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Biochemistry

Automatische Protokolle für makromolekulare Kristallisation am MRC Laboratory of Molecular Biology

Published: January 24, 2018 doi: 10.3791/55790
Automatic Translation
1, 1
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council

Summary

Automatisierte Systeme und Protokolle für die routinemäßige Vorbereitung einer großen Anzahl von Bildschirmen und Nanoliter Kristallisation Tröpfchen für Dampf-Diffusion-Experimente sind beschrieben und diskutiert.

Abstract

Wenn hochwertige Kristalle, die Röntgenstrahlen beugen gewonnen werden, kann die Kristallstruktur in der Nähe von atomarer Auflösung gelöst. Die Voraussetzungen für die Proteine, DNA, RNA und ihre komplexe kristallisieren lassen sich jedoch nicht vorhersagen. Beschäftigt eine breite Vielzahl von Bedingungen, ist eine Möglichkeit, die Ausbeute an Qualität Beugung Kristalle zu erhöhen. Zwei voll automatisierte Systeme haben bei der MRC Labor für Molekularbiologie (Cambridge, England, MRC-LMB), die Kristallisation Abschirmung gegen 1.920 Anfangsbedingungen zu erleichtern durch Dampf-Diffusion in Nanoliter Tröpfchen entwickelt. Halbautomatische Protokolle wurden auch entwickelt, um die Bedingungen zu optimieren, durch Änderung der Konzentrationen von Reagenzien, pH-Wert, oder durch die Einführung von Zusatzstoffen, die potenziell Eigenschaften der daraus resultierenden Kristalle verbessern. Die entsprechenden Protokolle werden ausführlich beschrieben und kurz besprochen. Zusammengenommen können sie bequem und hocheffiziente makromolekularen Kristallisation in einer Mehrbenutzer-Einrichtung, wobei der Benutzer Kontrolle über die wichtigsten Parameter ihrer Experimente.

Introduction

Röntgen-Kristallographie wird ausgiebig um unser Verständnis der Mechanismen der biologischen und Krankheit auf atomarer Ebene weiter und rationale Ansätze zur Drug Discovery1anschließend gerne angewendet. Für diese, gereinigt und konzentriert (2-50 mg/mL) makromolekularen Proben von Proteinen, DNA, RNA, andere Liganden und ihre komplexe sind erprobt für ihre Neigung, Form dreidimensionalen Gitter durch Kristallisation2,3 bestellt ,4. Wenn hochwertige Kristalle, die Röntgenstrahlen beugen gewonnen werden, kann die Kristallstruktur in der Nähe von atomarer Auflösung5,6gelöst. Entscheidend ist, die Voraussetzungen für eine neue Probe kristallisieren können nicht vorhergesagt werden und die Ausbeute an qualitativ hochwertige Kristalle beträgt in der Regel sehr gering. Eine Ursache ist, dass viele Proben von Interesse herausfordernde biochemische Eigenschaften, die sie auf der entsprechenden Zeitskala für Kristallisation (in der Regel ein paar Tage) instabil machen. Zu guter Letzt wird der Prozess durch den Zeitaufwand, Proben und Muster Varianten produzieren und optimieren Sie ihre Reinigung und Kristallisation7,8verschärft.

Eine Kristallisation Bedingung ist eine Lösung mit einem Fällungsmittel, die Sample-Löslichkeit verringert, und Bedingungen oft auch Puffer und Zusatzstoffe enthalten. Hunderte von solchen Reagenzien sind gut geeignet, um die Parameter der Kristallisation Experimente zu ändern, da sie geringe Neigung zu stören Probe Integrität (z.B. Protein oder Nukleinsäure-Entfaltung) haben. Während Millionen von Kombinationen der Kristallisation Reagenzien testen nicht machbar ist, ist Testen von mehreren bis vielen Screening-Kits - formuliert mit verschiedenen Strategien9,10 - mit miniaturisierten Irrungen und automatisierten Protokolle möglich. In dieser Perspektive ist die am meisten zugänglich Technik wahrscheinlich Dampf Diffusion mit 100-200 nL Tröpfchen sitzt auf einem kleinen gut über ein Becken mit der Kristallisation Zustand (25-250 µL), umgesetzt in spezialisierten Kristallisation Platten11 , 12. Protein Probe und Zustand werden häufig kombiniert, im Verhältnis 1:1 für ein Gesamtvolumen von 200 nL beim Einrichten der Tröpfchen in den oberen-Brunnen. Roboter-Nanoliter Protein Kristallisation kann implementiert werden, mit alternativen Techniken und Platten wie die unter Öl Batch13 und Lipid-kubische Phase14 (die jüngste ist ein speziell auf Trans-Membranproteine, die angewendet wird sehr schlecht in Wasser löslich).

Der Kristallisation Anlage am MRC-LMB wurde in den frühen 2000er Jahren begonnen und eine frühe Übersicht über unsere automatisierten Protokolle wurde in 200515. Eine historische Einführung in die Protein-Kristallisation wurde vorgestellt und auch ein Überblick über die Vorteile der Roboter Nanoliter nähern (dann einen neuartigen Ansatz zur routinemäßigen Experimente). Seit makromolekularen Kristallisation ist im Wesentlichen ein stochastischer Prozess mit sehr wenig oder gar keine nützliche Vorabinformationen, beschäftigt eine breite Vielzahl von (geeigneten) Anfangsbedingungen erhöhen die Ausbeute an Qualität Beugung Kristalle16. Außerdem ist ein oft übersehener Vorteil von einem anfänglichen Großbild, die Notwendigkeit der Optimierung von Proben und Kristallen in vielen Fällen deutlich zu reduzieren. Natürlich kann man müssen noch mit Optimierung von einigen Anfangsbedingungen später fortfahren. In der Regel die Konzentration von Reagenzien und der pH-Wert werden dann systematisch untersucht. Weitere Reagenzien können auch in die optimierte Bedingung(en), weitere Parameter der Kristallisation ändern eingeführt werden. Sicherlich, man sollte versuchen Kristallisation mit einer Probe frisch zubereitet, daher die entsprechenden Protokolle müssen jederzeit unkompliziert und verfügbar.

Hier zwei vollautomatische Systeme bei MRC-LMB (Anlagen 1 und 2) und die entsprechenden Protokolle sind ausführlich beschrieben. Die Hauptanwendung der beiden Systeme ist initial screening durch Dampf-Diffusion in Drop Kristallisation Platten sitzen. System 1 integriert ein liquid Handler, eine automatisierte Karussell auf Lager Platten, Tintenstrahldrucker für die Platte Beschriftung und einer Haftplatte Sealer. Auf dem System 1 sind 72 96-Well-Platten gefüllt mit im Handel erhältlichen Screening-Kits (80 µL Zustand ins Reservoir aus einem Start Volumen von 10 mL im Reagenzglas), beschriftet und versiegelt. Die Platten werden dann in einem Inkubator 10 ° C gespeichert wo sie Benutzern zur Verfügung jederzeit (als Einstiegsbilder "LMB Platten" genannt) sind.

System 2 integriert ein liquid Handler, ein Nanoliter-Dispenser und einer Haftplatte Sealer. Auf dem System 2, sitzen Tröpfchen (100-1.000 nL) für Dampf Diffusion Experimente entstehen durch die Kombination von Bedingungen und die Probe in den oberen Vertiefungen der 20 48 oder 96-Well-Platten vorausgefüllt mit Bedingungen. Dies bedeutet, dass 1.920 ersten Screening Bedingungen erprobt sind, bei der Verwendung von 20 LMB Platten auf das System 2.

Roboter sind auch einzeln für die Optimierung der gewählten Bedingungen benutzt, und die entsprechenden halbautomatischen Protokolle werden ebenfalls beschrieben. Die 4-Ecken-Methode17 wird routinemäßig eingesetzt, um Optimierung Bildschirme produzieren. Das entsprechende Protokoll erfordert zunächst die manuelle Vorbereitung der 4 Lösungen ("A, B, C und D"). Zwei lineare Verläufe von Konzentrationen (für zwei wichtigsten Kristallisation Agents) werden direkt in den Stauseen der Kristallisation Platte dann automatisch generiert. Dafür verzichtet ein Spritze-basierte liquider Handler die 4 Eck-Lösungen bei unterschiedlichen Verhältnissen.

Um eine Bedingung weiter zu optimieren, kann eine additive Bildschirme einsetzen, die möglicherweise die Eigenschaften des resultierenden Kristalle18verbessern. Zwei Ansätze gibt es für additive Screening: ein Protokoll, beginnend mit Zusatzstoffe verzichtet in den Stauseen der Kristallisation Platten vor dem Einrichten der Tröpfchen (Protokoll 1) und ein anderes Protokoll, wo die additive Bildschirm entfällt, direkt auf die Tröpfchen (Protokoll Nr. 2).

Andere nützlichen Entwicklungen, die bei der MRC-LMB, automatisierte makromolekularen Kristallisation zu erleichtern eingeleitet wurden, werden ebenfalls vorgestellt. Im wesentlichen minimiert Kristallisation Platten und damit verbundenen Geräte wie z. B. einen stapelbaren Gesellschaft der biomolekularen Screening (SBS) Deckel, die Verdampfung von Bedingungen, wenn das System 2 mit.

Aus Platzgründen wird davon ausgegangen, dass Benutzer mit den Grundfunktionen und Wartung von Nanoliter-Dispenser, dem Inkjet-Drucker und Haftplatte Sealer vertraut sind. Sofern nicht anders angegeben, sind die Platten auf dem Deck der Roboter positioniert, dass die gut A1 ("A1-Ecke") ist auf der Rückseite links ein Plattenträger.

Protocol

(1) die zwei vollautomatische Systeme (erste Sichtung)

  1. System 1: Vorbereitung der 72 96-Well-Kristallisation Platten gefüllt mit screening-Kits (LMB-Platten)
    1. Sicherzustellen Sie vor der Durchführung des Verfahrens, dass das System Roboter initialisiert werden und ihre controlling-Software geöffnet. Schalten Sie den Kühler des Trägers Rohr-Kühlung ca. 30 Minuten bevor das Hauptprogramm gestartet wird.
    2. Legen Sie eine Testplatte auf dem motorisierten SBS-Träger der Platte Sealer. Führen Sie die Platte Versiegelung und überprüfen Sie, dass der Film richtig angewendet wird. Wiederholen Sie diesen Test noch zweimal, um sicherzustellen, dass die Platte Sealer bereit ist.
    3. Fügen Sie 20 L deionisiertes Wasser in den wichtigsten Behälter des flüssigen Handlers. Trennen Sie die Kupplung-Einsätze aus dem kleinen Behälter (20 % Ethanol Spüllösung) und schließen Sie die Einsätze an den Hauptcontainer.
    4. Geben Sie den entsprechenden Benutzernamen (Tabelle 1) auf dem Inkjet-Drucker-Touchscreen. Dann öffnen und Schließen der Karussell-Tür, um die Karussell-Drehung auslösen. Öffnen Sie die Tür, wenn der erste Stapel sich darbietet.
    5. Vollständig zu laden, den ersten Stapel mit 22 Kristallisation Platten, jeweils mit Spalte 1 nach unten heraus. Geladen Sie vollständig die nächsten zwei Stapel auf die gleiche Weise.
    6. Die restlichen 6 Platten in den höchsten Positionen im vierten Stapel zu laden. Schließen Sie dann die Karussell-Tür.
    7. Stellen Sie sicher, dass der Kühler 14 ° C Anzeige. Kehren Sie sanft und immer wieder die ausgewählten Screening-Kits für 1 Minute. Öffnen Sie die Frontplatte des flüssigen Handlers.
    8. Öffnen Sie die Rohre und legen Sie sie in der Kühlung Träger nach der 96-Well-Standardlayout (A1, A2 usw.). Setzen Sie durch das platzieren jedes Rohr im Träger ihre Deckel auf einem Tablett in der gleichen 96-Well-Layout.
    9. Cross-Check das Rohr positioniert und sicherzustellen, dass alle Rohre Niveau sind und ließ sich in den Träger. Schließen Sie dann die Frontplatte.
    10. Wählen Sie im Fenster 'Startup' der liquid Handler-Software "Run Instandhaltung" und öffnen Sie das Spülprogramm. Führen Sie das Programm, das 20 % Ethanol aus dem System zu spülen und die Außenseiten der Flüssigkeit-Abgabe Tipps zu waschen.
    11. Wenn Spülung abgeschlossen ist, klicken Sie auf 'Abbrechen', um zum "Startup" zurückzukehren. Wählen Sie "Ausführen ein bestehenden Prozesses" und klicken Sie auf "Start Ihrer Auswahl". Öffnen Sie das Programm "MRC Kit Dosieren". Füllen Sie in "18", "Instanzen" in der Konfiguration Bildschirm und führen Sie das Programm.
    12. Überwachen Sie das System, wie die ersten vier Platten beschriftet, gefüllt und versiegelt sind.
    13. Sobald alle 72 Platten vorbereitet und wieder in das Karussell gelegt wurden, wechseln Sie die Kupplung Einsätze aus den Hauptcontainer in den kleinen Behälter. Führen Sie das Programm "Start up Flush" (siehe Schritt 1.1.10).
    14. Schalten Sie den Kühler und entsorgen Sie die leere screening Kit Rohre. Entfernen Sie vorsichtig die 72 vorbereiteten Platten aus dem Karussell. Entsorgen Sie nicht korrekt ausgefüllt oder schlecht abgedichtet Platten. Speichern Sie die Ready-to-Use-Platten bei 10 ° C.
  2. System 2: Einrichten von Kristallisation Tröpfchen (100 nL Protein + 100 nL Zustand) aus einer einzigen Probe in 20 LMB-Platten
    1. Zunächst sicherstellen Sie, dass das System Roboter sind auf Nanoliter-Dispenser mit seiner offenen Software initialisiert wird und der liquid Handler-Methode-Manager geöffnet wird. Schalten Sie die Reaktionscup Kühlung Träger etwa 15 Minuten, bevor das Hauptprogramm gestartet wird.
    2. Legen Sie eine Testplatte auf dem motorisierten SBS-Träger der Platte Sealer. Laufen Sie die Platte Sealer und überprüfen Sie, ob die Platte richtig abgedichtet ist. Testen Sie die Platte Sealer dreimal.
    3. Führen Sie dann Nanoliter Dispenser 100 nL Tropfen der Probelösung in einer Testplatte legen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass die Tröpfchen korrekt eingestellt sind. Schließen Sie die Nanoliter-Dispenser-Software und entfernen Sie den Filmstreifen-Halter Block aus dem Deck.
    4. Legen Sie als nächstes in die speziell angefertigte Kennzeichenhalter ( Vertreter Ergebnissesehen: Kristallisation Geräte entwickelt, bei der LMB) der LMB-Platte mit der höchsten relativen Menge an flüchtigen Reagenzien in seinen Bedingungen (Tabelle 1). Entfernen Sie die Klebefolie von der Platte.
    5. Öffnen Sie die Frontplatte liquid Handler und platzieren Sie die unversiegelte Platte auf dem Deck, auf der Rückseite der erste Schiebe Carrier (Träger rutschen kann herausgezogen werden zur Erleichterung des Zugangs).
    6. Die Platte mit einem SBS-Aluminium-Deckel abdecken. Den Deckel in Richtung der hinteren linken Ecke des Trägers durch sanften Druck auf die gegenüberliegende Ecke des Deckels zu begleichen.
    7. Entsiegeln, laden in den verschiebbaren Trägern und decken die restlichen 19 Tafeln auf die gleiche Weise, am wenigsten flüchtige Bedingungen arbeiten. Sobald die Reaktionscup Kühlung Träger bei 4 ° C, ist wie durch ein grünes Licht, entfernen Sie seine Abdeckung.
    8. Schneiden Sie den Deckel von einem Reaktionscup mit (mindestens) 440 µL Protein Probe (Tabelle 2). Sicherstellen Sie, dass die Probe kein Schaum über den Meniskus, wie dies mit der flüssigen Detection System stören. Legen Sie das Rohr in Position 1 des Trägers Reaktionscup Kühlung.
    9. Legen Sie eine PCR-Platte auf der liquid Handler Deck vor der Platte verschieben Adapter Träger. Schließen Sie dann die Frontplatte.
    10. Nach dem Laden des Decks, sicherzustellen Sie, dass Nanoliter Dispenser Deck des Filmstreifen-Halter Blocks klar ist und die Träger auf der Rückseite der 50 µL-Tipp-Stacks von SBS Aluminiumdeckel klar sind.
    11. Wählen Sie in der liquid Handler "Methode" Verwaltungsoberfläche "Setup Platten". Die Initialisierung der beiden Systeme zu überwachen und die geführten Parameter ausfüllen. Befolgen Sie die Richtlinien der Methode Management Schnittstelle (Eingabeaufforderungen, Figuren und ein Tipp-Management-System bei der Vorbereitung helfen).
    12. Vergewissern Sie sich, dass alle erforderlichen Komponenten sind bereit, und starten Sie dann den Vorgang.
    13. Überwachung des Systems wie Nanoliter Dispenser die Tropfen in der ersten Platte setzt und Platte Sealer danach die Platte versiegelt.
    14. Sobald alle 20 Platten mit Kristallisation Tröpfchen vorbereitet und automatisch an die gleitenden Träger zurückgegeben wurden, öffnen Sie die Frontplatte und entfernen Sie vorsichtig die Platten. Überprüfen Sie, dass die Platten richtig abgedichtet sind, vor dem Speichern zur Kristallisation.
    15. Reinigen Sie die SBS-Deckel mit einer 20 % Ethanol-Lösung vor dem Stapeln sie auf der linken Seite des liquid Handler für die Lagerung. Entsorgen Sie die PCR-Platte und die Reaktionscup.
    16. Schalten Sie die Reaktionscup Kühlung Träger und wischen Sie die Kondensation. Lassen Sie ein Papiertuch auf der kühleren Oberfläche Kondenswasser aufzunehmen. Dann bringen Sie die Träger-Abdeckung und schließen Sie die Frontplatte.

2. Optimierung der Bedingungen

  1. Spritze-basierte liquid Handler: Herstellung von zwei linearen Gradienten der Konzentrationen in den Stauseen der Kristallisation Platte (4-Ecken-Methode).
    1. Zunächst sicherstellen Sie, dass der liquidere Handler eingeschaltet ist und mit seiner offenen Software initialisiert.
    2. Auf der "GRADIENT" Registerkarte: Öffnen Sie das gewünschte Programm, wählen Sie die Kristallisation Plattenart und das Endvolumen in den Stauseen (Tabelle 3). Die erweiterte Einstellung für 'max Schuss Vol' von 6.000 auf 3.000 gesenkt werden sollte, bei der Verwendung von Lösungen mit [Isopropanol] > 10 % V/V und [MPD] > 20 % V / v
    3. Vorbereiten der Spritzen. Einen Kolben in jeder Spritze (Spitzen enden nach unten) und schieben Sie die Rückseite der Spritzen in die dafür vorgesehenen Nuten unter dem Roboterkopf. Drehen Sie eine Spritze im Uhrzeigersinn, um es in Stellung blockiert (das Programm startet nur mit allen erforderlichen Spritzen richtig angeschlossen).
    4. Bereiten Sie die Tröge. Entfernen Sie der Edelstahl-Rahmen, und fügen Sie die Tröge. Die 4 Positionen auf der linken Seite entsprechen den 4 Ecken A, B, C, D. Umstellung auf "SET UP" Registerkarte "die zeigt die Volumen der erforderlichen Lösungen in jede Spritze (auf Tabelle 3, 0,5 mL Totvolumen auf die Volumes angezeigt, hinzugefügt wurde). Gießen Sie die Eck-Lösungen in ihre jeweiligen Tröge und setzen Sie den Rahmen wieder auf das Deck (der Rahmen hält in Position mit 2 kleinen Magneten befindet sich an der Vorderseite des Decks). Eine alternative Möglichkeit, fahren mit diesem Schritt soll die Lösungen in die Tröge gießen, wenn sie bereits auf dem Deck platziert werden.
    5. Platzieren Sie die Kristallisation Platte auf dem motorisierten SBS-Träger.
    6. Klicken Sie auf "ANZUSAUGEN" und warten Sie diesen Schritt abgeschlossen sein (wenn Kolben auf ihrem Weg nach oben gestoppt).
    7. Wechseln Sie zur Registerkarte "Ausführen" und führen Sie Programm.
    8. Nach Abschluss des Programms, gehen Sie zurück zu der Registerkarte "SET UP" und klicken Sie auf "Entfernen": das System löscht die Spritzen aus übrig gebliebenen Lösungen, und dann hebt die Kolben ganz oben. "Bereinigen" statt "REMOVE" verlangt werden, so bleibt der Kolben in der unteren Position bereit, weitere Lösungen mit der gleichen Spritzen Aspirieren.
    9. Entfernen Sie die Spritzen durch Drehen sie gegen den Uhrzeigersinn.
    10. Spritzen und Tröge in den entsprechenden Behälter entsorgen (oder abspülen mit entionisiertem Wasser und dann 20 % V/V Ethanol Lösung zur Wiederverwendung).
    11. Die Dichtplatte und platzieren Sie es auf die Mikrotestplatte Mixer für 3 min bei 1.000 u/min oder 10 min, beim Mischen von hoch viskoser Lösungen. Die Platte ist bereit für die Einrichtung von Kristallisation Tröpfchen auf dem Nanoliter-Spender.
  2. Additiv screening Protokoll Nr. 1 (Einrichtung von Kristallisation Tröpfchen in einer 96-Well-Kristallisation Platte vorausgefüllt mit Additiven Bildschirm)
    1. Zuerst bereiten Sie die Bedingung mit anfängliche Konzentrationen von Reagenzien stieg um 10 % (mind. Bd. 15 mL bei der Übertragung von der Bedingung aus einem Container auf dem Additiven Bildschirm mit dem liquid Handler).
    2. Sicherstellen Sie, dass der liquidere Handler betriebsbereit ist. Öffnen Sie das Programm "Bildschirm hinzufügen, Zusatzstoffe" für eine einzelne Platte (geben Sie Volumen in Stauseen: "72 µL"). Fordert, Figuren und eine Tipp-Management-System (12 x 1.000 µL Tipps erforderlich) Hilfe sicherstellen, dass der Roboter ist bereit, nach der Auswahl arbeiten.
    3. Abrufen der additiven-Bildschirms aus dem Inkubator-20 ° C und seine Aluminium-Dichtung sofort (Nutzung der Kennzeichenhalter) entfernen, dann legen Sie die Platte auf dem Deck des flüssigen Handlers. Das Programm arbeitet nach einem Hochformat (die Platte wird mit der A1-Ecke befindet sich vorne links des Trägers platziert). Auch stellen Sie auch den Behälter gefüllt mit der Bedingung. Führen Sie das Programm.
    4. Die Stauseen der Platte ausgefüllt haben, legen Sie es auf den Mikrotestplatte Shaker und führen Sie das Programm. Spülen Sie den Behälter Zustand mit entionisiertem Wasser und 20 % Ethanol zur Wiederverwendung.
    5. Richten Sie die Tropfen auf dem Nanoliter-Spender. Erstens entsiegeln der Kristallisation Platte (Nutzung der Kennzeichenhalter). Dann legen Sie die Platte und das 8-Brunnen-Protein in der ersten Position des Filmstreifen-Halter Blocks zu Streifen. Registerkarte "Setup" auf der controlling-Software zeigt die tatsächlichen Positionen der einzelnen Komponenten auf dem Deck. Laden Sie jeweils auch auf den Strip mit Protein Probe entsprechend die Tropfengröße erforderlich (Tabelle 4). Führen Sie das Programm, Tröpfchen vorzubereiten.
    6. Nach Abschluss des Programms, entfernen Sie die Platte aus dem Deck und verschließen Sie diese sofort (verwenden Sie die Platte Versiegelung, 3-Zoll breites Klebeband). Verwerfen Sie den Streifen in den geeigneten Lagerplatz.
    7. Größe, Form, zu bewerten und Zentrierung der Tropfen unter dem Mikroskop vor der Einlagerung.
  3. Additiv screening Protokoll Nr. 2 (Kristallisation Tröpfchen in einer 96-Well-Kristallisation-Platte mit einem wiederverwendbaren Additiv Bildschirm einrichten)
    1. Zuerst bereiten die additive Bildschirm: entsprechende gefrorenen 96-Well Kultur Zellplatte, bei 40 min. bei Raumtemperatur auftauen lassen. Dann Zentrifugieren Sie Additiv Bildschirms auf 1.000 x g für 2 min.
    2. Bereiten Sie die Bedingung (min. Vol. 15 mL bei der Übertragung von der Bedingung aus einem Container auf dem Additiven Bildschirm mit dem liquid Handler).
    3. Füllen Sie die Stauseen einer Kristallisation der 96-Well-Platte mit der Bedingung. Gehen Sie auf der Flüssigkeit-Handler genauso wie Protokoll 1, 2.2.2 Schritt, aber geben Sie "80 µL" für die Lautstärke in den Wasserbecken.
    4. Richten Sie die Tropfen auf dem Nanoliter-Spender mit 3 Komponenten auf dem Deck (die Platte mit dem Additiv Bildschirm, zusammen mit der Kristallisation Platte und den 8-Brunnen Protein-Streifen in der ersten Position des Filmstreifen-Halter Blocks, Tabelle 4).
    5. Die Zelle Kultur Dichtplatte mit dem Bildschirm mit einem Alu-Blech und legen Sie sie wieder in den Inkubator-20 ° C.
    6. Größe, Form, zu bewerten und Zentrierung der Tropfen unter dem Mikroskop vor der Einlagerung.

Representative Results

1. System 1 und LMB Platten

Abbildung 1A zeigt das System 1 bezogen auf einen flüssigen Handler mit einer Flüssigkeit-System (deionisiertem Wasser). Das Flüssigkeit-System besteht aus einem Container, eine Pumpe, Schlauch, 8 Spritzen ausgestattet mit Ventilen und 8 feste Tipps. Die flüssigen Klasse Einstellungen wurden optimiert, um Aspirat verzichten/eine Vielzahl von Lösungen und Multi-verzichten in 4 Platten (Multi-verzichten erfordert einen relativ großen Überschuss von angesaugte Volumen). 22 L Wasserbehälter und einem kleineren Behälter (5 L) mit 20 % V/V Ethanol liegen unterhalb des Systems um die Flüssigkeit-System zu versorgen. Jeder Container ist mit zwei Kupplung Einsätzen ausgestattet. Eine Einlage (blau eingefärbt) versorgt das System mit Flüssigkeit, der andere (rot) ist ein Fluss-Back, Überdruck zu reduzieren. Nach Gebrauch verhindert Spülen mit Wasser und dann 20 % V/V Ethanol Lösung mikrobielles Wachstum. Ein Kühlaggregat (auch befindet sich unterhalb des Systems) ist ein Custom-Built Rohr-Kühlung Carrier verbunden. System 1 ist 2050 mm breit, einschließlich Karussell, 760 mm tief und 88 mm hoch. Eine zusätzliche 550 mm ist in der Front für den Arbeitstisch erforderlich, die die Steuerung von dem Inkjet-Drucker und die Haftplatte Versiegelung hält. Zusätzlicher Speicherplatz ist auch neben der Anlage für den steuernden PC benötigt. Das Programm 72 vorgefüllte Platten produzieren (d.h. 18 Runden 4 Platten) dauert 3 h 50 min.

Abbildung 1 b ist eine Nahaufnahme des Hauptdecks, die mit 8 festen Tipps (Abbildung 1) montiert auf einen automatischen Pipettier Arm, einen zweiten Arm mit einem Greifer, ein Tipp-Waschstation, 2 x 4-Position Träger für SBS Platten und dem Träger Rohr-Kühlung ausgestattet ist. Das Hauptprogramm verarbeitet 4 Platten gleichzeitig, die automatisch aus dem Karussell herausgenommen und platziert auf dem Deck, wo sie mit Kristallisation Bedingungen (80 µL in Stauseen, Abbildung 1) gefüllt. Flüssigkeitsständen werden automatisch erkannt, da die Spitzen leitend sind. Während der liquidere Handler Bedingungen in einer Reihe von Platten verzichtet, ist eine weitere Reihe von leeren Teller herausgenommen aus dem Karussell, beschriftet und auf dem Hauptdeck aufgesetzt. Eine kleine Custom-Built Halterung und Fenster in der Rückwand des flüssigen Handlers mussten den Druckkopf und der Sensor auf der Rückseite das Hauptdeck zu positionieren. Die 8 Tipps werden gespült und gewaschen mit Wasser aus dem großen Behälter nach jedem Abgabe, die besteht aus 4 Aliquote in den entsprechenden Spalten der Stauseen. Nach 4 Platten gefüllt worden sind, sind sie automatisch versiegelt und wieder in ihre ursprüngliche Position im Karussell. Die Platte Sealer wird durch einen bestimmten Treiber (von der controlling-Software genannt) ausgelöst. Die Versiegelung verwendet eine Rolle von 3 Zoll breiten Klebeband die auf eine Platte mit Rollen unter mechanischem Druck angewendet wird. Nach Abschluss des Programms sind die vorgefüllten Platten manuell aus dem Karussell-Magazin entnommen und in einem 10 ° C Inkubator befindet sich innerhalb der Anlage gespeichert.

Figure 1
Abbildung 1 : Füllen die Stauseen mit ersten Screening-Kits. (A) Überblick über das vollautomatische System 1. Das Karussell ist eine separate automatische Einheit mit Teller stapeln und befindet sich in einem gut gemacht von klaren Acryl Platten auf der rechten Seite das Hauptdeck. (B) dem Hauptdeck des flüssigen Handlers mit (einer) der Rohr-Kühlung Carrier (angeschlossen an eine abschreckende Einheit unter, nicht gezeigt), (b) die schnelle Waschstation (verbunden mit Entwässerung, nicht gezeigt), (c) pipettieren Arm füllen 8 Stauseen einer Kristallisation der 96-Well-Platte (d) der Greifarm bringen einem gefüllten Teller auf (e) des motorisierten SBS Trägers der Platte Sealer. Im hinteren Teil die Terrasse ist (f) den Druck Kopf des Tintenstrahldruckers verbunden (g) die Inkjet-Steuergerät unter der Versiegelung. (C) A beschriftet Platte (Name des Bildschirms) und das Datum der Produktion Erfülltsein mit Kristallisation Bedingungen durch leitfähige 8 Tipps Polytetrafluorethylen beschichtet Edelstahl fixiert. (D) Querschnitt einer versiegelten Kristallisation gut. Das Reservoir enthält 80 µL Kristallisation Zustand (während der oberen auch leer ist). Reservoir und oberen gut Tiefe Spezifikationen sind in Millimetern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1 zeigt die verschiedenen Formulierungen für die im Handel erhältlichen Screening-Kits im Reagenzglas. Die Kits werden verwendet, um die Stauseen der Kristallisation 96-Well-Platten (LMB01-LMB22) in regelmäßigen Abständen mit dem System 1 zu füllen.

Name der Platte Set name Lieferant Katalog-Nummer Röhren grundlegende Beschreibung
LMB01 Crystal Display 1 Hampton Forschung HR2-110 48 Sparse Matrix (pH-Wert 4,6-8,5)
Crystal Display 2 Hampton Forschung HR2-112 48 Stochastische Probenahme (pH-Wert 4,6-9,0)
LMB02 Assistent 1 Rigaku 1009530 48 Stochastische Probenahme (pH 4,5-10,5)
Assistent 2 Rigaku 1009531 48 Stochastische Probenahme (pH 4,5-10,5)
LMB03 Raster-Bildschirm Ammoniumsulfat Hampton Forschung HR2-211 24 Rasterbildschirm, [AmS] = 0,8-3,2 M und Puffer pH 4,0-9,0
Raster-Bildschirm PEG/LiCI Hampton Forschung HR2-217 24 Rasterbildschirm, [PEG 6000] = 0-30 %w/V, Konz. LiCI = 1,0 M und Puffer pH 4,0-9,0
Schnelle Bildschirm Hampton Forschung HR2-221 24 Rasterbildschirm, [NaKPO4] = 0,8-1,8 M bei pH 5,0-8.2
Raster-Bildschirm-Natrium-Chlorid Hampton Forschung HR2-219 24 Rasterbildschirm, [NaCl] = 1,0-4,0 M und Puffer pH 4,0-9,0
LMB04 Rasterbildschirm PEG 6000 Hampton Forschung HR2-213 24 Rasterbildschirm, [PEG 6000] = 5-30 %w/v und Puffer pH 4,0-9,0
Rasterbildschirm MPD Hampton Forschung HR2-215 24 Rasterbildschirm [MPD] = 10-65 %w/v und Puffer pH 4,0-9,0
MemFac Hampton Forschung HR2-114 48 Sparse Matrix für Membranproteine (pH-Wert 4,6-8,5)
LMB05 PEG-Ionen Hampton Forschung HR2-126 48 Rasterbildschirm, [PEG 3350] = 20 %w/v und verschiedene Salze 0,2 m (ohne Puffer)
Natrix Hampton Forschung HR2-116 48 Unvollständige Fakultät (pH 5,6-8,5)
LMB06 Crystal Screen Lite Hampton Forschung HR2-128 48 Kristall Bild 1 mit Hälfte der ursprünglichen Fällungsmittel Konzentrationen
Benutzerdefinierte Lite Bildschirm Molekularen Dimensionen n/a 48 Zusätzliche Bedingungen mit niedrigen Konzentrationen Fällungsmittel
LMB07 Assistenten Cryo 1 Rigaku 1009536 48 Stochastische Probenahme mit Bedingungen Cryoprotected mit niedrigen MW Heringe (pH 4,5-9.4)
Assistenten Cryo 2 Rigaku 1009537 48 Stochastische Probenahme mit Bedingungen Cryoprotected mit niedrigen MW Heringe (pH 4,5-10.1)
LMB08 JBS1 JenaBioScience CS - 101L 24 Unvollständige Fakultät basierend auf verschiedenen Heringe (pH-Wert 4,6-9,0)
JBS2 JenaBioScience CS - 102L 24 Unvollständige Fakultät basierend auf PEG 4000 (pH-Wert 4,6-8,5)
JBS3 JenaBioScience CS - 103L 24 Unvollständige Fakultät basierend auf PEG 4000 (pH-Wert 4,6-8,5)
JBS4 JenaBioScience CS - 104L 24 Unvollständige Fakultät basierend auf mittlere MW Heringe (pH 6,5-8,5)
LMB09 JBS5 JenaBioScience CS - 105L 24 Unvollständige Fakultät basierend auf schwere MW Heringe (pH 6,5-9,5)
JBS6 JenaBioScience CS - 106L 24 Unvollständige Fakultät basierend auf AmS (pH-Wert 4,6-8,5)
JBS7 JenaBioScience CS - 107L 24 Unvollständige Fakultät basierend auf MPD (pH-Wert 4,6-8,5)
JBS8 JenaBioScience CS - 108L 24 Unvollständige Fakultät basierend auf MPD und Ethanol (pH-Wert 4,6-8,5)
LMB10 JBS9 JenaBioScience CS - 109L 24 Unvollständige Fakultät basierend auf gemeinsamen Salze und 2-Propanol (pH 4,6-8,5)
JBS10 JenaBioScience CS - 110L 24 Unvollständige Fakultät basierend auf gemeinsamen Salze (pH-Wert 4,6-8,5)
Klare Strategie Bildschirm 1 pH 4,5 Molekularen Dimensionen MD1-16LMB 24 Rasterbildschirm mit verschiedenen Heringen
Klare Strategie Bildschirm 1 pH 5,5 Molekularen Dimensionen MD1-16LMB 24 Rasterbildschirm mit verschiedenen Heringen
LMB11 Klare Strategie Bildschirm 1 pH 6,5 Molekularen Dimensionen MD1-16LMB 24 Rasterbildschirm mit verschiedenen Heringen
Klare Strategie Bildschirm 1 pH 7,5 Molekularen Dimensionen MD1-16LMB 24 Rasterbildschirm mit verschiedenen Heringen
Klare Strategie Bildschirm 1 pH 8,5 Molekularen Dimensionen MD1-16LMB 24 Rasterbildschirm mit verschiedenen Heringen
Klare Strategie Bildschirm 2 pH 4,5 Molekularen Dimensionen MD1-16LMB 24 Rasterbildschirm mit verschiedenen Heringen
LMB12 Klare Strategie Bildschirm 2 pH 5,5 Molekularen Dimensionen MD1-16LMB 24 Rasterbildschirm mit verschiedenen Heringen
Klare Strategie Bildschirm 2 pH 6,5 Molekularen Dimensionen MD1-16LMB 24 Rasterbildschirm mit verschiedenen Heringen
Klare Strategie Bildschirm 2 pH 7,5 Molekularen Dimensionen MD1-16LMB 24 Rasterbildschirm mit verschiedenen Heringen
Klare Strategie Bildschirm 2 pH 8,5 Molekularen Dimensionen MD1-16LMB 24 Rasterbildschirm mit verschiedenen Heringen
LMB13 Index Hampton Forschung HR2-144 96 Kleine spärliche Matrix und Raster-Bildschirme (pH 3,0-9,0)
LMB14 SaltRX 1 Hampton Forschung HR2-107 48 Rasterbildschirm, darunter 22 einzigartige Salze versus Salzkonzentration und pH (4.1-9,0)
SaltRX 2 Hampton Forschung HR2-109 48 Rasterbildschirm, darunter 22 einzigartige Salze versus Salzkonzentration und pH (4.1-9,0)
LMB15 MemStart Molekularen Dimensionen MD1-21 48 Dünnbesetzte Matrix für Membranproteine (pH 4,0 bis 10,0)
MemSys Molekularen Dimensionen MD1-25 48 Rasterbildschirm für Membranproteine (vor allem Heringe, pH 3,5-9,5)
LMB16 JCSG + Qiagen 130720 96 Sparse Matrix (pH 4,0 bis 10,0)
LMB17 MORPHEUS-Bildschirm Molekularen Dimensionen MD1-46 96 Rasterbildschirm einschließlich Mischungen aus Additiven und Cryoprotected Bedingungen (pH 6,5-8,5)
LMB18 PI minimal Bildschirm JenaBioScience CS-127 96 Unvollständige Fakultät (pH 4,0-9.5)
LMB19 PI-PEG-Bildschirm JenaBioScience CS-128 96 Unvollständige Fakultät für Membranproteine (pH 4,8-8.8)
LMB20 MORPHEUS II Bildschirm Molekularen Dimensionen MD1-91 96 Rasterbildschirm einschließlich Mischungen von Zusatzstoffen (schwere Atome) und Cryoprotected Bedingungen (pH 6,5-8,5)
LMB21 LMB Kristallisation Bildschirm Molekularen Dimensionen MD1-98 96 Dünnbesetzte Matrix einschließlich Bedingungen ausgewählt von LMB-Publikationen
LMB22 MORPHEUS III Bildschirm Molekularen Dimensionen n/a 96 Rasterbildschirm einschließlich Mischungen von Zusatzstoffen (Wirkstoffe) und Cryoprotected Bedingungen (pH 6,5-8,5)

Tabelle 1: Formulierungen der Kits gefunden in LMB Platten. Jede kommerzielle Screening Kit besteht aus 24/48/96 Bedingungen zunächst im Reagenzglas. Die LMB-Platten sind in 10 ° C Inkubatoren befindet sich innerhalb der Anlage, wo sie sind jederzeit zur Verfügung, um Benutzer auf Lager.

2. System 2 und Anforderungen für das Einrichten von Tröpfchen

Abbildung 2A zeigt das System 2 basiert auf einem liquid Handler19 mit positive Verschiebung und Einweg-Tipps. Die Einweg-Tipps werden in stapelbaren Regale für automatisierte Handhabung geliefert. Eine 3-polige Deck Nanoliter Spender20 wurde auf der rechten Seite des Systems integriert. Absaugen/verzichten auf dem Nanoliter Spender auch arbeitet mit positive Verschiebung mit Einweg-Microsyringes (in großen Spulen im Lieferumfang enthalten). Als Stand-alone-Roboter ist ein abnehmbare Filmstreifen-Halter-Block verwendet, um Protein Probe(n) laden. Für den vollautomatischen Prozess ersetzt eine 384-Well-PCR-Platte der Streifen-Inhaber. Eine ähnliche Haftplatte Versiegelung System 1 wurde auf der linken Seite integriert. Die Versiegelung und Nanoliter Spender stehen auf Custom-Built, erhöhte Arbeitstische in Reihenfolge für den wichtigsten Greifer, die Platte Träger dieser zwei integrierte Roboter zu erreichen (ein Fenster musste in beiden Seitenwänden des liquid Handler für den Greifer Zugriff außerhalb geschnitten werden Das Hauptdeck). Das Hauptprogramm ruft bestimmte Treiber auf Trigger Nanoliter Abgabe Programme und die Versiegelung in angemessener Zeit. Das System 2 ist 2.850 mm breit, 800 mm tief und 800 mm hoch. Zusätzlicher Speicherplatz ist neben der Roboter für die Anzeige der steuernde PC benötigt. Zwei Mülltonnen befinden sich unterhalb des Systems für die Tipps und Microsyringes während des Prozesses (der steuernde PC ist auch unter gespeichert) verworfen. Ein wichtiges Merkmal des Systems 2 ist das Gesamtlayout, das einfachen Zugang zu den drei Robotern behält, so dass sie für die Optimierung-Protokolle wie oben beschrieben, oder andere Protokolle wie Kristallisation an anderer Stelle beschrieben einzeln verwendet werden können von Membranproteinen Lipid-Mesophases21 und zufällige Microseed Matrix screening-22.

Abbildung 2 b ist eine Nahaufnahme des Decks, die mit einem Roboter-Arm ausgestattet ist. Der Arm integriert 12 unabhängige Pipettieren Sonden und der wichtigsten Greifer. Die Positionen der Sonden können einzeln in eine Richtung gesteuert werden, um Zugang zu verschiedene Orten entlang der Achse zwischen den Sonden oder auch nur einzelne Röhren. Die Sonden können abholen Einmalspitzen (1-12) oder ein paar Teller bewegen Adapter. Zunächst werden zwei Sätze von 4 Stapel mit 50 µL Einmalspitzen geladen. Flüssigkeitsständen werden automatisch erkannt, da die Spitzen leitend sind. Die Platte bewegt-Adapter sind mit 2 scharfen Stiften auf der Innenseite konzipiert, die eine optionale Greifer bei Bedarf zu bilden. Ist auf dem Hauptdeck befindet sich ein 24-Position Reaktionscup Träger für die Probe, Kühlung, obwohl nur 1-2 Positionen hier verwendet werden. Darüber hinaus gibt es einen Träger für die PCR-Platte und auch 2 Speicher Träger für stapelbar, Custom-Built SBS-Deckel (Abbildung 2). Schließlich gibt es 4 gleitenden Träger, jeweils mit 5 Standorten für Kristallisation Platten (4 x 5 = 20 Platten).

Figure 2
Abbildung 2 : Einrichten von Tröpfchen für Dampf-Diffusion-Experimente. (A) Überblick über das vollautomatische System 2. (B) dem Hauptdeck des liquid Handler im Betrieb mit (einem) die Lagerung Speditionen für Stapel von SBS Deckel, (b) den stapelbaren Tipps, (c) die Kühlung-Träger mit einer Probe in Reaktionscup, (d) Träger für die 2 Platte verschieben Adapter, (e) die PCR-Platte für die Übertragung von Protein zu Nanoliter Handlingroboter, (f) 9 versiegelt Platten, die wieder in ihre ursprünglichen Position (g) die optionale Greifer abnehmen des Deckels SBS 10th platziert wurden Platte über transportiert werden, auf das Deck der liquid Handler, (h) die nächsten 10 Platten mit SBS Deckel obendrauf, (ich) die wichtigsten Greifer vorbereitet werden, dient zum transport der PCR und Kristallisation Platte, (j) die wichtigsten automatisiert Das Deck des Dispensers Nanoliter Arm 12 Pipettieren Sonden (2 verwendet wird, um als optionale Greifer bedienen) und die wichtigsten Greifer und (k) zu integrieren. (C) eigene benutzerdefinierte SBS-Deckel aus Aluminium gefertigt. Die Deckel integrieren eine Gummiplatte zur Vermeidung von Verdampfung der Bedingungen und zwei kleine Löcher genau abgeholt mit der optionalen Greifer zu sein. (D) Querschnitt einer versiegelten Kristallisation gut wo das Reservoir ist gefüllt mit einer Erkrankung und der oberen-und enthält ein Tröpfchen aus der Protein-Probe und den Zustand komponiert. Da das Fällungsmittel in den Tropfen weniger konzentriert als in dem Zustand ist, Wasserverlust die Konzentrationen aller Komponenten in den Tropfen durch steigen während des Prozesses der Gleichgewichtherstellung durch Dampf Diffusion (sehr schematisch dargestellt durch einen Pfeil). (E) leichte Mikrographen 100 nL und (F) 200 nL Tröpfchen von Nanoliter-Dispenser mit einer Testlösung (20 V/V % Polyethylenglykol 400, 0,001 % w/V Safranin als roten Farbstoff) produziert. Die Größe und Form der Tropfen variieren je nach Chemicophysical Eigenschaften der Bedingung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Das Hauptprogramm beginnt mit der optionalen Greifer die erste Platte der Kristallisation den SBS-Deckel entfernen. Nachdem der Deckel auf den entsprechenden Speicher-Träger übertragen wurde, wird die Kristallisation Platte auf das Deck des Dispensers Nanoliter transportiert. Dann bringt der Pipettieren Arm Probenmenge für Tröpfchen die normalerweise gekühlt Reaktionscup zum Einrichten der ersten Spalte der PCR Platte erforderlich. Anschließend die wichtigsten Greifer bewegt die PCR-Platte auf das Deck der Nanoliter-Spender, die die Tröpfchen, die eine der folgenden Optionen, die vom Benutzer zu Beginn ausgewählten vorbereiten (zB. Tropfengröße). Dafür die Protein-Probe wird zuerst in die oberen-Brunnen (mit einem einzigen Satz von 8 Microsyringes und Multi-Abgabe) verzichtet, dann die Kristallisation Bedingungen entfallen auf die Protein-Tröpfchen (jede Zeile benötigt nun 8 neue Microsyringes zu vermeiden Cross-Kontamination). Nach Abschluss des Programms einrichten Tröpfchen die wichtigsten Greifer transportiert die entsprechende Platte zu Platte Sealer, dann stellt die PCR-Platte wieder in seine ursprüngliche Position (mehr Protein wird in der nächsten Spalte die PCR-Platte für die folgende Platte verzichtet werden ). Schließlich die versiegelten Kristallisation Platte bewegt sich zurück in seine ursprüngliche Position auf dem Deck: Dampf Diffusion Experimente haben bereits begonnen, in dieser Platte (Abb. 2D). Dieser Zyklus wird wiederholt, nach der Anzahl der Platten. Wenn nötig, entfernt der optionalen Greifer einen leere Tipp Rack ermöglicht den Pipettieren Arm auf weitere Tipps. Das Programm dauert 2 h und 20 min und 440 µL der Probe, einzelne Tröpfchen in 20 Platten mit 100 nL Probe + 100 nL Zustand (Abb. 2E und 2F) vorzubereiten.

Wenn Sie Nanoliter Dispenser als Stand-alone-Roboter für zwei zusätzliche Platten verwenden (siehe Schritt 1.2.3-Protokoll), die Gesamtheit der ersten Screening-Platten im Inkubator 10 ° C einstellbar (22 LMB Platten X 96 Bedingungen = 2.112 Bedingungen).

Tabelle 2 zeigt die Anforderungen für das Hauptprogramm nach Benutzerauswahl auf dem System 2.

Platten Tropfengröße (nL) Probe(n) Tipp-Anforderungen Dauer
Anzahl Typ Vol. 1 (µL) Vol. 2 (µL) 50 µL Tipps Microsyringes
10 96-well 100 240 0 80 1040 1 h 12 min
20 96-well 100 440 0 160 2080 2 h 20 min
10 96-well 100 240 240 160 2080 1 h 45 min
20 96-well 100 440 440 320 4160 3 h 05 min
10 48-well 1000 624 0 80 560 1 h 10 min
20 48-well 1000 1208 0 160 1120 2 h 16 min

Tabelle 2: Beispiele für die wichtigsten Programm-Optionen auf dem System 2 für das Einrichten von Kristallisation Tröpfchen. Die notwendige Menge an Protein-Muster, Tipps und Microsyringes variieren je nach Programm. Das Volumen der Probe "Vol. 1" (1 Tropfen) und "Vol. 2' (2 Tropfen) werden wie folgt berechnet: (8 Tipps X Volumen pro Well PCR Platte + 4 µL verloren Volumen erforderlich) x Anzahl der Kristallisation Platten + 40 µL Totvolumen in Reaktionscup. Das erforderliche Volumen pro Well PCR-Platte für 100 nL Tröpfchen in 96-Well-Kristallisation Platte ist 2 µL während 6,8 µL für 1.000 nL Tröpfchen in einer 48-Well-Platte benötigt (Totvolumen im Brunnen der PCR Platte: 0,8 µL). Ein zusätzliches Volumen der Probe wird ("verlorenen Volumen") durch Verdunstung aus der Reaktionscup und sonstige Verluste (z.B. Probe Tipps aufkleben) berücksichtigt. Zum Beispiel für 20 MRC Platten, 100 nL, 1 Tropfen-Protokoll, das Volumen der Probe erforderlich ist: (8 x 2 + 4) x 20 + 40 = 440 µL (d. h., das Äquivalent von 22 µL pro Platte). Acht Einmalspitzen 50 µL sind für jede Platte und jede Probe erforderlich. Zum Beispiel für 10 Teller, 2-Drop-Protokoll, die Anzahl der Spitzen benötigt 8 x 10 x 2 = 160 Tipps. Die Anzahl der Microsyringes wird wie folgt berechnet: (8 + Anzahl der Bedingungen pro Platte) x Anzahl der Proben x Anzahl der Platten. Zum Beispiel für 10 x 48-Well-Platten, die Anzahl der liquid Handler Tipps erforderlich ist: (8 + 48) x 1 x 10 = 560 Tipps.

3. Formulierung, Vorbereitung und Abwicklung von der 4-Eck-Lösungen

Beide Formulierungen der 4 Eck-Lösungen ("A, B, C und D") und die entsprechende Optimierung (Abbildung 3A) werden automatisch durch eine Excel-Tabelleerzeugt. Es gibt verschiedene Tabellen für unterschiedliche Anzahl von Bedingungen — im wesentlichen 24, 48 und 96 Bedingungen — und auch Tabellen um zwei unterschiedliche Bildschirme in einem einzigen Teller vorzubereiten. Man bereitet in der Regel eine Reihe von 4 x 10 mL Ecklösungen im Reagenzglas, 2 – 3 Optimierung Bildschirme hergestellt werden können, je nach Anzahl und Volumen der erforderlichen Voraussetzungen. Die Lösungen sind in Tröge gegossen, aus denen sie durch eine Spritze-basierte liquid Handler abgesaugt und später direkt in Platten (Abb. 3 b) verzichtet. Die zwei linearen Gradienten der Konzentrationen führen durch Mischen von A, B, C und D bei systematisch unterschiedlicher Verhältnisse (Abbildung 3).

Figure 3
Abbildung 3: die 4-Corner-Verfahren zur Herstellung von Optimierung Bildschirme. (A) Darstellung von zwei Gradienten von Konzentrationen über eine 96-Well-Platte-Layout. (B) der Spritze-basierte liquid Handler bereit, bereiten Sie einen Bildschirm mit 4 Spritzen in den Kopf des Roboters eingefügt. Eine Kristallisation Platte sitzt in der motorisierten SBS-Träger und die 4 ab Lösungen (A, B, C und D) haben bereits in ihren jeweiligen Tröge (die Lösungen wurden rot nur zu Demonstrationszwecken) verzichtet wurde. (C) Verhältnis der Lösungen A, B, C und D über 96 Stauseen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 3 zeigt die Anforderungen für die verfügbaren Programme für Benutzer auf der Spritze Flüssigkeit-Handler.

Plattentyp Nein. der Bedingungen Bd. in Platte (Stauseen, µL) Bd. im Trog (mL) Dauer
96-well 48 80 1.6 2 min. 5 Sek.
96-well 96 80 2.5 3 min. 50 Sek.
96-well 2 x 48 80 1.6 2 min. 50 Sek.
48-well 24 200 1.8 2 min. 25 Sek.
48-well 48 200 3 4 min. 20 Sek.

Tabelle 3: Programme auf der Spritze-basierte liquid Handler für die Zubereitung von Optimierung Bildschirme nach dem 4-Ecken-Methode zur Verfügung. Die 96-Well-Platte kann verwendet werden, um 96 - 48 Zustand Optimierung Bildschirm vorzubereiten (wenn zwei 48-Zustand Bildschirme gleichzeitig vorbereitet werden, der Roboter muss werden ausgestattet mit 8 Spritzen und 8 Tröge). Andere Programme ermöglichen die Verwendung von 48-Well Platten. Die aufgelisteten Bände in Trögen umfassen die erforderlichen Totvolumen (0,5 mL).

(4) Additiv screening

Abbildung 4 zeigt die Schritte durchführen, ein Additiv Screening starten entweder mit 96 additive Lösungen bereits in den Reservoirs der Kristallisation Platte (Protokoll 1) oder in den Vertiefungen der Low Profile-Kultur Platte verwendet als wieder verwendbare additive Bildschirm (Zelle Protokoll Nr. 2). Tabelle 4 werden die Programme auf dem Nanoliter Spender nach den zwei Arten von Protokollen zur Verfügung.

Figure 4
Abbildung 4: die zwei Arten von Protokollen für additive Screening. Die 96-Additiv-Bildschirme sind bei-20 ° c gelagert Nach Protokoll Nr. 1 der additive Bildschirm ist zunächst zu den Stauseen der Kristallisation Platten hinzugefügt (und im Idealfall so bestückt). Ein liquid Handler oder Multipipette wird verwendet, um die Bedingung in den Stauseen mit additiver Lösungen zu verzichten (das Volumen der additive Bildschirm entspricht 10 % der das Endvolumen in Stauseen: 8 µL für 80 µL Endvolumen). Nach dem Mischen der Bedingungen auf einer Mikrotestplatte Mixer (nicht gezeigt) ist Microsyringe-basierte Nanoliter Dispenser verwendet, um die Tröpfchen (Tabelle 4) einzurichten. Nach Protokoll 2 wird die additive Bildschirm erst später hinzugefügt, beim Einrichten der Kristallisation Tröpfchen. Diesmal ist der Nanoliter-Dispenser eingesetzt, um Tröpfchen mit einer zusätzlichen Komponente an Deck (wiederverwendbare Kultur Zellplatte mit dem Additiv Bildschirm) vorbereiten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protokoll Tropfengröße (nL) Streifen-Typ Probe Bd. (µL) Nein. von microsyringes Dauer
Typ Quelle von Zusatzstoffen Protein Zustand Additiv In jede Vertiefung (Streifen) Insgesamt
1 Kristallisation von 96-Well-Platte 100 100 0 2 ΜL 2 16 104 2 min
1 Kristallisation von 96-Well-Platte 200 200 0 5 ΜL 3.8 31 104 2 min. 10 Sek.
2 96-Well Zellplatte Kultur 200 200 100 5 ΜL 3.8 31 200 3 min. 45 Sek.
2 96-Well Zellplatte Kultur 500 500 100 5 ΜL 7.4 60 200 4 min. 15 Sek.

Tabelle 4: Programme zur Verfügung, auf dem Microsyringe basierende Nanoliter-Spender für additive Screening. Das erforderliche Volumen der Probe in jede Vertiefung des 8-Brunnen-Streifens wird wie folgt berechnet: Totvolumen + 12 X Tropfengröße. Es gibt 2 Arten von Streifen (2 µL und 5 µL). Die Totvolumina sind 0,8 µL für die 2 µL-Brunnen (die eigentlich 3,2 µL max. enthalten kann) und 1,4 µL für die 5 µL Brunnen (max. 7,5 µL). Das Gesamtvolumen des Proteins erforderlich ist: 8 X Volumen in Brunnen des Streifens (Round-Up-Wert). Das Totvolumen der v-förmigen Vertiefungen der 96-Well Zellplatte Kultur ist 2,5 µL. Die erforderliche Anzahl von Microsyringes variiert je nach gewählten Programms (8 + 96 = 104; oder 8 + 2 x 96 = 200).

Aufgrund der Verdünnung des Zustandes mit dem Zusatz im Protokoll 1 muss die Bedingung auf eine proportional höhere Konzentration als zunächst vorbereitet werden. Die Zunahme der Endkonzentrationen ist am leichtesten durch Reduzierung der letzten Zugabe von Wasser zu den berechneten Endvolumen erreicht. Danach geht man einfach mit dem normalen Satz von Tropfen, die den Zustand und die Probe (z.B., 100 nL Protein + 100 nL Zustand bereits mit Zusätzen vermischt) mischen. Protokoll Nr. 2 (z.B., 200 nL Protein + 200 nL Zustand + 100 nL Additiv) erleichtert das Screening bei verschiedenen Konzentrationen von Zusatzstoffen durch Variation einfach das Volumen der Additiv-Bildschirm hinzugefügt. Protokoll Nr. 2 bedeutet mehr oder weniger Verdünnung der Tropfen (die Kristallisation verändern kann).

Die liquidere Handler vom System 2 lässt sich aspirieren Sie genug Zustand in 12 Tipps und 8 Aliquote in den Stauseen einer 96-Well-Platte zu verzichten (siehe Protokoll, Schritt 2.2.2), obwohl dieser Schritt natürlich manuell mit einer Mehrkanal-Pipette ( erfolgen kann Abbildung 4). Mehrere Platten können gleichzeitig mit der gleichen Bedingung gefüllt werden, wenn Sie den liquiden Handler (additive verschiedene Bildschirmen später testen). Wenn Sie 2 Platten vorbereiten, füllen Sie die Reagenzienbehälter mit mindestens 23 mL. Bei der Vorbereitung 3 Teller füllen Sie Reagenz mindestens 31 mL ein.

(5) Kristallisation Platten und damit verbundenen Geräte

Das Design der beiden MRC sitzen-Drop Dampf Diffusion Kristallisation Platten (96-Well 2-Drop und 48-gut 1-Tropfen, Abbildung 5A und 5 b Abbildung) bietet Eigenschaften, die zuverlässige und effiziente automatisierte Kristallisation Experimente zu ermöglichen, vor allem die Kugelform der oberen-Brunnen mit einer leichten V-Form der Stauseen die genaue Dosierung und auch Zentrifugation erleichtern, wenn der Tropfen Zentrierung ist erforderlich. Darüber hinaus haben die oberen Brunnen einen Linseneffekt für optimale Ausleuchtung unter einem Stereomikroskop (das Polymer ist UV übertragbaren zur Erkennung von UV-absorbierenden oder fluoreszierende Kristalle23).

Eine benutzerdefinierte Dichtung (Abbildung 5) ermöglicht Einrichtung hängenden Tropfen Kristallisation Experimente in beide Arten von Platten mit einem Nanoliter-Dispenser (Protokolle nicht gezeigt). Schließlich haben beide MRC-Platten der gleichen Außenabmessungen und Felge. Die Felge passt in den Rillen unserer Custom-Built Kennzeichenhalter (Abbildung 5), die für manuell setzen/entfernen Dichtband ohne zu spritzen Flüssigkeiten verwendet wird.

Figure 5
Abbildung 5: The MRC Kristallisation Platten und damit verbundenen Geräte auf die LMB entwickelt. (A) A1-Ecke der 96-Well-Platte. Das Reservoir (länglich) ist auf der linken Seite des Brunnens Kristallisation, zwei kugelförmigen obere-Brunnen auf der rechten Seite. Abmessungen sind in Millimetern. (B) A1-Ecke des 48-Well-Platte. Der Stausee ist auf der rechten Seite des Brunnens (1 große obere-Na ja nur). (C) MRC hängenden Tropfen Dichtung. (D) eigene benutzerdefinierte Platte Halter. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

6. Proteinkristallen

Abbildung 6 zeigt Beispiele für nützliche Kristalle mit unserer automatisierten Protokolle erhalten.

Figure 6
Abbildung 6: leichte Mikrographen Tröpfchen mit Kristallen erhalten nach der automatisierten Protokolle. (A, B) Kristalle aus Einstiegsbild der OmpF und MreB im Teller vorbereitet mit 2 voll automatisierte Systeme (siehe Protokoll Abschnitte 1.1 und 1.2, Bedingungen: LMB07 gut A4 und LMB20 gut D12, beziehungsweise, Tropfengröße ist 100 nL Protein + 100 nL Zustand, Kunstwerk Andrzej Szewczak, LMB)24. (C, D) Bar-Domäne Kristalle vor und nach der Optimierung der Anfangsbedingungen mit der 4-Ecken-Methode (Schritt 2.1, LMB02 B6 1.000 nL + 1.000 nL, unveröffentlichte Arbeit von Leonardo Almeida-Souza, LMB). (E, F) Schwere Kette des menschlichen Dynien 1 N-terminale Domäne Kristalle vor und nach der Optimierung von den Anfangsbedingungen mit der 4-Ecken-Methode (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, dann 500 nL + 500 nL, unveröffentlichte Arbeit von Edgar Morales-Ríos, LMB). (G, H) Ergänzen Faktor D Kristalle vor und nach der Optimierung des Zustandes mit Additiven Screening (Schritt 2.2, Ausgangszustand aus eigenen benutzerdefinierten Bildschirm, 200 nL + 200 nL, additive D6 aus der 96-Konditionsbild Additiv unveröffentlichte Arbeit von Matthias Bauer LMB). (Ich, J) Virushülle Glykoprotein25 Kristalle vor und nach der Optimierung des Zustandes mit Additiven Screening (Schritt 2.3, LMB20 A2, 150 nL + 150 nL, dann 200 nL + 200nL + 100 nL Additiv E5 aus der 96-Konditionsbild Additiv unveröffentlichte Arbeit von Yorgo MODIS, University of Cambridge, UK). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

1 - Vorbereitung und Verwendung von Einstiegsbilder gespeichert in Platten

Screening-Kits sollten gemischt werden, bevor in Platten verzichtet wird, weil leichte Niederschläge oder Phase Trennung in einigen Röhren während der Lagerung auftritt. Wenn ein Bildschirm aus zwei Kits (2 x 48 Röhren) besteht, die erste Röhre des zweiten Kit in Lage E1 der der kühlenden Träger steht. Wenn ein Bildschirm von 4 Kits (4 x 24 Röhren) besteht, die erste Röhre des zweiten Kit befindet sich im Ort C1, die erste Röhre des dritten Kit befindet sich im Ort E1 und die erste Röhre des vierten Kit befindet sich im Ort G1. Beim Einsetzen der Röhren in ihrem Kühlsystem Träger, sind Deckel auf einem Tablett nach dem standard 96-Well-Querformat-Layout platziert. Da gut Zahlen auf die Deckel von den Herstellern angegeben sind, ist dadurch die Gegenprüfung wenn alle Röhren in der richtigen Reihenfolge platziert wurden. Dies hilft auch, um die richtigen Deckel auf die Rohre zu ersetzen, wenn eine geringere Anzahl von Platten zu füllen.

Wir speichern die vorgefüllten Platten bei 10 ° C, einen Kompromiss zu vermeiden, Einfrieren und Lagerung bei 4 ° C, die Verschlechterung der Bedingungen und Probleme mit Abdichtung führen kann. Platten sind lagerfähig bis zu mehreren Monaten mit normalerweise keine spürbaren Kondensation auf der Innenseite der Dichtung. Dies gilt weniger für LMB05, LMB06, LMB09 und LMB10 Platten wie diese Bedingungen mit relativ hohen Konzentrationen der flüchtigen Reagenzien (Tabelle 1) enthalten. Kleine Menge von Kondenswasser an der Innenseite der Dichtung reduziert Abdichtung Effizienz und Kreuzkontaminationen zwischen Brunnen und Entsiegelung die Platten verursachen kann. Um Hilfe bei der Kondensation während der ersten Abkühlung zu verhindern, können Platten zuerst aus dem Karussell in einer isolierten Picknick Kühler übertragen werden, die über Nacht in einen Kühlraum von 4 ° C gespeichert ist. Die sehr langsame Abkühlung minimiert die Entwicklung des Temperaturgradienten innerhalb der versiegelten Brunnen und somit reduziert Kondenswasser insgesamt15. Sobald die Platten im Inkubator 10 ° C gelagert sind, wird darüber hinaus ein eigene benutzerdefinierter SBS Polystyrol Deckel auf die Platte am oberen Rand jeder Stapel (nicht dargestellt) gelegt.

Die Gesamtheit unserer Pre-filled Platten kann als eine große Einstiegsbild gegen eine neuartige, wasserlöslich, Protein-Probe verwendet werden. Alternativ können weniger Platten ausgewählt werden, um spezifische Anforderungen zu erfüllen. Z. B. LMB15 und LMB19 sind Bildschirme formuliert speziell für Membran-Protein Proben26,27, oder LMB20 ist ein Bildschirm mit Heavy-Atome zur Erleichterung der experimentellen Ausstieg von Beugung Daten28 formuliert (siehe auch : Formulierung der MORPHEUS Protein Kristallisation Bildschirme).

2. Einrichten der Kristallisation Tröpfchen

Bei der Verwendung des Systems 2 sollten screening-Kits mit erheblichen Mengen von flüchtigen Reagenzien zuerst verarbeitet werden. Dies vermeidet Kondensatbildung auf der SBS-Deckel, die Deckel Handling und Platte Abdichtung beeinträchtigen könnten. Ein SBS-Deckel hat ein bisschen Abstand wenn oben auf einen Teller, weshalb sie ursprünglich ausgerichtet werden müssen (siehe Protokoll, Schritt 1.2.6). Das Protein Totvolumina in den Vertiefungen der PCR Platte sind relativ großzügig (0,8 µL, siehe Legende der Tabelle 2). Beachten Sie, dass ebenso großzügige Totvolumina beschäftigt sind, bei den Nanoliter Spender individuell mit Protein in 8-Well Streifen (Tabelle 4). Kleinere Totvolumina arbeiten kann, aber einige Proben an die Tipps halten, Kalibrierung eines Roboters kann etwas ungenau geworden, der Raum wärmer als üblich, etc.sein kann. Alle führen zum Beispiel Verluste von der großzügigen Totvolumina abgedeckt um den Ansatz zu konsolidieren.

Jüngste Entwicklungen konnte weitere Miniaturisierung von Experimenten und damit das Volumen der Probe erforderlich für screening-Kristallisation Bedingungen deutlich reduziert werden durch die Integration der entsprechenden Technologie29,30 . Allerdings benötigen einige Aspekte der weiteren Miniaturisierung reiflicher Überlegung, wie die Verdunstung der Tröpfchen31 und die Manipulation der Mikrokristalle32.

Zentrifugation der Platte (2.000 u/min, 1 min) konnte schließlich als routinemäßige letzter Schritt integriert werden, beim Einrichten von Kristallisation Tröpfchen (in sphärische oberen-Brunnen). Eine einheitlichere Größe und Form von Tröpfchen durch Zentrifugation können Reproduzierbarkeit Fragen33,34verringern. Sicherlich werden zentrierte Tropfen erleichtern die spätere Bewertung der Experimente unter Verwendung eines Mikroskops, da die erforderliche Brennweite über die gesamte Platte ähnlich sein werden.

3. Vorteile der 4-Ecken-Methode

Der wichtigste Vorteil des 4-Ecken-Methode ist seine Einfachheit, die Fehler minimiert und ermöglicht einfache automatisierte Protokolle. Beispielsweise werden die 4 Eck-Lösungen immer auf dem Deck eines flüssigen Handlers nach das gleiche Layout platziert werden. Alle Programme basieren auch auf festen Verhältnisse zwischen den Lösungen (Abbildung 3).
Manuelle Erstellung von 4 Ecklösungen ist bevorzugt, automatische Behandlung von Lösungen bei hohen Konzentrationen die hochviskosen sein kann. Relativ schnell und präzise Absaugung/Abgabe ist dann auf die meisten Arten von liquid Handler mit Mindestanforderungen zur Optimierung der flüssigen Klassen möglich. Jedoch möglicherweise einige Eck-Lösungen noch zu zäh für einen Roboter mit einer Flüssigkeit-System, effizient zu arbeiten. Deshalb entschieden wir uns für einen flüssigen Handler mit positive Verschiebung (Abb. 3 b).

Zusätzlich zu den 2 linearen Gradienten der Konzentrationen kann eine dritte Komponente (d. h., eine Reihe von Puffern/Zusätze) in einer konstanten Konzentration auf bequeme Weise getestet werden. Hierzu wird zunächst eine relativ große Datenmenge einen Kernsatz von Ecklösungen in einer entsprechend höheren Konzentration, ausgenommen die Komponente variiert werden, vorbereitet. Dann Stammlösungen einschließlich dieser Komponente wird hinzugefügt, um die Endkonzentrationen anzupassen. Z. B. sind 50 mL eines Satzes von 4 Ecklösungen bei 10 % höheren Konzentrationen als ursprünglich bereit. Dieser Kernsatz wird in 5 kleinere Teilmengen von 4 aufgeteilt. Schließlich wird jede Teilmenge 10 % im Volumen von verschiedenen Puffer-pH-Lösungen hinzugefügt.

(4) Formate und Arten von Additiven Bildschirme

Die Bildschirme werden normalerweise bei-20 ° C (Abbildung 4) gespeichert, da sie nicht regelmäßig verwendet werden und enthalten flüchtige/instabile Verbindungen. Die Verwendung eines gefrorenen Additiv Screen gespeichert in einem tiefen Brunnen Block (1 mL in Brunnen) muss frühzeitig geplant werden, weil es dauert 12-24 Stunden für die additive Lösungen vollständig bei Raumtemperatur auftauen. Auch eine Vielzahl von Nutzern teilen demselben Additiven Bildschirm verursachen Probleme mit Cross-Kontamination. Zu guter Letzt macht die Höhe der Tiefbrunnen Blöcke sie ungeeignet für die meisten Nanoliter-Dispenser. Als günstige Lösung für diese Probleme zu umgehen sollte der Bildschirm aus dem Tiefbrunnen Block auf flache Teller (Abbildung 4) übertragen werden.

In der Vergangenheit wurden additive Bildschirme umfasst eine Vielzahl von einzelnen Reagenzien (mit einzelnen Konzentrationen) sehr beliebt35,36. Jedoch haben andere Arten von Additiven Bildschirmen entwickelt worden, die Mischungen von Zusatzstoffen37 oder eine reduzierte Anzahl von einzelnen Zusatzstoffe finden Sie unter verschiedenen Konzentrationen38zu integrieren. Schließlich ist ein ergänzender Ansatz zur Untersuchung der Wirkung von Zusatzstoffen auf die Proben vor der Kristallisation39,40.

5. weitere Überlegungen

Gute Praxis: Die meisten Bildschirme schädliche oder sogar giftige Substanzen enthalten und daher muss ausreichenden Personenschutz eingesetzt werden, während die Protokolle. Ebenso kann bewegliche Teile der Roboter zu Verletzungen führen, vor allem wenn Sie versuchen, manuell einzugreifen, während ein Programm ausgeführt wird (obwohl die meisten der Roboter Not-Halt-Taste/System verfügen). Aufgrund der technischen Komplexität beteiligt, regelmäßige Überprüfung der Roboter, Bildschirme und Programme mit zuvor gekennzeichnet Prüfmuster für anhaltend hohe Reproduzierbarkeit von Bedeutung sind.

Durchsatz: Als Anhaltspunkt werden zwischen 4.000 bis 8.000 LMB Platten jährlich mit dem System 1 (und später Beschäftigte von Benutzern für ersten Screening) produziert. Es ist nicht an Lager angepasst eine große Menge von Pre-filled Platten bei 10 ° C wird der erwartete Umsatz nach 4-5 Monate, einige Bedingungen viel niedriger, als startet zu verschlechtern und zu verdampfen. Verschiedene Ansätze zur Automatisierungsprotokolle sind für kleine bis mittelgroße Labors41umgesetzt worden.

Speichern und Bewertung von Experimenten: Nach der Vorbereitung der Tröpfchen, sind Platten auf vibrationsarmen Regale in einem Raum bei 4 oder 18 ° C mit streng kontrollierter Temperatur (+/-0,5 ° C maximale Abweichung) gespeichert. Experimente sind mit kaltem Licht Quelle Mikroskope beurteilt. Verschiedene automatisierte bildgebende Systeme sind kommerziell verfügbar, jedoch sollte man sorgfältig alle Aspekte zu berücksichtigen: die Geschwindigkeit erforderlich, um eine Platte Scannen ausreichen für hohen Durchsatz? Werden andere Objekte als Kristalle mit Autofokus stören? Wird die resultierende Qualität der Bilder vor Ort sehr kleine Kristalle (vor allem um den Rand der Tröpfchen) ausreichen? 42 , 43 , 44

Vergleich der Kristallisation Bedingungen: Nach sorgfältigen Untersuchungen über die Natur der ursprünglich erhaltenen Kristalle kann man Trends und Gemeinsamkeiten über Bedingungen mit der LMB Bildschirm Datenbank oder die C6 Webtool45analysieren.

Disclosures

Wir erklären hiermit ein widersprüchliche kommerzielles Interesse, da LifeArc die folgenden Elemente vertreibt: 96 - und 48-Brunnen MRC-Platten, MRC hängenden Tropfen Dichtung, MORPHEUS, Pi, ANGSTROM und LMB Kristallisation Bildschirme.

Acknowledgments

Die MRC-LMB-Kristallisation-Anlage wird freundlicherweise unterstützt vom Medical Research Council (UK). Mitgliedern des LMB für ihre Unterstützung danken wir: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van Den HNO und Pat Edwards (strukturelle Studien), Steve Scotcher und die anderen Mitglieder der mechanischen Werkstatt, Neil Grant und Jo Westmoreland (Sehhilfen), Paul Hart und Tom Pratt (es). Wir möchten auch für Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart und Heather Ringrose (Hamilton Robotics, UK), Paul Thaw, Robert Lewis und Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Schweiz), George Stephens und Donald Ogg (Alphabiotech, danke! (UK), Neil Williams (Markem Imaje, UK) und Graham Harris (The Cleveland Agency) für technische Hilfe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Robots
Freedom EVO® Tecan n/a Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0. 
Microlab® STAR™ Hamilton n/a Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.
Mosquito® TTP Labtech n/a Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422. 
Dragonfly® TTP Labtech n/a Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196. 
Adhesive plate sealer Brandel n/a Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).
Inkjet printer 9232 Markem-Imaje n/a Integrated to System 1. Touchscreen interface.
Crystallization screens
Crystal Screen™ 1 Hampton Research HR2-110 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Crystal Screen 2™ Hampton Research HR2-112 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Wizard™ Classic 1 Rigaku 1009530 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Wizard™ Classic 2 Rigaku 1009531 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Grid Screen™ Ammonium Sulfate Hampton Research HR2-211 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG/LiCl Hampton Research HR2-217 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Quick Screen™ Hampton Research HR2-221 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ Sodium Chloride Hampton Research HR2-219 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG 6000 Hampton Research HR2-213 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
Grid Screen™ MPD Hampton Research HR2-215 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
MemFac™ Hampton Research HR2-114 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
PEG/Ion™ Hampton Research HR2-126 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Natrix™ Hampton Research HR2-116 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Crystal Screen Lite™ Hampton Research HR2-128 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Custom Lite screen Molecular Dimensions Ltd n/a Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Wizard™ Cryo 1 Rigaku 1009536 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
Wizard™ Cryo 2 Rigaku 1009537 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
JBS1 JenaBioScience CS-101L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS2 JenaBioScience CS-102L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS3 JenaBioScience CS-103L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS4 JenaBioScience CS-104L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS5 JenaBioScience CS-105L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS6 JenaBioScience CS-106L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS7 JenaBioScience CS-107L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS8 JenaBioScience CS-108L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS9 JenaBioScience CS-109L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
JBS10 JenaBioScience CS-110L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Index™ Hampton Research HR2-144 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13
SaltRX™ 1 Hampton Research HR2-107 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
SaltRX™ 2 Hampton Research HR2-109 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
MemStar™ Molecular Dimensions Ltd MD1-21 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
MemSys™ Molecular Dimensions Ltd MD1-25 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
JCSG-plus™ Suite Qiagen 130720 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16
MORPHEUS® screen Molecular Dimensions Ltd MD1-46 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17
Pi minimal screen JenaBioScience CS-127 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18
Pi-PEG screen JenaBioScience CS-128 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19
MORPHEUS® II screen Molecular Dimensions Ltd MD1-91 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20
LMB crystallization screen™ Molecular Dimensions Ltd MD1-98 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21
Additive screens
HT additive screen Hampton Research HR2-138 Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen Molecular Dimensions Ltd MD1-93-500 Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well).
ANGSTROM additive screen™  Molecular Dimensions Ltd MD1-100 Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen Molecular Dimensions Ltd MD1-93 Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well).
ANGSTROM additive screen™  Molecular Dimensions Ltd MD1-100-FX Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well).
HIPPOCRATES additive screen Molecular Dimensions Ltd n/a 48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III).
Other consumables
96-well MRC 2-drop plate Swissci MRC 96T-UVP Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80  µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.
48-well MRC 1-drop plate  ('MAXI plate') Swissci MMX01-UVP  Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200  µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible.
MRC hanging drop seal Swissci n/a Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.
Adhesive sealing tape Hampton Research HR4-50 3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing.
Adhesive aluminium sheet Beckman Coulter 538619 Used to reseal additive screens.
Ink cartridge Markem-Imaje 9651 System 1 (inkjet printer).
Solvent cartridge Markem-Imaje 8652 System 1 (inkjet printer).
50 µL tips  Hamilton 235947 System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks.
Reagent container Hamilton 194052 Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols. 
PCR plate Thermo Scientific™ AB-2150 System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.
microsyringes TTP Labtech 4150-03020 Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing).
strip-holder block TTP Labtech 3019-05013 SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'.
2 µL 8-well strip TTP Labtech 4150-03110 Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL.
5 µL 8-well strip TTP Labtech 4150-03100 Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL.
5 mL syringes TTP Labtech 4150-07100 Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100.
Troughs/Reservoirs TTP Labtech 4150-07103 Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50.
Orbital microplate shaker CamLab Limited n/a Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).
Microplate mixer TTP Labtech 3121-01015 MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.

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References

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Gorrec, F., Löwe, J. Automated… More

Gorrec, F., Löwe, J. Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology. J. Vis. Exp. (131), e55790, doi:10.3791/55790 (2018).

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