 3
3-NT (kvalifiserer) 227,0> 103,9 50 10 45 16
13 C 9 -NT (IS) 236,0> 189,0 50 10 21 14
En ionspray spenning: 2200 V; Temperatur: 600 ° C; Gardin gass: 35; CAD gass: 9; Nebulisator gass (GS1): 50; Varmelegemer (GS2): 55.

Tabell 2: Optimaliserte MRM-betingelser.

Den tradisjonelle C18-typen kolonne som vanligvis brukes for LC-kromatografisk separasjon av 3-NT i litteraturen 12 , 13 , 17 , 19 , krever vanligvis en lang vendetid for å redusere interferens, noe som gjør den ikke til hjelp for høy gjennomstrømning. I denne protokollen ble en PFP-kolonne ansatt for optimalisering av LC-kromatografisk separasjon av 3-NT basert på dets forbedrede retensjon av polære forbindelser 22 ,> 27 , 28 . Konsentrasjonen av mobilfaseadditiver har en viktig innflytelse på signalintensiteten 25 , 28 . HCOOH ved 0,01% ble funnet å være det optimale additivet i MA da det resulterte i et 2,5-ganger signalforsterkning over 0,1% konsentrasjon, og ytterligere reduksjoner i konsentrasjon redusert signalrespons. En gradientelueringsprofil ved anvendelse av 0,01% HCOOH i vann (MA) og metanol (MB) ble etablert med en strømningshastighet på 0,45 ml / min, og oppnådde en optimal separasjon og rask eluering av 3 NT innen 3 min med en total kjøretid på Bare 7 minutter, noe som muliggjør betydelig raskere analyse av 3-NT i kompliserte biologiske matriser enn rapportert i litteraturen 12 , 13 , 17 , 19 .

For å løse ineffektiviteten til den tradisjonelle reverserte fasen patronen (C18 type) sReominantly brukt for SPE av biologiske prøver 6 , 7 , har vi nylig utviklet en LC-MS / MS-metode for å bestemme 3-NT i human plasma ved SPE på en enkelt dobbeltfunksjonell 96-brønn MCX plate 27 , noe som resulterte i forbedringer i SPE Effektivitet og selektivitet. En tydelig ulempe av alle SPE-tilnærmingene i litteraturen er imidlertid arbeidskrevende og risikofunksjonelle fordampnings- og rekonstitueringstrinn. I tillegg krever plasmametoden en ekstra forvask av ekstraksjonsplaten for å eliminere forurensning fra sorbenten. I denne protokollen har disse ulemper blitt eliminert av en skreddersydd SPE ved bruk av en miniatyrisert mikroplate med 96 brønner. Utvalget av elueringsoppløsning ble funnet å være avgjørende for utvinningseffektiviteten. Betydelige forstyrrelser ble observert i urinprøver ved å bruke den felles NH4OH elueringsoppløsningen med variert sammensetning av MeOH. Det ble hypoteser som interfererering stoffer ble ko-eluert med analytten grunn av den sterke eluering kraft av den metanoliske NH4OH elueringsoppløsning, som følgelig resulterer i lav selektivitet. For å forbedre selektiviteten var det nødvendig å identifisere en løsning som ville være både sterk nok til å eluere 3-NT og svak nok til ikke å forårsake eluering av forstyrrende forbindelser. Etter detaljert undersøkelse av mindre basisk NH4OAC ved forskjellige pH-verdier og konsentrasjoner, ble en 25 mM NH 4OAc-løsning med pH 9 funnet å være optimalt som elueringsoppløsning. Med den optimaliserte elueringsoppløsningen, ble problemet med interfererende forbindelser løst, og en forsterkning i sensitivitet 40% ble oppnådd sammenlignet med den vanlige metanoliske NH4OH elueringsoppløsning.

Tabell 3 gir en detaljert oppsummering av den analytiske ytelsen til denne protokollen 25 sammenlignet med andre tilgjengelige metoder for bestemmelse av det frie 3-NT i biologiske matriser. Denne protokollen av Gir flere forskjellige fordeler enn tidligere rapporterte analyser. For det første ble det oppnådd et enkelt trinn for prøveopprensing og analyse-anriking ved å benytte 96-brønns-ekstraksjonsmikroplaten, idet man unngår 1 - 5 syklusene av fordampning og rekonstitusjon som vanligvis kreves i 3-NT-metodene som involverer SPE. For det andre ble løsningsmiddelforbruket per prøve for SPE drastisk redusert, fra 5,5 - 118 ml til bare 1,1 ml, som representerer en 5-107 ganger reduksjon i løsemiddel og avfallshåndtering. For det tredje ble LC-svingningstiden per prøve redusert 2-7 ganger sammenlignet med andre analyser og var 30% raskere enn vår tidligere plasmametode. For det fjerde var en 10-3000 fold lavere mengde av den foretrukne 13 C-merkede IS nødvendig for kompensasjon av matriseffekt. Til slutt representerer denne analysen en signifikant forbedring av følsomheten over andre konvensjonelle SPE-baserte LC-MS / MS metoder for kvantifisering av urin 3-NT.

måter "> Prøveforberedelse analytisk
metode
Matrise LOD (nM) LOQ (nM) LC løp (min) Evap c Sol d (mL) IS (ng) Ref. SPE (C-18)
+ filtrering LC-MS / MS- Plasma 0,034 0,112 20 1 1. 3 Analog f 2 [6] SPE
(MCX plate) LC-MS / MS- Plasma 0,0088 0,022 10 1 5.6 13 C 9 -NT 0.25 [27] PPT + SPE (MCX) + der a HPLC-UV serum NA b 100 40 1 7.3 NA b NA b [12] HPLC + der a GC-MS / MS- Urin 0,004 0,125 NA b 5 NA b D 3 -NT 4.6 [16] PPT + SPE (amino) + der a LC-MS / MS- Katturin NA b 14.5 40 3 23 D 3 -NT 75 [17] PPT + hydrolyse + SPE (SCX-C18) LC-MS / MS- Urin (protein) 400 NA 50 2 118 D 3 -NT 2 [19] IA-2D LC e LC-MS / MS- Urin 0,022 NA 14 NA b NA b 13 C 9 -NT 0,85 [24] SPE (C18) + hydrolyse HPLC-ECD Urin (totalt) NA b 4 40 2 5.5 NA b NA b [1. 3] SPE (C18) + Prep LC g
+ Online SPE LC-MS / MS- Urin 0,0088 0,041 30 2 38 D 3 -NT 5 [23] SPE (MIP) HPLC-UV Spiked Urine 700 NA 20 18 NA b NA b [14] SPE (MCX μEution) LC-MS / MS- Urin 0,0088 0,044 7 NEI 1.1 13 C 9 -NT 0,03 Denne jobben A der: derivatisering; B NA: ikke tilgjengelig; C Evap: Fordampning; D Sol: løsemiddel per prøve; E IA-2D LC: immunaffinitetskromatografi og todimensjonal LC; F Analog: o-metyl-tyrosin; G Prep LC: preparativ HPLC rensing.

Tabell 3: CompariSønn av den analytiske ytelsen til denne protokollen med eksisterende analyser for deteksjon av 3-NT i biologiske matriser

Den analytiske og kliniske gyldigheten av den foreslåtte analysen ble ytterligere vurdert ved bestemmelse av referansegruppen for urin 3-NT opprettet fra autentiske urinprøver av 82 friske mennesker 25 . Den forbedrede enkelhets- og gjennomføringsmetoden tillater to plater av urinprøver (n = 192) å behandles og analyseres i en 24 h tidsperiode. Den utviklede metoden som benytter den ikke-invasive urinprøvingen, er enkel, rask, sensitiv og selektiv, forventes å være et kraftig verktøy for å verifisere rollen som 3-NT i kliniske forhold og videre undersøke virkningen av oksidativt stress. De kritiske trinnene i protokollen inkluderer SPE på en MCX mikroplate ved bruk av en mild NH4OAc som elueringsbuffer, LC-separasjon på en PFP-kolonne med 0,01% HCOOH som et additiv og MRM-utvalg for 3-NT quantificasjon. Fremtidig anvendelse av metoden er å kvantifisere 3-NT konsentrasjoner hos pasienter med patologiske forhold som inflammatoriske og neurodegenerative forstyrrelser, etc. De potensielle fallgruvene til den foreslåtte protokollen for kliniske anvendelser gjenstår å bli behandlet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne vil anerkjenne Scott Howard og Abigail Marinack for generell støtte og koordinering av dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Nitro-L-tyrosine Sigma N7389-5g
3-Nitro-L-tyrosine-13C9 Sigma 652296-5.0mg
Mass Spec Gold Urine Golden West Biologicals MSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µElution plate Waters 186001830BA
2 mL 96 well collection plate Phenomenex   AH0-7194
96 positive processor Waters  186005521
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol   Sigma 14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV water Sigma 14263-2L
Formic acid for mass spectrometry Sigma 94318-50ML-F
Ammonium hydroxide solution Sigma 338818-1L
Ultra PFP propyl columns Restek 9179362
5500 Triple quad AB Sciex  / Contact manufacture for more detail
UFLC-XR Shimadzu  / Contact manufacture for more detail
Integra 400 Plus  Roche / Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method
LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial Waters 600000751CV
LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial Waters 186000384C
5 mL transport tube Phenix TT-3205
50 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2263
15 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2266
eLine electronic pipette Sartorius 730391
Microfuge centrifuge  Beckman Coulter A46474
OHAUS balance   Kennedy Scales, inc. 735
Vortex mixer  Bernstead Thermolyne M16715

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52, (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87, (1), 315-424 (2007).
  3. Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61, (1), 90-96 (2006).
  4. Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association? J. Clin. Invest. 111, (2), 163-169 (2003).
  5. Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
  6. Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33, (4), 697-704 (2012).
  7. Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44, (1), 67-78 (2009).
  8. Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25, (3-4), 351-361 (2003).
  9. Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851, (1-2), 160-171 (2007).
  10. Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42, (1), 45-63 (2012).
  11. Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33, (4), 237-276 (2014).
  12. Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26, (1), 41-50 (2012).
  13. Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217, (19), 3269-3274 (2010).
  14. Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40, (1), 336-341 (2013).
  15. Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276, (2), 195-203 (1999).
  16. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827, (1), 146-156 (2005).
  17. Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75, (2), 261-267 (2003).
  18. Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799, (2), 245-254 (2004).
  19. Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181, (1), 31-39 (2008).
  20. Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35, (3), 635-644 (2011).
  21. Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406, (28), 7287-7297 (2014).
  22. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
  23. Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28, (5), 997-1006 (2015).
  24. Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380, (1), 68-76 (2008).
  25. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407, (25), 7703-7712 (2015).
  26. Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. Mannheim. Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html 2011-2011 (2011).
  27. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
  28. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).
Integrasjon av miniatyrisert Solid Phase Extraction og LC-MS / MS Detection av 3-Nitrotyrosin i Human Urin for Kliniske Applications
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).More

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter