En selektiv og sensitiv væskekromatografi-tandemmassespektrometri-metode (LC-MS / MS) kombinert med en effektiv fastfase-ekstraksjon på en mikrosplatt med 96 mikrons blandet modus (MCX) ble utviklet for måling av fri 3-nitrotyrosin ( 3-NT) i human urin med høy gjennomstrømning, som er egnet for kliniske anvendelser.
Fri 3-nitrotyrosin (3-NT) har blitt brukt som en mulig biomarkør for oksidativt stress. Økte nivåer av 3-NT har blitt rapportert i mange forskjellige patologiske forhold. Eksisterende metoder mangler imidlertid tilstrekkelig sensitivitet og / eller spesifisitet som er nødvendig for å måle det lave endogene nivået av 3-NT pålitelig og er for tungt for kliniske anvendelser. Derfor er det behov for analytisk forbedring for å nøyaktig kvantifisere nivåene av 3-NT og verifisere rollen som 3-NT i patologiske forhold. Denne protokollen presenterer utviklingen av en ny væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) deteksjon kombinert med en miniaturert fastfase-ekstraksjon (SPE) for hurtig og nøyaktig måling av 3-NT i human urin som en ikke-invasiv biomarkør For oksidativt stress. SPE ved hjelp av en 96-brønnplate forenklet prosessen markant ved å kombinere prøveopprydding og analyse-anrikning uten kjedelige derivatisering og fordampningstrinn, Reduserer løsemiddelforbruk, avfallshåndtering, risiko for forurensning og total behandlingstid. Anvendelsen av 25 mM ammoniumacetat (NH4OAC) ved pH 9 som SPE elueringsoppløsningen vesentlig forbedret selektivitet. Massespektrometrisignalrespons ble forbedret gjennom justering av multiple reaksjonsovervåking (MRM) overganger. Bruk av 0,01% HCOOH som tilsetningsstoff på en pentafluorfenyl (PFP) kolonne (150 mm x 2,1, 3 um) forbedret signalresponsen en annen 2,5 ganger og forkortet total kjøretid til 7 min. En nedre grense for kvantifisering (LLOQ) på 10 pg / mL (0,044 nM) ble oppnådd, hvilket representerer en signifikant følsomhetsforbedring over de rapporterte analysene. Denne forenklede, raske, selektive og følsomme metoden tillater to plater av urinprøver (n = 192) å behandles i en 24 h tidsperiode. Tatt i betraktning den markant forbedrede analytiske ytelsen, og ikke-invasiv og billig urinprøvetaking, er den foreslåtte analysen gunstig for preklinisk og kliniskstudier.
Effektene av oksidativt stress på klinisk presentasjon har blitt fremstilt i forkant de siste årene 1 . En av biomarkørene som utforskes, er 3-nitrotyrosin (3-NT), et sluttstabil produkt dannet når reaktive nitrogenarter (RNS) interagerer med tyrosin, en katecholamin-neurotransmitter-forløper. Selv om 3-NT kan ha klinisk verdi som biomarkør for RNS in vivo, kan de betydelige endringene i tyrosins egenskaper og funksjoner påvirke tilsvarende proteiner og cellefunksjoner 1 , 2 negativt. Ny forskning har antydet at 3-NT kan spille en viktig rolle i inflammatoriske tilstander 3 , neurodegenerative lidelser 4 , 5 , kardiovaskulær sykdom 6 og diabetes 7 samt forhold knyttet til oksidativt stress. Men disse obseRvasjonene er basert på resultater fra metoder som mangler sensitivitet og / eller selektivitet 8 , 9 , 10 , 11 . De enorme 3-NT konsentrasjonsområder for de biologiske prøver som tidligere er rapportert i litteraturen, viser at alvorlige analytiske problemer er forbundet med disse analysene, og det er nødvendig med teknisk forbedring for å nøyaktig kvantifisere nivåene av 3-NT og verifisere sin rolle i patologien til disse tilstandene .
Kvantifiseringen av gratis 3-NT i biologiske matriser gir en spesiell utfordring for menneske og instrument 8 , 9 , 10 , 11 . For det første krever spornivået for endogen 3-NT en ultrafølsom deteksjon; For det andre finnes eksistensen av tallrike strukturelt liknende analoger, spesielt tyrosin, som er tilstede iStort overskudd, krever en høy grad av selektivitet; For det tredje, den artefaktuelle dannelsen av 3-NT ved tyrosinitrering med allestedsnærværende nitrat og nitritt krever spesiell vurdering under prøvepreparering for å unngå falsk overestimering av 3-NT.
Blant et bredt spekter av metoder som brukes til å måle 3-NT, har MS / MS blitt vurdert som standard for gullstandarden på grunn av sin overlegne sensitivitet og selektivitet 11 , 12 , 13 , 14 . Gaskromatografi (GC) koblet MS / MS gir den beste følsomheten, men de uunnværlige prøve derivatiseringstrinnene er for kjedelige og tidkrevende for å være effektive for klinisk bruk 15 , 16 . LC-MS / MS krever ikke komplisert prøve derivatisering, noe som gjør det mer lovende alternativ. Likevel er det flere hindringer for å overvinne, slik som seNsitiviteten til LC-MS / MS-metodene som er rapportert i litteraturen, må forbedres for måling av lite rikelig 3-NT 7 , 17 , 18, og den relativt lange ventetiden må forkortes for applikasjoner med høy gjennomstrømning 12 , 13 , 17 , 19 .
I tillegg, når man vurderer kliniske anvendelser, spiller den biologiske matrisen en betydelig rolle. Det bør være enkelt og rimelig å skaffe seg og ikke-invasiv hvis mulig 20 , 21 , 22 . Plasma, den tradisjonelt brukte prøven i litteraturen, er ikke en klinisk ønskelig matrise, så en metode som benytter urin som er ikke-invasiv og kostnadseffektiv, ble søkt.
Flere forsøk på å utvikle relIable og spesifikke LC-MS / MS metodikker har blitt gjort ved bruk av urin 9 , 10 , 11 . Imidlertid har de alle manglet å være selektive, pålitelige eller effektive nok til klinisk bruk. Effektiviteten til den overveiende SPE ved bruk av tradisjonell reversertfasepatron (C18 type) som prøveopprydding for 3-NT-analysen, er blitt undersøkt, og en sekventiell SPE med sterk kationutveksling (SCX) og reversert fase C18-OH er foreslått 6 , 7 , 19 . En nylig utviklet LC-MS / MS-metode benyttet en multi-trinns renseprosess med manuell C18 SPE, preparativ høytrykksvæskekromatografi (HPLC) og online SPE for analyse av 3-NT 23 . Selv om denne metoden var sensitiv nok til kliniske formål, med en LLOQ på 0,041 nM, var oppryddingsprosessen intensiv og kjedelig og requiRød 3 ml urin, noe som begrenser muligheten for høy gjennomstrømning. En molekylært påtrykt polymer ble anvendt som SPE-sorbenten for å forbedre effektiviteten av oppryddingsprosessen 14 , men den resulterende LLOQ (0,7 ug / ml) var ikke lav nok til kliniske prøver. En annen metode krevde todimensjonal (2D) LC-MS / MS og immunaffinitetskromatografi for prøveopprydding for å oppnå en gjenkjenningsgrense (LOD) på 0,022 nM 24 . Mens alle disse metodene har gjort fremskritt i vurderingen av 3-NT, har ingen oppnådd følsomheten, påliteligheten og effektiviteten som er nødvendig for kliniske anvendelser.
For å undersøke patologien til gratis 3-NT og dets rolle som en biomarkør av oksidativt stress i kliniske innstillinger, har vi utviklet en metodikk som er enkel, effektiv, nøyaktig og presis, og muliggjør kliniske applikasjoner med høy ytelse 25 . En miniaturisert blandet modus kation eksk(MCX) 96-brønns ekstraksjonsmikroplate ble implementert for å oppnå enkel og effektiv prøveopprensing og anrikning av 3-NT i en enkelt ekstraksjon omgåelse av ulempene sett i de eksisterende metodene som krever derivatisering, fordamping og 2D-LC. Væskekromatografi med 0,01% HCOOH som additiv i mobilfase ga et forbedret signalrespons med en rask syklus tid. Selektivitet ble ytterligere forbedret ved anvendelse av en mild NH4OAC elueringsoppløsning for selektiv eluering av 3-NT, og bruk av MRM overgang for både 3-NT og den interne standard (IS). Matrikseffekten ble kompensert ved å bruke en redusert mengde av en foretrukket 13 C-merket isotopisk IS for kvantifisering. Med fremkomsten av denne metoden vil forskere og klinikere kunne verifisere rollen som 3-NT i kliniske forhold og videre undersøke virkningen av oksidativt stress.
Vesentlige variasjoner i konsentrasjoner som tidligere er rapportert i litteraturen for det endogene frie 3-NT i humane urinprøver, avslører metodiske problemer forbundet med tilgjengelige analyser 8 , 9 , 10 , 11 . Nøyaktig bestemmelse av det lave basale nivået av 3-NT i human urin forblir en utfordrende oppgave som krever spesielle forholdsregler for prøvepreparering og LC-MS / MS analy…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil anerkjenne Scott Howard og Abigail Marinack for generell støtte og koordinering av dette arbeidet.
3-Nitro-L-tyrosine | Sigma | N7389-5g | |
3-Nitro-L-tyrosine-13C9 | Sigma | 652296-5.0mg | |
Mass Spec Gold Urine | Golden West Biologicals | MSG 5000-1L | |
Oasis MCX 96-well µElution plate | Waters | 186001830BA | |
2mL 96 well collection plate | Phenomenex | AH0-7194 | |
96 positive processor | Waters | 186005521 | |
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol | Sigma | 14262-2L | |
LC-MS Ultra CHROMASOLV water | Sigma | 14263-2L | |
Formic acid for mass spectrometry | Sigma | 94318-50ML-F | |
Ammonium hydroxide solution | Sigma | 338818-1L | |
Ultra PFP propyl columns | Restek | 9179362 | |
5500 Triple quad | AB Sciex | / | Contact manufacture for more detail |
UFLC-XR | Shimadzu | / | Contact manufacture for more detail |
Integra 400 Plus | Roche | / | Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method |
LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial | Waters | 600000751CV | |
LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial | Waters | 186000384C | |
5 mL transport tube | Phenix | TT-3205 | |
50 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2263 | |
15 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2266 | |
eLine electronic pipette | Sartorius | 730391 | |
Microfuge centrifuge | Beckman Coulter | A46474 | |
OHAUS balance | Kennedy Scales, inc. | 735 | |
Vortex mixer | Bernstead Thermolyne | M16715 |