Summary
Automatiserte systemer og protokoller for rutinemessig utarbeidelse av et stort antall skjermer og nanoliter krystallisering dråper for damp diffusjon eksperimenter er beskrevet og diskutert.
Abstract
Når høy kvalitet krystaller er oppnådd som diffract x-stråler, kan krystallstruktur løses på nær Atom løsning. Betingelsene til å krystallisere proteiner, DNAs, RNAs og deres komplekser kan imidlertid ikke være spådd. Ansette en rekke forhold er en måte å øke avkastningen av kvalitet Diffraksjon krystaller. To helautomatisk systemer er utviklet på av MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge i England MRC-LMB) som forenkler krystallisering screening mot 1920 første vilkår av damp spredning i nanoliter dråper. Halvautomatisk protokoller har også blitt utviklet for å optimalisere betingelser ved å endre konsentrasjonen av reagenser, pH, eller ved å innføre tilsetningsstoffer som potensielt forbedrer egenskapene til de resulterende krystallene. Alle tilsvarende protokollene er beskrevet i detalj og kort diskutert. Sammen gjør de praktiske og effektive macromolecular krystallisering i multi-user anlegg, samtidig gir brukere kontroll over nøkkelparametre for sine eksperimenter.
Introduction
Røntgenkrystallografi brukes mye lenger fremme vår forståelse av biologisk og sykdom mekanismer på Atom-nivå og deretter hjelpe rasjonelle tilnærmingsmåter til narkotika funnet1. For dette, renset og konsentrert (2-50 mg/mL) macromolecular prøver av protein, DNA, RNA, andre ligander og deres komplekser er trialed for deres tilbøyelighet til skjemaet bestilt tredimensjonale lattices gjennom krystallisering2,3 ,4. Når høy kvalitet krystaller er oppnådd som diffract x-stråler, kan krystallstruktur løses på nær Atom løsning5,6. Avgjørende, betingelsene til å krystallisere en roman prøve ikke kan forutses og avkastningen av høy kvalitet krystaller er vanligvis svært lav. En underliggende årsak er at mange prøver rundt utfordrende biokjemiske egenskaper, som gjør dem ustabil på tilsvarende tidsskalaen for krystallisering (vanligvis noen dager). Til slutt, prosessen er forsterket av tiden det tar å produsere prøver og prøve varianter, og å optimalisere sine rensing og krystallisering7,8.
En krystallisering tilstand er en løsning med en precipitant som reduserer eksempel løselighet vilkårene også inneholder buffere og tilsetningsstoffer. Hundrevis av slike reagenser er godt egnet for å endre parameterne for krystallisering eksperimenter som de har lav tilbøyelighet til å forstyrre eksempel integriteten (som protein eller nukleinsyre utspiller seg). Mens testing millioner av kombinasjoner av krystallisering reagensene ikke er gjennomførbart, er testing på mange screening kits - formulert med ulike strategier9,10 - mulig med miniatyriserte prøvelser og automatisert protokoller. I dette perspektivet er mest mottagelig teknikken sannsynligvis damp diffusjon med 100-200 nL dråper sitter på en liten godt over et reservoar som inneholder krystallisering tilstanden (25-250 µL), implementert i spesialiserte krystallisering plater11 , 12. de protein prøve og tilstand kombineres i en 1:1 ratio for et totalt volum på 200 nL når dråper i øvre-brønnene. Robot nanoliter protein krystallisering kan gjennomføres med alternative teknikker og plater som under olje satsvise13 og Lipidic kubikk fase14 (den siste som blir brukt spesifikt på trans-membran proteiner som er veldig dårlig løselig i vann).
Funksjonen krystallisering på MRC-LMB ble startet tidlig på 2000-tallet og en tidlig oppsummering av våre automatiserte protokollene ble presentert i 200515. En historisk innføring protein krystallisering ble presentert og også en oversikt over fordelene med robot nanoliter tilnærming (deretter en ny tilnærming til rutinemessig eksperimentering). Siden macromolecular krystallisering er i hovedsak en stokastiske prosessen med svært lite eller ingen nyttig tidligere informasjon, ansette en bred rekke (passer) første forhold øke avkastningen av kvalitet Diffraksjon krystaller16. Dessuten er en ofte oversett nytte av første storskjerm å redusere behovet for optimalisering av prøver og krystaller i mange tilfeller. Selvfølgelig kan en fortsatt må fortsette med optimalisering av noen innledende forhold senere. Vanligvis konsentrasjonen av reagenser og pH er deretter systematisk undersøkt. Flere reagenser kan også bli introdusert i optimalisert betingelsen(e) ytterligere endre parameterne for krystallisering. Sikkert, en forsøkte krystallisering med et utvalg ferskt tilberedte, derfor tilsvarende protokollene må være enkel og tilgjengelig helst.
Her to helautomatisk systemer designet på MRC-LMB (systemer 1 og 2) og tilhørende protokoller er fullstendig beskrevet. Den viktigste anvendelsen av disse to systemene er første screening av damp spredning i sittende slipp krystallisering plater. Systemet 1 integrerer en flytende handler, en automatisert carousel til lager plater, en blekkskriver for plate merking og en selvklebende plate sealer. På systemet 1 er 72 96-brønns plater fylt med kommersielt tilgjengelig screening kits (80 µL av tilstand overføres til reservoaret fra en start volumet av 10 mL i test-rør), merket og forseglet. Platene lagres i en 10 ° C inkubator der de er tilgjengelige for brukerne når som helst (som første skjermer kalt 'LMB plater').
Systemet 2 integrerer en flytende hånd, en nanoliter-dispenser og en selvklebende plate sealer. På systemet 2, sitter dråper (100-1000 nL) for damp diffusjon eksperimenter er produsert ved å kombinere betingelser og eksemplet i øvre-brønnene 20 48 - eller 96-brønnen plater forhåndsutfylt med forhold. Dette betyr 1920 første screening betingelser er trialed ved 20 LMB plater på systemet 2.
Roboter også brukes individuelt for optimalisering av valgte betingelsene og tilsvarende halvautomatisk protokollene også beskrives. De 4 hjørner metoden17 ansatt rutinemessig å produsere optimalisering skjermer. Tilsvarende protokollen først krever manuell utarbeidelse av 4 løsninger ("A, B, C og D'). To lineære graderinger av konsentrasjoner (for to viktigste krystallisering agenter) deretter genereres automatisk direkte i reservoarene av en krystallisering plate. For dette dispenses en sprøyte-baserte flytende handler 4 hjørnet løsninger på ulike forhold.
For å ytterligere tilpasse en betingelse, kan man bruke additiv skjermer som potensielt forbedrer egenskapene for resulterende krystaller18. To tilnærminger er tilgjengelige for additiv screening: en protokoll med tilsetningsstoffer utlevert i reservoarene krystallisering plater før dråper (protocol 1) og en annen protokoll der additiv skjermen er utlevert direkte på dråpene (protocol 2).
Andre nyttige utviklinger som ble igangsatt på MRC-LMB å lette automatiserte macromolecular krystallisering, er også presentert. I hovedsak minimerer krystallisering plater og tilknyttede enheter som en stables samfunn av Biomolecular Screening (SBS) lokk som fordampning betingelsene ved systemet 2.
For enkelhets antas det at brukerne er kjent med de grunnleggende funksjonene og vedlikehold av nanoliter dispenser, inkjet-skriver og lim plate sealer. Ikke annet er angitt, plater på dekket av roboter er plassert slik at godt A1 ('A1-hjørne") er mot baksiden venstre hjørnet av en plate carrier.
Protocol
1. to helautomatisk systemer (første screening)
-
System 1: Forberedelse av 72 96-brønns krystallisering plater fylt med screening kits (LMB plater)
- Før du utfører prosedyren, sikre at systemets roboter er initialisert og deres kontrollerende programvare er åpen. Aktivere chiller av rør-nedkjøling transportør ca 30 minutter før den viktigste programmet startes.
- Plass en test plate på motorisert SBS bærer av platen sealer. Kjøre platen sealer og sjekk at filmen er riktig anvendt. Gjenta denne testen to ganger mer for å kontrollere at platen sealer er klar.
- Deretter legge til 20 L deionisert vann viktigste beholderen til den flytende handler. Koble kopling skivene fra den liten beholderen (20% etanol skylling løsning) og koble skivene viktigste beholderen.
- Angi passende navnet (tabell 1) på inkjet-skriver berøringsskjermen. Deretter åpner og lukker karusellen døren for å utløse karusellen rotasjon. Åpne døren når første stabelen presenterer seg.
- Fullt laste første bunken med 22 krystallisering plater, hver med kolonne 1 vendt ut. Fullt laste neste to stabler på samme måte.
- Legg resterende 6 platene i de høyeste stillingene i fjerde stabelen. Lukk deretter døren karusellen.
- Kontroller at det chiller viser 14 ° C. Forsiktig og gjentatte ganger invertere det merkede screening kits i 1 minutt. Deretter åpne frontpanelet på flytende behandleren.
- Åpne rør og plassere dem i kjøling transportøren ifølge 96-brønns standardoppsettet (A1, A2, etc.). Ved å plassere hver rør i transportøren, plassere sin lokket på et brett i oppsettet for samme 96-brønnen.
- Kryssjekke røret posisjoner og sikre at alle rør nivå og slo seg ned i holderen. Lukk frontpanelet.
- I vinduet "Oppstart" av flytende handler programvare Velg "Kjør vedlikehold" og åpne programmet rødme. Kjør programmet å spyle 20% etanol fra systemet og vaske outsides væske-dispensing tips.
- Når tømming er fullført, klikk 'Avbryt' Hvis du vil gå tilbake til "Oppstart". Velg "Kjør en eksisterende prosess" og klikk "Start valget". Åpne programmet 'MRC kit dispensing'. Fyll ut '18' for 'tilfeller"konfigurasjonen skjermen og kjøre programmet.
- Overvåke systemet som første fire platene er merket, fylt, og forseglet.
- Når alle 72 platene er utarbeidet og tilbake i karusellen, bytte kopling skivene fra beholderen viktigste liten beholderen. Kjøre programmet "Starte opp flush" (se trinn 1.1.10).
- Slå av kjøleren og forkaste tomme screening kit rør. Fjern forsiktig 72 forberedt platene fra karusellen. Forkast fylt med feil eller dårlig-forseglet plater. Lagre klar-å-bruke platene på 10 ° C.
-
System 2: definere krystallisering dråper (100 nL protein + 100 nL tilstand) fra et enkelt eksempel på 20 LMB plater
- Forsikre at systemets roboter er på nanoliter dispenser initialiseres med programvaren åpent og det flytende hånd metoden manager er åpen. Slå på microtube-kjøling carrier cirka 15 minutter før den viktigste programmet startes.
- Plass en test plate på motorisert SBS bærer av platen sealer. Kjøre platen sealer og kontroller at platen er ordentlig lukket. Teste platen sealer tre ganger.
- Deretter Kjør nanoliter dispenser angir 100-nL dråper av test løsning i en test-plate. Sjekk under et mikroskop at dråpene er angitt riktig. Lukk nanoliter dispenser programvaren og fjerne strip-holderen blokken fra kortstokken.
- Deretter inn i spesialdesignede plate holderen (se Representant resultater: krystallisering enheter utviklet ved LMB) LMB platen med høyeste relative antall flyktige reagenser i vilkårene (tabell 1). Fjerne lim fra platen.
- Åpne frontpanelet flytende handler og utette platen på dekk, bak første skyve transportør (skyve bærere kan trekkes ut for enkel tilgang).
- Dekk platen med en SBS aluminium lokket. Utligne lokket mot bakre venstre hjørne av transportøren ved å bruke lett trykk mot motsatt hjørne av lokket.
- Fjerne forseglingen laste inn skyve bærere og dekke gjenværende 19 platene i samme måte, arbeider fra mest til minst flyktige forhold. Når microtube-kjøling transportøren er 4 ° C, som indikert av et grønt lys, fjerne coveret.
- Klipp av lokket av en microtube som inneholder (minst) 440 µL av protein utvalg (tabell 2). Kontroller at utvalget har ingen skum over meniscus, som dette vil forstyrre væske oppdagelsen system. Sett røret i posisjon 1 av microtube-nedkjøling transportør.
- Plass en PCR-plate på flytende handler dekk foran plate bevegelse kortet bærer. Lukk frontpanelet.
- Etter lasting dekk, sikre at nanoliter dispenser dekk er tomt for stripe-holderen blokken og at bærere bak 50-µL tips stabler er klar av aluminium SBS lokkene.
- Flytende handler "metoden" administrasjonsgrensesnitt, velg 'Setup plater'. Overvåke initialiseringen av begge systemene og fylle inn løpe parameterne. Følg retningslinjene i metoden administrasjonsgrensesnitt (ledetekster, tall og et tips-management system hjelp med forberedelse).
- Kontroller at alle nødvendige komponenter er klar, og deretter starte prosessen.
- Overvåke systemet som nanoliter dispenser angir dråper i første plate og plate sealer senere tetter platen.
- Når alle 20 platene er forberedt med krystallisering dråper og automatisk tilbake til skyve bærere, åpne frontpanelet og Fjern platene. Kontroller at platene er riktig forseglet før lagre dem for krystallisering.
- Rengjør SBS lokkene med en 20% etanol løsning før stable dem på venstre side av flytende håndteringsfunksjonen for lagring. Kast PCR platen og microtube.
- Slå av microtube-kjøling bærer og tørke kondens. La et papirhåndkle på kjøligere overflaten å absorbere ytterligere kondens. Deretter erstatte carrier dekselet og lukke frontpanelet.
2. optimalisering av vilkårene
-
Sprøyte-baserte flytende handler: produsere to lineære graderinger av konsentrasjoner i reservoarer av en krystallisering plate (4-hjørnet-metoden).
- Forsikre at flytende behandleren er på og initialisert med programvaren åpen.
- På "GRADIENT" kategorien: åpne programmet nødvendig, Velg hvilken krystallisering plate og det siste bindet i reservoarene (tabell 3). Avansert innstillingen for 'max skutt vol' bør reduseres fra 6000 til 3000 ved løsninger som inneholder [isopropanol] > 10% v/v og [MPD] > 20% v / v.
- Forberede sprøyter. Plasser et stempel i hver sprøyten (spisse ender ned) og inn på baksiden av sprøyter utpekte grooves under roboten hodet. Tvinn sprøyte klokkeretning for å låse det i posisjon (programmet starter bare med alle nødvendige sprøyter festet).
- Forberede daler. Ta rustfritt stål rammen og sett på trau. De 4 posisjonene til venstre tilsvarer de 4 hjørnene A, B, C, D. bytte til "Satt opp"-kategorien som viser volum av lobbyer i hver sprøyten (på tabell 30,5 mL døde volumet ble lagt til volumene vises). Hell hjørne løsningene i deres respektive daler og plasser rammen tilbake på dekk (rammen holder i posisjon med 2 små magneter ligger foran dekk). En alternativ måte å fortsette med dette er å helle løsninger til trau når de plasseres allerede på dekket.
- Sted krystallisering plate motorisert SBS transportøren.
- Klikk "Sug opp" og vent for dette trinnet fullføres (når stempler stoppet på vei opp).
- Bytt til kategorien "Kjør" og kjører programmet.
- Ved ferdigstillelse av programmet, gå tilbake til kategorien Oppsett og klikk "Fjern": systemet tømmer sprøyter fra leftover løsninger, og deretter heiser stempler oppover. 'Tøm' kan kreves i stedet for 'Fjern', dette vil forlate stempler nederst posisjon, klar inneholder flere løsninger med samme sprøyter.
- Fjerne sprøyter ved å vri dem mot klokken.
- Forkaste sprøyter og trau i den aktuelle hyllen (eller skyll med deionisert vann og 20% v/v etanol løsning for gjenbruk).
- Seal platen og plassere den på microplate blandebatteri for 3 min på 1000 rpm eller 10 min da tankeren løsninger er blandes. Platen er klar for å sette opp krystallisering dråper på nanoliter dispenser.
-
Additiv screening protokoll 1 (sette opp krystallisering dråper i en 96-brønns krystallisering plate forhåndsutfylt med additiv skjermen)
- Først forberede tilstanden med første konsentrasjoner av reagenser økte med 10% (min. vol. 15 mL ved overføring tilstanden fra en beholder på additiv skjermen med det flytende hånd).
- Kontroller at den flytende behandleren er klare til bruk. Åpne programmet 'Legg til skjermen til tilsetningsstoffer' for en enkelt plate (Angi volum i reservoarene: '72 µL'). Spørsmål, figurer og en tips-management system (12 x 1000 µL tips kreves) hjelp med roboten er klar å operere i henhold til valgene.
- Hente additiv skjermen settefiskanlegg 20 ° C og fjerne dens aluminium segl umiddelbart (bruk plate holderen), og Plasser platen på dekket av flytende behandleren. Programmet opererer etter en stående oppsett (platen plasseres med A1-hjørnet ligger foran til venstre av transportøren). Også plassere også beholderen fylt med tilstanden. Kjør programmet.
- Når reservoarene av plate har blitt fylt, plasserer den på microplate shaker og kjøre programmet. Skyll av tilstand med deionisert vann og 20% etanol for gjenbruk.
- Sette opp dråpene på nanoliter dispenser. Først fjerne forseglingen krystallisering plate (bruk plate abonnenten). Deretter sted platen og 8-og protein stripe i første posisjon av strip-holderen blokken. 'Setup' kategorien kontrollere programvare viser faktiske plasseringen av hver komponent på dekk. Laste hver godt av stripe med protein prøve avhengig slipp kreves (Tabell 4). Kjøre programmet å forberede dråper.
- Ved ferdigstillelse av programmet, Fjern platen fra kortstokken og forsegle den umiddelbart (bruk plate sealer, 3-tommen bred teip). Kast stripe i den aktuelle hyllen.
- Vurdere størrelse, form, og sentrering av dråper under mikroskopet før lagring.
-
Additiv screening protokoll 2 (sette opp krystallisering dråper i en 96-brønns krystallisering plate med gjenbrukbare additiv skjerm)
- Først forberede skjermbildet additiv: La tilsvarende frosne 96-brønns celle kultur plate å tine ved romtemperatur for 40 min. Deretter sentrifuge additiv skjermen 1000 x g i 2 minutter.
- Forberede betingelsen (min. vol. 15 mL ved overføring tilstanden fra en beholder på additiv skjermen med det flytende hånd).
- Fyll reservoarene av en 96-brønns krystallisering plate med tilstanden. Væske-handler, fortsette på samme måte som protokoll 1, trinn 2.2.2, men angi "80 µL" for volumet i reservoarer.
- Definere dråper på nanoliter dispenser med 3 komponenter på dekk (plate som inneholder skjermbildet additiv krystallisering platen og 8-og protein stripe i første posisjon av strip-holderen blokken, Tabell 4).
- Seal celle kultur plate inneholder skjermen med en aluminium ark og sett den tilbake i inkubator 20 ° C.
- Vurdere størrelse, form, og sentrering av dråper under mikroskopet før lagring.
Representative Results
1. system 1 og LMB plater
Figur 1A viser systemet 1 basert på en flytende handler med en flytende-systemet (avionisert vann). Væske-systemet består av en beholder, en pumpe, slange, 8 sprøyter ventiler og 8 fast tips. Flytende klasse innstillingene var optimalisert for å leveringstanken/dispensere et bredt spekter av løsninger og multi-dispensere til 4 plater (multi-dispensere krever en relativt stor overskudd av aspirerede volum). En 22 L vann beholder og en mindre beholder (5 L) med 20% v/v etanol lagres under systemet å mate væske-systemet. Hver beholder er utstyrt med to kobling setter inn. En setter inn (farget blå) feeder systemet med væske, den andre (rød) er en flyt tilbake å redusere høyt trykk. Etter bruk hindrer spyle med vann og deretter 20% v/v etanol løsningen mikrobiell vekst. En kjøling enhet (også plassert under systemet) er koblet til en spesialbygd tube-nedkjøling transportør. 1 er 2050 mm bred, inkludert karusellen, 760 mm dyp og 88 mm høy. Det kreves en ekstra 550 mm i front for skrivebordet som inneholder kontrollenheten inkjet-skriver og lim plate sealer. Ekstra plass kreves også ved siden av systemet for kontroll PC. Programmet å produsere 72 forhåndsutfylte plater (dvs. 18 runder av 4 plater) tar 3 h og 50 minutter.
Figur 1B er et nærbilde av hoveddekk som er utstyrt med 8 fast tips (figur 1 c) montert på en automatiserte pipettering arm, en andre arm med en gripper, en tips vask stasjon, 2 x 4-posisjon bærere for SBS plater og rør-kjøling transportøren. Hovedprogrammet behandler 4 plater samtidig tatt automatisk fra karusellen og plassert på dekk hvor de er fylt med krystallisering forhold (80 µL i reservoarer figur 1 d). Flytende nivåer registreres automatisk som tipsene er ledende. Mens den flytende handler dispenses forhold i et sett av plater, er et annet sett med tomme plater tatt ut av karusellen, merket og plassert på hoveddekk. En liten spesialbygde holder og i baksiden av flytende behandlingen ble pålagt å plassere skriveren hodet og sensoren bak på hoveddekk. 8 tips er tømt og vasket med vann fra den viktigste beholderen etter hvert dispensering trinn som består av 4 dele i kolonnene tilsvarende reservoarer. Etter 4 plater er fylt, er de automatisk forseglet og tilbake i utgangsposisjonen i karusellen. Plate sealer utløses av en bestemt driver (kalt av kontrollere programvare). Sealer bruker en rull med 3-tommen bred selvklebende tape som brukes på en plate med valser mekanisk presset. Ved ferdigstillelse av programmet, forhåndsutfylt platene fjernes manuelt fra karusellen stabler og lagret i en 10 ° C inkubator ligger anlegget.
Figur 1 : Fylle reservoarene med første screening kits. (A) oversikt av helautomatisk system 1. Det ligger i en godt laget klar akryl ark på høyre side hoveddekk karusellen er en egen automatisert enhet med plate stabler. (B) hoveddekk til den flytende handler i drift med (en) rør-kjøling transportøren (koblet til en skremmende enhet under, ikke vist), (b) raskt vaske stasjon (koblet til drenering, ikke vist), (c) pipettering armen fylle 8 reservoarer av en 96-brønns krystallisering plate, (d) gripper armen bringe en fylt plate på (e) motorisert SBS bærer av platen sealer. Bak dekk er (f) utskrift leder av inkjet-skriver koblet til (g) inkjet kontrollenheten under fangstskuta. (C) en merket platen (navnet på skjermen) og dato for produksjon fylles med krystallisering forhold av 8 ledende fast tips Polytetrafluoroethylene-belagt rustfritt stål. (D) tverrsnitt av en forseglet krystallisering godt. Reservoaret inneholder 80 µL av krystallisering tilstand (mens øvre også er tomt). Reservoaret og øvre-og dybde spesifikasjoner er i millimeter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1 viser de forskjellige formuleringene for kommersielt tilgjengelig screening kits i test-rør. Prosjektpakkene brukes til å fylle reservoarene 96-brønns krystallisering plater (LMB01-LMB22) regelmessig med system 1.
| Platen navn | Kit navn | leverandør | katalognummer | rør | grunnleggende beskrivelse | ||
| LMB01 | Krystallklar skjermen 1 | Hampton forskning | HR2-110 | 48 | Spredt matrise (pH 4.6 8.5) | ||
| Krystallklar skjermen 2 | Hampton forskning | HR2-112 | 48 | Stokastisk prøvetaking (pH 4.6-9.0) | |||
| LMB02 | Veiviseren 1 | Rigaku | 1009530 | 48 | Stokastisk prøvetaking (pH 4.5-10.5) | ||
| Veiviseren 2 | Rigaku | 1009531 | 48 | Stokastisk prøvetaking (pH 4.5-10.5) | |||
| LMB03 | Rutenettet skjermen Ammonium Sulfate | Hampton forskning | HR2-211 | 24 | Rutenettet skjermen, [AmS] = 0,8-3.2 M og buffere pH 4.0-9.0 | ||
| Rutenettet skjermen PEG/LiCl | Hampton forskning | HR2-217 | 24 | Rutenettet skjermen, [pinne 6000] = 0-30 %w/v, conc. LiCl = 1,0 M og buffere pH 4.0-9.0 | |||
| Rask skjerm | Hampton forskning | HR2-221 | 24 | Rutenettet skjermen, [NaKPO4] = 0,8-1,8 M ved pH 5.0-8.2 | |||
| Rutenettet skjermen natriumklorid | Hampton forskning | HR2-219 | 24 | Rutenettet skjermen, [NaCl] = 1.0-4.0 M og buffere pH 4.0-9.0 | |||
| LMB04 | Rutenettet skjermen pinne 6000 | Hampton forskning | HR2-213 | 24 | Rutenettet skjermen, [pinne 6000] = 5-30 %w/v og buffere pH 4.0-9.0 | ||
| Rutenettet skjermen MPD | Hampton forskning | HR2-215 | 24 | Rutenettet skjermen [MPD] = 10-65 %w/v og buffere pH 4.0-9.0 | |||
| MemFac | Hampton forskning | HR2-114 | 48 | Spredt matrise for membran proteiner (pH 4.6 8.5) | |||
| LMB05 | PEG-Ion | Hampton forskning | HR2-126 | 48 | Rutenettet skjermen, [pinne 3350] = 20 %w/v og ulike salter på 0,2 M (ingen buffere) | ||
| Natrix | Hampton forskning | HR2-116 | 48 | Ufullstendig fakultet (pH 5.6 8.5) | |||
| LMB06 | Krystallklar skjermen Lite | Hampton forskning | HR2-128 | 48 | Crystal skjermen 1 med halvparten av de opprinnelige precipitant konsentrasjonene | ||
| Egendefinerte Lite skjermen | Molekylær dimensjoner | i/t | 48 | Tilleggsbetingelser med precipitant Lavinnblanding | |||
| LMB07 | Veiviseren Cryo 1 | Rigaku | 1009536 | 48 | Stokastisk prøvetaking med forhold cryoprotected med lav MW plugger (pH 4.5-9.4) | ||
| Veiviseren Cryo 2 | Rigaku | 1009537 | 48 | Stokastisk prøvetaking med forhold cryoprotected med lav MW plugger (pH 4.5-10.1) | |||
| LMB08 | JBS1 | JenaBioScience | CS - 101L | 24 | Ufullstendig fakultet basert på ulike plugger (pH 4.6-9.0) | ||
| JBS2 | JenaBioScience | CS - 102L | 24 | Ufullstendig fakultet basert på pinne 4000 (pH 4.6 8.5) | |||
| JBS3 | JenaBioScience | CS - 103L | 24 | Ufullstendig fakultet basert på pinne 4000 (pH 4.6 8.5) | |||
| JBS4 | JenaBioScience | CS - 104L | 24 | Ufullstendig fakultet basert på middels MW plugger (pH 6,5 8.5) | |||
| LMB09 | JBS5 | JenaBioScience | CS - 105L | 24 | Ufullstendig fakultet basert på tunge MW plugger (pH 6,5-9,5) | ||
| JBS6 | JenaBioScience | CS - 106L | 24 | Ufullstendig fakultet basert på AmS (pH 4.6 8.5) | |||
| JBS7 | JenaBioScience | CS - 107L | 24 | Ufullstendig fakultet basert på MPD (pH 4.6 8.5) | |||
| JBS8 | JenaBioScience | CS - 108L | 24 | Ufullstendig fakultet basert på MPD og etanol (pH 4.6 8.5) | |||
| LMB10 | JBS9 | JenaBioScience | CS - 109L | 24 | Ufullstendig fakultet basert på felles salter og 2-propanol (pH 4.6 8.5) | ||
| JBS10 | JenaBioScience | CS - 110L | 24 | Ufullstendig fakultet basert på felles salter (pH 4.6 8.5) | |||
| Fjern strategi skjermen 1 pH 4.5 | Molekylær dimensjoner | MD1-16LMB | 24 | Rutenettet skjermen med ulike plugger | |||
| Fjern strategi skjermen 1 pH 5.5 | Molekylær dimensjoner | MD1-16LMB | 24 | Rutenettet skjermen med ulike plugger | |||
| LMB11 | Fjern strategi skjermen 1 pH 6,5 | Molekylær dimensjoner | MD1-16LMB | 24 | Rutenettet skjermen med ulike plugger | ||
| Fjern strategi skjermen 1 pH 7.5 | Molekylær dimensjoner | MD1-16LMB | 24 | Rutenettet skjermen med ulike plugger | |||
| Fjern strategi skjermen 1 pH 8.5 | Molekylær dimensjoner | MD1-16LMB | 24 | Rutenettet skjermen med ulike plugger | |||
| Fjern strategi skjerm 2 pH 4.5 | Molekylær dimensjoner | MD1-16LMB | 24 | Rutenettet skjermen med ulike plugger | |||
| LMB12 | Fjern strategi skjerm 2 pH 5.5 | Molekylær dimensjoner | MD1-16LMB | 24 | Rutenettet skjermen med ulike plugger | ||
| Fjern strategi skjerm 2 pH 6,5 | Molekylær dimensjoner | MD1-16LMB | 24 | Rutenettet skjermen med ulike plugger | |||
| Fjern strategi skjerm 2 pH 7.5 | Molekylær dimensjoner | MD1-16LMB | 24 | Rutenettet skjermen med ulike plugger | |||
| Fjern strategi skjerm 2 pH 8.5 | Molekylær dimensjoner | MD1-16LMB | 24 | Rutenettet skjermen med ulike plugger | |||
| LMB13 | Indeks | Hampton forskning | HR2-144 | 96 | Små spredt matrise og grid skjermer (pH 3.0-9.0) | ||
| LMB14 | SaltRX 1 | Hampton forskning | HR2-107 | 48 | Rutenettet skjermen inkludert 22 unike salter versus saltkonsentrasjon og pH (4.1-9.0) | ||
| SaltRX 2 | Hampton forskning | HR2-109 | 48 | Rutenettet skjermen inkludert 22 unike salter versus saltkonsentrasjon og pH (4.1-9.0) | |||
| LMB15 | MemStart | Molekylær dimensjoner | MD1-21 | 48 | Spredt matrise for membran proteiner (pH 4.0-10.0) | ||
| MemSys | Molekylær dimensjoner | MD1-25 | 48 | Rutenettet skjerm for membran proteiner (hovedsakelig knagger, pH 3,5-9,5) | |||
| LMB16 | JCSG + | Qiagen | 130720 | 96 | Spredt matrise (pH 4.0-10.0) | ||
| LMB17 | MORPHEUS skjermen | Molekylær dimensjoner | MD1-46 | 96 | Rutenettet skjermen inkludert kombinasjoner av tilsetningsstoffer og cryoprotected betingelser (pH 6,5 8.5) | ||
| LMB18 | PI minimal skjermen | JenaBioScience | CS-127 | 96 | Ufullstendig fakultet (pH 4.0-9,5) | ||
| LMB19 | PI-pinne skjermen | JenaBioScience | CS-128 | 96 | Ufullstendig fakultet for membran proteiner (pH 4.8-8,8) | ||
| LMB20 | MORPHEUS II-skjermen | Molekylær dimensjoner | MD1-91 | 96 | Rutenettet skjermen inkludert blander tilsetningsstoffer (tunge atomer) og cryoprotected betingelser (pH 6,5 8.5) | ||
| LMB21 | LMB krystallisering skjermen | Molekylær dimensjoner | MD1-98 | 96 | Spredt matrise herunder valgt fra LMB publikasjoner | ||
| LMB22 | MORPHEUS III skjermen | Molekylær dimensjoner | i/t | 96 | Rutenettet skjermen inkludert blander tilsetningsstoffer (narkotika forbindelser) og cryoprotected betingelser (pH 6,5 8.5) | ||
Tabell 1: formuleringer av kits funnet i LMB platene. Hver kommersielle screening utstyr består av 24/48/96 først i test-rør. LMB platene lagerføres i 10 ° C inkubatorer ligger anlegget der de er tilgjengelige for brukerne når som helst.
2. system 2 og krav for å sette opp dråper
Figur 2A viser systemet 2 basert på en flytende handler19 med åpning og fjerning tips. Disponibel tips leveres i stables rack egnet for automatisert håndtering. En 3-posisjon dekk nanoliter dispenser20 ble integrert på høyre side av systemet. Leveringstanken/dispensere på nanoliter dispenser driver også med positiv forskyvning bruker disponibel microsyringes (følger i store spoler). Som en frittstående robot brukes en flyttbar strip-holderen blokk laste protein prøven (e). For helautomatisk prosessen erstatter en 384-vel PCR plate strip-holderen. En lignende lim plate sealer til systemet 1 ble integrert på venstre side. Den sealer og nanoliter dispenser stå på spesialbygde, hevet arbeidsbord i rekkefølge for viktigste gripper å nå de plate bærere av disse to integrerte roboter (et vindu måtte skjæres i begge sidepanelene til den flytende handler for gripper tilgang utenfor hoveddekk). Hovedprogrammet kaller driverne utløser nanoliter dispensering programmer og sealer i rett tid. Systemet 2 er 2850 mm bred, 800 mm dyp og 800 mm høy. Ekstra plass kreves ved roboten for visning av kontrollere PC. To søppelkasser ligger under systemet for tips og microsyringes tapt under prosessen (kontrollerende PC er også lagret under). En viktig egenskap av 2 er det samlede layouten, som beholder lett tilgang til de tre robotene slik at de kan brukes individuelt for optimalisering protokollene beskrevet tidligere, eller andre protokoller som beskrevet andre steder som krystallisering screening22membran proteiner i lipidic mesophases21 og tilfeldig microseed matrise.
Figur 2B er et nærbilde av dekk som er utstyrt med en enkel robotarm. Armen integrerer 12 uavhengig pipettering sonder og viktigste gripper. Plasseringen av sonder kan kontrolleres individuelt i én retning for å få tilgang steder langs aksen mellom sonder eller med enkelt rør. Sonder kan plukke opp disponibel tips (1-12) eller et par plate bevegelse adaptere. To sett med 4 stabler som inneholder 50 µL disponibel tips lastes først. Flytende nivåer registreres automatisk som tipsene er ledende. Plate bevegelse adaptere er utformet med 2 skarpe pinnene på innsiden som en valgfri gripper ved behov. På hoveddekk ligger en 24-posisjon microtube nedkjøling transportør for prøven, selv om bare 1-2 stillinger er brukt her. I tillegg finnes en operatør for PCR plate og også 2 lagring stativer for stables, spesialbygde SBS lokk (figur 2C). Endelig er det 4 skyve operatører, hver med 5 steder for krystallisering plater (4 x 5 = 20 plater).
Figur 2 : Definere dråper for damp diffusjon eksperimenter. (A) oversikt over helautomatisk systemet 2. (B) hoveddekk til den flytende handler i drift med (en) lagring bærere stabler av SBS lokk, (b) de stables tips, (c) kjøling-bærer med en prøve i microtube, (d) operatør for 2 plate bevegelse adaptere, (e) PCR platen for å overføre protein til nanoliter håndtering roboten, (f) 9 forseglet plater som er plassert i deres opprinnelige posisjoner, (g) valgfritt gripper fjerne SBS lokket av de 10th plate om transporteres på dekket av flytende behandlingsprogrammet, (h) de neste 10 plater være forberedt med SBS lokk på toppen, (jeg) viktigste gripper som brukes til å transportere PCR og krystallisering platene, (j) viktigste automatisert armen integrere 12 pipettering sonder (2 brukes som valgfritt gripper) og viktigste gripper og (k) dekket av nanoliter dispenser. (C) In-house tilpasset SBS lokk laget av aluminium. Lokkene integrere et gummiark å unngå fordampning betingelsene og to små hull skal nøyaktig plukket opp av valgfrie gripper. (D) tverrsnitt av en forseglet krystallisering godt der reservoaret er fylt med en tilstand og øvre-brønnen inneholder et slippverktøy sammensatt fra protein prøven og tilstanden. Fordi precipitant i slippverktøyet er mindre konsentrert enn tilstanden, vann konsentrasjonen av alle komponentene i rullegardinlisten stige gjennom tap under prosessen med balanse av damp diffusjon (veldig skjematisk representert av en pil). (E) lys micrographs 100 nL og (F) 200 nL dråper produsert av nanoliter dispenser med en test løsning (20% v/v polyetylenglykol 400, 0,001% w/v Safranin som rød farge). Størrelsen og formen på dråpene varierer avhengig chemicophysical egenskaper av tilstanden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Hovedprogrammet starter med valgfri gripper fjerne SBS lokket fra første krystallisering plate. Når lokket ble overført til den tilsvarende lagring leverandøren, transporteres krystallisering platen til dekket av nanoliter dispenser. Pipettering armen overføres mengden sample kreves for definere dråper fra normalt kjølt microtube til den første kolonnen av PCR plate. Deretter viktigste gripper flytter PCR platen på dekket av nanoliter dispenser som vil forberede dråpene følgende alternativene valgt av brukeren i starten (f.eks. dråpestørrelse). For dette, protein prøven er først utlevert i øvre-brønner (med ett sett med 8 microsyringes og multi-dispensing) og krystallisering forholdene er utlevert på protein dråper (hver rad nå krever 8 nye microsyringes å unngå kryss-kontaminering). Ved ferdigstillelse av programmet til å definere dråper, viktigste gripper transporterer tilsvarende platen til platen sealer, og deretter plasserer PCR platen tilbake i utgangsstillingen (mer protein bli dispensed i den neste kolonnen av PCR plate for følgende plate ). Til slutt, forseglet krystallisering platen er flyttet tilbake til sin opprinnelige posisjon på dekk: damp diffusjon eksperimenter har allerede startet i denne platen (figur 2D). Denne syklusen gjentas av antall plater. Når nødvendig, fjerner valgfri gripper et tomt tips rack tillater pipettering armen til flere tips. Programmet tar 2 hr og 20 min og 440 µL av prøve å forberede enkelt dråper i 20 plater med 100 nL eksempel + 100 nL tilstand (figur 2E og 2F).
Når du bruker nanoliter dispenser som frittstående robot for to ekstra plater (se trinn 1.2.3-protokollen), hele settet med første screening plater tilgjengelig i 10 ° C inkubator kan defineres (22 LMB plater x 96 forhold = 2,112 forhold).
Tabell 2 viser kravene til hovedprogrammet ifølge brukervalg på systemet 2.
| Plater | Slipp størrelse (nL) | Prøven (e) | Tips krav | Varighet | |||
| Nummer | Type | Vol. 1 (µL) | Vol. 2 (µL) | 50 µL tips | Microsyringes | ||
| 10 | 96-brønnen | 100 | 240 | 0 | 80 | 1040 | 1 h 12 min |
| 20 | 96-brønnen | 100 | 440 | 0 | 160 | 2080 | 2 h 20 min |
| 10 | 96-brønnen | 100 | 240 | 240 | 160 | 2080 | 1t 45 min |
| 20 | 96-brønnen | 100 | 440 | 440 | 320 | 4160 | 3 h 05 min |
| 10 | 48-brønn | 1000 | 624 | 0 | 80 | 560 | 1 h 10 min |
| 20 | 48-brønn | 1000 | 1208 | 0 | 160 | 1120 | 2 h 16 min |
Tabell 2: eksempler på hovedprogrammet alternativer tilgjengelig på systemet 2 konfigurere krystallisering dråper. Den nødvendige mengden av protein utvalg, tips og microsyringes varierer etter programmet. Volumene av prøve ' vol. 1' (slipp 1) og "vol. 2' (slipp 2) beregnes som følger: (8 tips x kreves volum per brønn PCR plate + 4 µL tapt volum) x antall krystallisering Tallerkner + 40 µL døde volum i microtube. Et bestemt volum per brønn PCR plate for 100 nL dråper i 96-brønnen krystallisering plate er 2 µL mens 6.8 µL kreves for 1000 nL dråper i en 48-vel plate (død volum i brønner av PCR plate: 0,8 µL). En ekstra volum på prøve er tatt hensyn ("tapte volum") på grunn av fordamping av microtube og andre tap (f.eks eksempel stikker på tips). For eksempel for 20 MRC plater, 100 nL, 1 dråpe protokollen, volumet av eksempel kreves er: (8 x 2 + 4) x 20 + 40 = 440 µL (dvs., tilsvarende 22 µL per plate). Åtte disponibel 50 µL tips kreves for hver plate og hvert utvalg. For eksempel for 10 plater, 2-slipp protokollen, antall tips kreves er 8 x 10 x 2 = 160 tips. Antall microsyringes beregnes som følger: (8 + antall betingelser per plate) x antall prøver x antall plater. For eksempel 10 x 48-vel plater, antall flytende behandling tips kreves er: (8 + 48) x 1 x 10 = 560 tips.
3. formulering, forberedelse og håndtering av de 4 hjørner løsningene
Begge formuleringer av 4 hjørnet løsninger ("A, B, C og D') og tilsvarende optimalisering skjermen (figur 3A) er automatisk generert av et Excel-regneark. Det er forskjellige regneark for forskjellig antall betingelser-i hovedsak 24, 48 og 96 betingelser- og også regneark å forberede to annerledes optimering skjermer i en enkelt plate. En typisk forbereder et sett på 4 x 10 mL hjørne løsninger i test-rør fra 2 – 3 optimalisering skjermer kan tilberedes, avhengig av antallet og volumet av vilkår som kreves. Løsningene er strømmet inn trau som de pustende av en sprøyte-baserte flytende behandling og senere utlevert direkte inn plater (figur 3B). De to lineære graderingene av konsentrasjoner skyldes blande A, B, C og D på systematisk varierende forhold (Figur 3 c).
Figur 3: 4-hjørnet metoden for å forberede optimalisering skjermer. (A) representasjon av to graderingene for over en 96-brønns plate layout. (B) av sprøyte-baserte flytende protokollbehandler klar til å klargjøre en skjerm med 4 sprøyter inn hodet av roboten. En krystallisering plate sitter i motorisert SBS bærer og 4 starter løsninger (A, B, C og D) har allerede blitt utlevert til deres respektive trau (løsningene har vært rød for demonstrasjon hensikt bare). (C) prosenter av løsninger A, B, C og D over 96 reservoarer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 3 viser kravene for programmene tilgjengelig for brukere på sprøyten-basert væske-behandleren.
| Skivetype | nei. betingelsene | Vol. i plate (reservoarene, µL) | Vol. i trough (mL) | Varighet |
| 96-brønnen | 48 | 80 | 1.6 | 2 min 5 sek |
| 96-brønnen | 96 | 80 | 2.5 | 3 min 50 sekunder |
| 96-brønnen | 2 x 48 | 80 | 1.6 | 2 min 50 sekunder |
| 48-brønn | 24 | 200 | 1.8 | 2 min 25 sekunder |
| 48-brønn | 48 | 200 | 3 | 4 min 20 sek |
Tabell 3: programmer tilgjengelig på sprøyten-baserte flytende håndteringsfunksjonen for forbereder optimalisering skjermer etter 4 hjørner metoden. 96-brønns platen kan brukes til å forberede 96 - eller 48-tilstand optimalisering skjermen (når 48-tilstand skjermene tilberedes samtidig, robot må være utstyrt med 8 sprøyter og 8 trau). Andre programmer aktivere 48-og plater. De oppført i daler inkluderer et bestemt døde volum (0,5 mL).
4. additiv screening
Figur 4 viser fremgangsmåten for å utføre en additiv screening starter enten med 96 additiv løsninger allerede i reservoarene av krystallisering plate (protocol 1) eller i brønnene på en lav profil celle kultur plate som en gjenbrukbare additiv skjermen ( Protocol 2). Tabell 4 viser programmer tilgjengelig på nanoliter dispenser etter de to typene protokoller.
Figur 4: to typer protokoller for additiv screening. 96-additiv skjermbildene lagres på 20 ° C. Etter protokollen 1, additiv skjermen legges først i vannmagasinene av krystallisering platene (og ideelt lager denne måten). En flytende hånd eller multipipette brukes til å dispensere tilstanden i reservoarer som inneholder tilsetningsstoff løsninger (volumet av additiv skjermen representerer 10% av det siste bindet i reservoarene: 8 µL for 80 µL siste volum). Etter miksing forholdene i en microplate blandebatteri (vises ikke), brukes microsyringe-baserte nanoliter dispenser til å definere dråper (Tabell 4). Etter protokollen 2 legges bare senere additiv skjermen stund innfatning opp krystallisering dråper. Denne gangen nanoliter dispenseren er ansatt å forberede dråper med en tilleggskomponent på dekket (den gjenbrukbare celle kultur platen inneholder additiv skjermen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Protokollen | Slipp størrelse (nL) | Stripe typen | Eksempel vol. (µL) | nei. av microsyringes | Varighet | ||||
| Type | Kilde av tilsetningsstoffer | Protein | Tilstand | Tilsetningsstoff | I hver brønn (strip) | Totalt | |||
| 1 | 96-brønns krystallisering plate | 100 | 100 | 0 | 2 ΜL | 2 | 16 | 104 | 2 min |
| 1 | 96-brønns krystallisering plate | 200 | 200 | 0 | 5 ΜL | 3.8 | 31 | 104 | 2min 10 sek |
| 2 | 96-brønns celle kultur plate | 200 | 200 | 100 | 5 ΜL | 3.8 | 31 | 200 | 3min 45 sekunder |
| 2 | 96-brønns celle kultur plate | 500 | 500 | 100 | 5 ΜL | 7.4 | 60 | 200 | 4min 15 sekunder |
Tabell 4: programmer tilgjengelig på microsyringe-baserte nanoliter dispenser for additiv screening. Nødvendig volumet på prøve i hver brønn 8-vel Strip beregnes slik: død volume + 12 x slipp størrelse. Det er 2 typer av strimler (2 µL og 5 µL). Død volumene er 0,8 µL av 2 µL brønner (som kan faktisk inneholder 3,2 µL maks) og 1,4 µL 5 µL brønner (7,5 µL maks.). Det totale volumet av protein kreves er: 8 x volum i godt Strip (oppsummering verdi). Den døde av V-formet av 96-brønns celle kultur plate er 2,5 µL. Antall microsyringes varierer avhengig av det valgte programmet (8 + 96 = 104; eller 8 + 2 x 96 = 200).
På grunn av fortynning av tilstanden med tilsetningsstoff i protokollen 1 må betingelsen være forberedt på en proporsjonalt høyere konsentrasjon enn opprinnelig. Økningen i siste konsentrasjoner er lettest oppnås ved å redusere den endelige tillegg vann beregnede endelige volumet. Etter dette fortsetter ett bare med et normalt sett opp til dråper som blander tilstanden og prøve (f.eks, 100 nL protein + 100 nL tilstand allerede blandet med tilsetningsstoffer). Protokollen 2 (f.eks, 200 nL protein + 200 nL tilstand + 100 nL additiv) forenkler screening i ulike konsentrasjoner av tilsetningsstoffer ved å bare variere mengden additiv skjermen lagt. Protokollen 2 innebærer mer eller mindre fortynning av dråper (som kan endre krystallisering).
Den flytende handler fra system 2 kan brukes å Sug opp nok stand i 12 tips og dispensere 8 dele i reservoarer av en 96-brønns plate (se protokollen, trinn 2.2.2), selv om dette trinnet kan selvfølgelig gjøres manuelt med en flerkanals pipette ( Figur 4). Flere plater kan fylles samtidig med samme betingelsen ved hjelp av flytende behandleren (for å teste ulike additiv skjermer senere). Når du forbereder 2 plater, fylle reagensbeholder med minst 23 mL. Når du forbereder 3 plater, fylle reagensbeholder med minst 31 mL.
5. krystallisering plater og tilknyttede enheter
Utformingen av både MRC sittende-slipp damp diffusjon krystallisering plater (96-brønns 2-slipp og 48-vel 1 slipp figur 5A og 5B figur) gir egenskaper som gir pålitelig og effektiv automatisert krystallisering eksperimenter, med spesielt sfærisk form av øvre- og en liten V-form av reservoarene som letter nøyaktig dispensing og sentrifugering når sentrering av dråpene kreves. I tillegg har øverst-brønnene en linse effekt for optimal belysning under en stereomicroscope (polymer er UV smittsomme for påvisning av UV-absorberende eller fluorescerende krystaller23).
En egendefinert seal (figur 5C) kan konfigurere hengende slipp krystallisering eksperimenter i begge typer plater ved hjelp av en nanoliter dispenser (protokoller ikke vist). Endelig har begge MRC platene samme ytre dimensjoner og rim. Rim passer inn i sporene av våre spesialbygde plate holderen (figur 5 d), som brukes til manuelt å sette/fjerne tetting tape uten spruting væsker.
Figur 5: The MRC krystallisering plater og tilknyttede enheter utviklet ved LMB. (A) A1-hjørne av 96-brønns plate. Reservoaret (avlang) er på venstre side av krystallisering godt, de to sfæriske øvre-brønnene til høyre. Dimensjoner er i millimeter. (B) A1-hjørne av 48-vel plate. Reservoaret er på høyre side av brønnen (1 stor øvre-vel bare). (C) MRC hengende slipp segl. (D) In-house tilpasset plate holderen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. protein krystaller
Figur 6 viser eksempler på nyttige krystaller med våre automatiserte protokoller.
Figur 6: lys micrographs av dråpestørrelse inneholder krystaller innhentet etter automatisert protokollene. (A, B) Krystaller første skjermen OmpF og MreB i platene forberedt med 2 fullt automated systemer ( protokollen delene 1.1 og 1.2, vilkårene: LMB07 godt A4 og LMB20 godt D12, henholdsvis, dråper er 100 nL protein + 100 nL tilstand, arbeide med Andrzej Szewczak, LMB)24. (C, D) Bar domene krystaller før og etter optimaliseringen av innledende forhold med metoden 4 hjørner (trinn 2.1, LMB02 B6, 1000 nL + 1000 nL, upublisert arbeid av Leonardo Almeida-Souza, LMB). (E, F) Tunge kjede av menneskelige dynein 1 N-terminal domene krystaller før og etter optimaliseringen av den første vilkår med metoden 4 hjørner (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, deretter 500 nL + 500 nL, upublisert arbeid av Edgar Morales-Rios, LMB). (G, H) Utfylle faktor D krystaller før og etter optimaliseringen av tilstanden med additiv screening (trinn 2.2, første betingelsen in-house tilpasset skjermen, 200 nL + 200 nL, additiv D6 fra 96-tilstand additiv skjermen, upublisert arbeid av Matthias Bauer, LMB). (Jeg, J) Viral konvolutten glykoprotein25 krystaller før og etter optimaliseringen av tilstanden med additiv screening (trinn 2.3, LMB20 A2, 150 nL + 150 nL, deretter 200 nL + 200nL + 100 nL additiv E5 fra 96-tilstand additiv skjermen, upublisert arbeid Yorgo Modis, University of Cambridge, UK). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
1 - utarbeidelse og bruk av første skjermbildene lagres i plater
Screening kits skal blandes før utlevert i platene fordi lys nedbør eller fase separasjon oppstår i noen rør under lagring. Når en skjerm består av to kits (2 x 48 rør), plasseres første tuben til andre kit i sted E1 av nedkjøling transportør. Når en skjerm er sammensatt av 4 kits (4 x 24 rør), første tuben til andre kit plasseres i sted C1, første røret i tredje kit er plassert på et sted E1 og første tube fjerde settet er plassert på et sted G1. Stund setter inn rør i deres nedkjøling transportør, plasseres lokk på et brett etter oppsettet standard 96-brønnen-landskapet. Siden godt numrene angis på lokkene av produsenter, kan dette kors-kontroll hvis alle rør er plassert i riktig rekkefølge. Dette bidrar også til å erstatte riktige lokkene på rør når du fyller et redusert antall plater.
Vi lagrer forhåndsutfylte platene på 10 ° C, et kompromiss å unngå frysing og lagring på 4 ° C som kan føre til forverring av forholdene og problemer med tetting. Platene er lagret i opptil flere måneder med vanligvis ingen merkbar kondens på indre ansiktet av segl. Dette er mindre sant for LMB05, LMB06, LMB09 og LMB10 plater som disse inneholder forhold med relativt høye konsentrasjoner av ustabile reagenser (tabell 1). Liten mengde kondens på innsiden av segl reduserer tetting effektivitet og kan forårsake kryssforurensning mellom brønner mens unsealing platene. For å hjelpe med å hindre kondens under innledende nedkjøling, kan plater først overføres fra karusellen i en isolert piknik kjøligere som lagres i et kaldt rom 4 ° C over natten. Den meget langsom avkjøling minimerer utviklingen av temperatur graderinger i forseglet brønnene og dermed reduserer kondens samlede15. I tillegg når platene er lagret i 10 ° C inkubator, plasseres en in-house tilpasset SBS polystyren lokket på tallerkenen øverst i hver bunke (vises ikke).
Hele settet med våre forhåndsutfylte plater kan brukes som første storskjerm mot en roman, vannløselige, protein prøve. Færre plater kan også velges tilsvarer spesifikke krav. For eksempel LMB15 og LMB19 er skjermer formulert spesielt for membran protein prøver26,27, eller LMB20 er en skjerm formulert med tunge-atomer å lette eksperimentelle utfasing Diffraksjon data28 (se også : Formulering av MORPHEUS protein krystallisering skjermer).
2. sette opp krystallisering dråper
Når du bruker systemet 2, skal screening sett med betydelige mengder ustabile reagenser behandles først. Dette unngår kondens dannet på gummi av SBS lokkene, som kan påvirke lokket håndtering og plate tetting. En SBS lokk har litt klaring når på en plate, og det er derfor de må justeres først (se protokollen, trinn 1.2.6). Protein døde volumene i brønnene av PCR plate er relativt sjenerøse (0,8 µL, se legenden om tabell 2). Merk at like sjenerøse døde volumer er ansatt ved nanoliter dispenser individuelt med protein i 8-brønns strimler (Tabell 4). Mindre døde volumer kan fungere, men noen prøver følge tipsene, kalibrering av en robot kan bli litt unøyaktig, rommet kan bli varmere enn vanlig, etc. Alle føre til eksempel tap dekket av generøse døde volumene for å konsolidere tilnærming.
Siste utviklingen aktivert ytterligere miniatyrisering eksperimenter og dermed volumet av eksempel kreves for screening krystallisering forhold kan reduseres betydelig ved å integrere de tilsvarende teknologi29,30 . Men må noen aspekter av ytterligere miniatyrisering nøye overveielse, som fordampning av dråper31 og manipulering av microcrystals32.
Til slutt, sentrifugering av platen (2000 rpm, 1 min) kunne integreres til rutinemessig slutt når krystallisering dråper (i sfærisk øvre-wells). En mer konsekvent størrelsen og formen på dråper fra sentrifugering redusere reproduserbarhet problemer33,34. Sikkert, sentrert drops vil lette senere eksperimenter med et mikroskop som nødvendig brennvidden vil ligne over hele platen.
3. fordelene metoden 4-hjørnet
Den viktigste fordelen med metoden 4 hjørner er dens enkelhet, som minimerer feil og muliggjør enkel automatisert protokoller. For eksempel vil 4 hjørnet løsningene alltid bli plassert på dekket av en flytende handler følge samme oppsett. Alle programmer er basert på fast forhold mellom løsninger (Figur 3 c).
Manuell forberedelse av 4 hjørnet løsninger er foretrukket automatisk håndtering av løsninger på høye konsentrasjoner som kan være svært tyktflytende. Relativt rask og nøyaktig aspirasjon/dispenser er mulig på de fleste typer flytende handlers med minimumskravene for optimalisering av flytende klasser. Likevel kan noen hjørne løsninger fremdeles for viskøse for en robot som opererer med en flytende-systemet til å fungere effektivt. Det er derfor vi valgte en flytende handler med positiv forskyvning (figur 3B).
I tillegg til de 2 lineære forløpninger for kan en tredje komponent (dvs., et sett av buffere/tilsetningsstoffer) testes i en konstant konsentrasjon på en praktisk måte. For dette, er et relativt stort volum sett av hjørnet løsninger på en hensiktsmessig høyere konsentrasjon, unntatt komponenten skal varieres, utarbeidet først. Deretter lager løsninger inkludert denne komponenten legges til å justere de endelige konsentrasjonene. For eksempel er 50 mL av 4 hjørnet løsninger forberedt på 10% høyere konsentrasjoner enn opprinnelig. Dette sett er deretter delt i 5 mindre deler av 4. Til slutt, 10% i volum av ulike buffer-pH løsninger legges til hver delsett.
4. formater og typer additiv skjermer
Skjermbildene lagres vanligvis på 20 ° C (Figur 4) siden de ikke brukes regelmessig og inneholde flyktige/ustabilt forbindelser. Bruk av en frossen additiv skjerm lagret i en dyp godt blokk (1 mL i brønner) må planlegges tidlig fordi det vil ta 12-24 hr for alle additiv løsninger å tine helt ved romtemperatur. Også en rekke brukere dele samme additiv skjermen, potensielt forårsake problemer med kryss-kontaminering. Endelig gjør høyden på dypt godt blokker dem uegnet for de fleste nanoliter dispensere. Som en praktisk løsning å omgå disse problemene, skal skjermen overføres fra dypt godt blokken til lav profil plater (Figur 4).
Historisk har additiv skjermer som inkluderer en rekke enkelt reagenser (med enkelt konsentrasjoner) vært svært populære35,36. Men er andre typer additiv skjermer utviklet som integrerer blandinger av tilsetningsstoffer37 eller redusert antall enkelt tilsetningsstoffer på ulike konsentrasjoner38. Endelig er en utfyllende tilnærming å undersøke effekten av tilsetningsstoffer på prøvene før krystallisering39,40.
5. mer hensyn
God praksis: De fleste skjermer inneholder skadelig eller selv giftige stoffer og derfor tilstrekkelig personlig beskyttelse må brukes under protokoller. Like, bevegelige deler av roboter kan føre til skader, særlig når prøver å manuelt inn mens et program kjører (selv om de fleste av roboter har Nødstopp-knappen/system). På grunn av tekniske kompleksiteten involvert, vanlig kontroll av roboter, skjermer og programmer med tidligere preget test prøver er viktige for vedvarende høye nivåer av reproduserbarhet.
Produksjon: Som en indikasjon, mellom 4000 til 8000 LMB produseres plater årlig med systemet 1 (og senere ansatt av brukere for første screening). Det er ikke tilpasset lager en stor mengde pre-fylt plater på 10 ° C når forventet inntekt er mye lavere, som etter 4-5 måneder, noen forhold vil begynne å svekkes og fordampe. Ulike tilnærminger til automatisering protokoller er gjennomført for små til mellomstore laboratorier41.
Lagre og vurdere eksperimenter: Etter å forberede dråpene, lagres plater på lite vibrasjoner hyllene i et rom på 4 eller 18 ° C med strengt kontrollert temperatur (+/-0,5 ° C maksimalt avvik). Eksperimenter vurderes med kaldt lys kilde mikroskop. Ulike automatisert imaging-systemer er kommersielt tilgjengelig, men man bør nøye vurdere alle aspekter: samme hastighet til å skanne en plate blir nok for høy gjennomstrømming? Vil objekter enn krystaller forstyrre autofokus? Resulterende kvaliteten på bildene er tilstrekkelig å flekk svært små krystaller (særlig rundt kanten av dråpene)? 42 , 43 , 44
Sammenligning av krystallisering vilkår: Etter forsiktig undersøkelser om innholdet av krystallene først innhentet, kan en analysere trender og likheter over ved hjelp av LMB skjermen databasen eller C6 Webverktøy45.
Disclosures
Vi herved uttrykke en motstridende kommersiell interesse siden LifeArc kommersialiserer følgende elementer: 96 - og 48-brønnen MRC plater, MRC hengende slipp selen, MORPHEUS, Pi, ANGSTROM og LMB krystallisering skjermene.
Acknowledgments
MRC-LMB krystallisering anlegget er vennlig støttes av Medical Research Council (UK). Vi takker medlemmer av LMB for deres støtte: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent og Pat Edwards (strukturelle studier), Steve Scotcher og de andre medlemmene av mekaniske verksted, Neil Grant og Jo Westmoreland (visuelle hjelpemidler), Paul Hart og Tom Pratt (det). Vi vil gjerne takke Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart og Heather Ringrose (Hamilton Robotics, UK), Paul Thaw, Robert Lewis og Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Sveits) George Stephens og Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem Imaje, UK) og Graham Harris (The Cleveland Agency) for teknisk hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Robots | |||
| Freedom EVO® | Tecan | n/a | Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0. |
| Microlab® STAR™ | Hamilton | n/a | Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface. |
| Mosquito® | TTP Labtech | n/a | Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422. |
| Dragonfly® | TTP Labtech | n/a | Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196. |
| Adhesive plate sealer | Brandel | n/a | Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot). |
| Inkjet printer 9232 | Markem-Imaje | n/a | Integrated to System 1. Touchscreen interface. |
| Crystallization screens | |||
| Crystal Screen™ 1 | Hampton Research | HR2-110 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01 |
| Crystal Screen 2™ | Hampton Research | HR2-112 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01 |
| Wizard™ Classic 1 | Rigaku | 1009530 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02 |
| Wizard™ Classic 2 | Rigaku | 1009531 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02 |
| Grid Screen™ Ammonium Sulfate | Hampton Research | HR2-211 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ PEG/LiCl | Hampton Research | HR2-217 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Quick Screen™ | Hampton Research | HR2-221 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ Sodium Chloride | Hampton Research | HR2-219 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ PEG 6000 | Hampton Research | HR2-213 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| Grid Screen™ MPD | Hampton Research | HR2-215 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| MemFac™ | Hampton Research | HR2-114 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| PEG/Ion™ | Hampton Research | HR2-126 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05 |
| Natrix™ | Hampton Research | HR2-116 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05 |
| Crystal Screen Lite™ | Hampton Research | HR2-128 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06 |
| Custom Lite screen | Molecular Dimensions Ltd | n/a | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06 |
| Wizard™ Cryo 1 | Rigaku | 1009536 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07 |
| Wizard™ Cryo 2 | Rigaku | 1009537 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07 |
| JBS1 | JenaBioScience | CS-101L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS2 | JenaBioScience | CS-102L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS3 | JenaBioScience | CS-103L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS4 | JenaBioScience | CS-104L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS5 | JenaBioScience | CS-105L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS6 | JenaBioScience | CS-106L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS7 | JenaBioScience | CS-107L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS8 | JenaBioScience | CS-108L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS9 | JenaBioScience | CS-109L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| JBS10 | JenaBioScience | CS-110L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Index™ | Hampton Research | HR2-144 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13 |
| SaltRX™ 1 | Hampton Research | HR2-107 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14 |
| SaltRX™ 2 | Hampton Research | HR2-109 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14 |
| MemStar™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-21 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15 |
| MemSys™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-25 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15 |
| JCSG-plus™ Suite | Qiagen | 130720 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16 |
| MORPHEUS® screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17 |
| Pi minimal screen | JenaBioScience | CS-127 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18 |
| Pi-PEG screen | JenaBioScience | CS-128 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19 |
| MORPHEUS® II screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-91 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20 |
| LMB crystallization screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-98 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21 |
| Additive screens | |||
| HT additive screen | Hampton Research | HR2-138 | Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well). |
| MORPHEUS® additive screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-93-500 | Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well). |
| ANGSTROM additive screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-100 | Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well). |
| MORPHEUS® additive screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-93 | Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well). |
| ANGSTROM additive screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-100-FX | Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well). |
| HIPPOCRATES additive screen | Molecular Dimensions Ltd | n/a | 48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III). |
| Other consumables | |||
| 96-well MRC 2-drop plate | Swissci | MRC 96T-UVP | Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80 µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible. |
| 48-well MRC 1-drop plate ('MAXI plate') | Swissci | MMX01-UVP | Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200 µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible. |
| MRC hanging drop seal | Swissci | n/a | Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible. |
| Adhesive sealing tape | Hampton Research | HR4-50 | 3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing. |
| Adhesive aluminium sheet | Beckman Coulter | 538619 | Used to reseal additive screens. |
| Ink cartridge | Markem-Imaje | 9651 | System 1 (inkjet printer). |
| Solvent cartridge | Markem-Imaje | 8652 | System 1 (inkjet printer). |
| 50 µL tips | Hamilton | 235947 | System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks. |
| Reagent container | Hamilton | 194052 | Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols. |
| PCR plate | Thermo Scientific™ | AB-2150 | System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells. |
| microsyringes | TTP Labtech | 4150-03020 | Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing). |
| strip-holder block | TTP Labtech | 3019-05013 | SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'. |
| 2 µL 8-well strip | TTP Labtech | 4150-03110 | Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL. |
| 5 µL 8-well strip | TTP Labtech | 4150-03100 | Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL. |
| 5 mL syringes | TTP Labtech | 4150-07100 | Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100. |
| Troughs/Reservoirs | TTP Labtech | 4150-07103 | Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50. |
| Orbital microplate shaker | CamLab Limited | n/a | Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm). |
| Microplate mixer | TTP Labtech | 3121-01015 | MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins. |
References
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
- Bergfors, T. M. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
- Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (47), e2285 (2011).
- Crick, F. H. C. X-Ray Diffraction of Protein Crystals. Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).
- Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).
- Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events. Biophys. J. 95, 1-9 (2008).
- Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences. 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).
- Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).
- Stevens, R. C. High-throughput protein crystallization. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).
- Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).
- Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).
- Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. Membrane protein structure determination-the next generation. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).
- Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).
- Gorrec, F. The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled. J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).
- Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).
- Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
- DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. Technological Advancements in Liquid Handling Robotics. JALA. 6, 36-40 (2001).
- Jenkins, J., Cook, M. Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology. JALA. 9, 257-261 (2004).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (67), e4000 (2012).
- Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (78), e50548 (2013).
- Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).
- Szewczak, A. Structural studies of the bacterial MreBCD complex. , University of Cambridge, UK. (2016).
- Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion. J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).
- Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).
- Parker, J. L., Newstead, S. Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update. Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).
- Gorrec, F. The MORPHEUS II protein crystallization screen. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).
- Yin, X., et al. Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).
- Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography. JALA. 21, 97-106 (2015).
- Zipper, L. E., et al. A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).
- Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Microcrystal manipulation with laser tweezers. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).
- Newman, J. Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).
- Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).
- McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins. J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).
- Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids. J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).
- McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules. J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).
- Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).
- Chari, A., et al. ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space. Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).
- Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).
- Wilson, J. Automated Evaluation of Crystallisation Experiments. Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).
- Snell, E. H., et al. Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
- Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions. Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).
