Summary

Uso di Immunolabeling per analizzare i microtubuli stabili, dinamici e nascenti nell'embrione di pesce zebra

Published: September 20, 2017
doi:

Summary

Immunolabeling metodi per analizzare popolazioni distinte dei microtubuli in zebrafish sviluppo del cervello sono descritti qui, che sono ampiamente applicabili ad altri tessuti. Il primo protocollo delinea un metodo ottimizzato per immunolabeling stabile e dinamica dei microtubuli. Il secondo protocollo fornisce un metodo per immagine e quantificare i microtubuli nascenti in particolare.

Abstract

Microtubuli (MTs) sono strutture dinamiche e fragile che stanno sfida a immagine in vivo, in particolare in embrioni vertebrati. Immunolabeling metodi sono descritte qui per analizzare popolazioni distinte di MTs nel tubo neurale in via di sviluppo dell’embrione di zebrafish. Mentre l’attenzione è il tessuto neurale, questa metodologia è ampiamente applicabile ad altri tessuti. Le procedure sono ottimizzate per presto ad metà-somitogenesis-stage embrioni (1 somite a 12 somiti), tuttavia possono essere adattati ad una gamma di altre fasi con relativamente piccoli aggiustamenti. Il primo protocollo fornisce un metodo per valutare la distribuzione spaziale delle MTs stabile e dinamico ed eseguire un’analisi quantitativa di queste popolazioni con il software di elaborazione delle immagini. Questo approccio si integra con gli strumenti esistenti per immagine microtubule dynamics e distribuzione in tempo reale, utilizza linee transgeniche o espressione transitoria di costrutti con tag. Infatti, tali strumenti sono molto utili, tuttavia non facilmente distinguere MTs dinamica e stabile. La capacità di immagine e analizzare queste popolazioni distinte microtubule ha implicazioni importanti per la comprensione dei meccanismi alla base di polarizzazione cellulare e morfogenesi. Il secondo protocollo delinea una tecnica per analizzare in particolare il nascente MTs. Questa operazione viene eseguita mediante l’acquisizione le proprietà di crescita de novo di MTs nel tempo, seguendo la depolimerizzazione dei microtubuli con il nocodazole di droga e un periodo di recupero dopo interruzione del farmaco. Questa tecnica non è ancora stata applicata allo studio di MTs in embrioni di zebrafish, ma è un saggio prezioso per indagare la funzione in vivo delle proteine implicate in microtubuli.

Introduction

Microtubuli (MTs) sono polimeri di α – e β-tubulina che assemblare in protofilamenti lineari, molte delle quali si combinano per formare un tubo cavo1,2. Le MT sono strutture polarizzate, con rapida crescita plus estremità ed a crescita lenta meno le estremità che sono ancorate al centrosoma o altri di organizzazione dei microtubuli (MTOC) centro3. De novo Formazione di MT è iniziata da nucleazione presso l’anello di γ-tubulina complessa (γ-TURC), che fornisce un modello per MT montaggio4. In ogni cellula, due popolazioni di MTs possono essere distinte che girano sopra ai tassi differenti. MTs dinamico esplorare il loro ambiente cellulare passando tra le diverse fasi di crescita e di ritiro in un processo noto come instabilità dinamica5. A differenza di dinamica MTs, MTs stabile sono non-crescita e hanno un’emivita più lunga rispetto a dinamiche MTs6.

Decenni di ricerca in biologia cellulare ha fornito una sofisticata gamma di strumenti per studiare la funzione e la struttura MT e ha provocato un grande corpo di conoscenza su questi elementi del citoscheletro. Per esempio, MTs gioca un ruolo centrale nella creazione e mantenimento della polarità cellulare, che è attribuibile non solo alla loro polarità intrinseca, ma anche per la distribuzione subcellulare differenziale della scuderia contro dinamico MTs7, 8. al contrario, molto meno è capito circa MT architettura e funzione in ambienti (3D) tridimensionale più complessi, come l’embrione dei vertebrati, in parte dovuto la sfida di imaging del citoscheletro MT ad alta risoluzione. Nonostante questa limitazione, la più recente generazione di transgenici esprimenti GFP linee quell’etichetta MTs o transitoria espressione di marcatori di MT fluorescente-Tag ha aumentato la nostra comprensione dei cambiamenti dinamici che MTs subiscono e loro cellulare e ruolo dello sviluppo nell’embrione di zebrafish. L’intera rete MT può essere imaged in linee transgeniche in cui tubulina è sia direttamente con etichetta9 o tubulina polimeri sono etichettati indirettamente utilizzando proteine associate MT Doublecortin-like-chinasi (Dclk) o Ensconsin (EMTB)10, 11. Altre linee (e costrutti) sono stati generati che consentire la valutazione della polarità intrinseca MT identificando specificamente MT più finisce o ancorato centrosoma meno estremità11,12,13, 14. la potenza di questi strumenti si trova nella capacità di studiare la dinamica di MT in diretta, lo sviluppo di organismi. Tali studi hanno rivelato, ad esempio, la distribuzione spaziale e dinamica di MTs in popolazioni di cellule specifiche, l’orientamento di mitotic mandrini in tessuti in fase di morfogenesi (un indicatore del piano di divisione delle cellule), la polarità del polimero MT per quanto riguarda processi quali allungamento delle cellule e la migrazione e tasso di crescita di MT determinata dalla cometa velocità9,13,15. La limitazione di questi strumenti è che essi non prontamente discriminano tra popolazioni MT stabile e dinamici.

Attingendo alla letteratura biologia cellulare ricca, immunolabeling metodi di immagine stabile e dinamico MTs nell’embrione di zebrafish sono descritti qui, che sono complementari all’uso di linee transgeniche. L’uso molto diffuso di tali metodi immunolabeling in zebrafish è stata un po’ ostacolata dalla difficoltà nel preservare l’integrità MT durante la procedura di fissazione. 1 protocollo delinea un metodo ottimizzato per immunolabeling totale, dinamico, e stabile MTs in sezioni trasversali del hindbrain zebrafish in via di sviluppo. Inoltre, un metodo diretto utilizzando commercialmente disponibile software è descritto per quantificare queste popolazioni di MT. MTs stabile si distinguono da MTs dinamico basato su diverse modificazioni post-traduzionali di α-tubulina, quali acetilazione e detyrosination, che si accumulano su MTs stabile nel tempo16,17. Nell’embrione di zebrafish, acetilazione si verifica su MTs ciliare e axonal ma non su stabile interfase MTs18, limitando l’utilità di questo indicatore a un sottoinsieme di MTs stabilizzato. Al contrario, detyrosination sembra verificarsi su tutte le MTs stabile nel quartiere di embrione di zebrafish18. Questa modificazione post-traduzionale espone l’acido glutammico carbossi-terminale di α-tubulina (detyrosinated tubulina)18 e può essere rilevata utilizzando anti-Glu-tubulina19. Anche se detyrosination si verifica preferenzialmente su MTs stabile, la prova sperimentale indica che questa modificazione post-traduzionale è un risultato di, piuttosto che una causa di, MT stabilità16. La popolazione di reciproco MT, composta da MTs dinamico, si distingue usando un anticorpo, anti-Tyr-tubulina, che riconosce specificamente la forma di termine di α-tubulina19. A seguito di immunolabeling con questi marcatori e imaging confocale, l’analisi quantitativa di MTs (lunghezza, numero e abbondanza relativa) può essere eseguita in regioni definite del tubo neurale in via di sviluppo. Qui vi attende un metodo semplificato per l’esecuzione di questa analisi utilizzando software di elaborazione delle immagini 3D. Questo metodo può essere applicato per rispondere alle domande per quanto riguarda la morfogenesi e l’istituzione o la maturazione delle cellule polarità20. Infatti, l’elaborazione di matrici polarizzate di MTs stabile accompagna molti eventi inerenti allo sviluppo, tra cui fotorecettore morfogenesi21, epithelialization delle cellule nello sviluppo del tubo neurale18 e assone formazione8.

Protocollo n. 2 descrive un adattamento in vivo di un’analisi di biologia delle cellule per analizzare MTs durante il loro montaggio fase (nucleazione/anchorage e crescita)22,23. Nascente MTs sono nucleate presso il centrosoma e successivamente ancorati alla subdistal appendici della madre Centriolo23. È descritto un metodo per analizzare la nascente ricrescita MT seguendo la depolimerizzazione. Questo protocollo fornisce dettagli sul trattamento nocodazole a depolymerize MTs, la procedura di washout di droga e il periodo di recupero post-trattamento. MT. re-crescita viene monitorata ad intervalli regolariwashout post s da immunolabeling con marcatori per MTs totale (anti β-tubulina) al fianco di marcatori per il centrosoma (anti γ-tubulina) e nucleo (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), secondo le procedure generali descritte nel protocollo n. 1. Il passo di depolimerizzazione MT del presente protocollo è essenziale in quanto permette la valutazione della crescita MT de novo piuttosto che estensione di preesistenza MTs. Questa tecnica è quindi distinta da altre procedure pubblicate per misurare i tassi di crescita di MT (in assenza di depolimerizzazione) utilizzando un marcatore con punta plus come fine proteina 3 fusa alla proteina fluorescente verde (EB3-GFP), come mostrato in Tran et al., 201211. Inoltre, questo test è particolarmente utile per l’analisi di embrioni difettosi in de novo MT assieme, come ad esempio i mutanti NEDD1 precedentemente segnalati in cui il reclutamento di γ-tubulina per il centrosoma è alterato, conseguente incompleta formazione del tubo neurale e difetti di un neurone24.

Protocol

Dichiarazione etica: le procedure descritte di seguito Segui l’Università delle linee guida di cura degli animali di Maryland Baltimore County. 1. analisi di stabile e dinamico MTs utilizzando Immunolabeling (protocollo 1) dechorionation manuale degli embrioni prima della fissazione ottenere appena generato embrioni versando l’acqua in eccesso di sistema e quindi raccogliere embrioni rimanenti in una capsula di Petri di plastica (vedere Tabella mat…

Representative Results

Analisi di MTs stabile e dinamico utilizzando immunolabelingNel protocollo n. 1, la distribuzione delle sub-popolazioni MT durante prima (chiglia neurale) e fine (neurali asta) fasi di sviluppo del tubo neurale sono rivelate, utilizzando Glu-tubulina e Tyr-tubulina come marcatori per MTs stabile e dinamico, rispettivamente. MTs dinamico predominano in del hindbrain nella fase di chiglia neurale (4-5 somiti) (Figura 2<stro…

Discussion

Attualmente ci sono molti metodi per imaging dinamiche MT nello sviluppo iniziale di zebrafish, che vanno da formazione immagine diretta di molecole con tag a immunolabeling di fisso tessuto11,12,13,14. Anche se MTs in una singola cella può esistere in stati stabili o dinamici, epithelialization è un processo in cui MTs sono progressivamente stabilizzate nel corso del tempo. Usando gli indica…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il microscopio confocale è stato acquistato con fondi dal US National Science Foundation (NSF), grant #DBI-0722569. La ricerca è stata sostenuta da l’US National istituti di salute/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS) grant #GM085290 e U.S. dipartimento della difesa (DOD) grant n #W81XWH-16-1-0466 assegnato a R.M. Brewster. E. Vital è stato sostenuto da una sovvenzione per UMBC da Howard Hughes Medical Institute attraverso il pre-college e il programma di educazione scientifica dello studente non laureato, concedere #52008090. S.P. Brown è stato sostenuto da un US Dipartimento di educazione GAANN Fellowship, una borsa di studio Meyerhoff finanziato dalla sovvenzione di NIH/NIGMS #GM055036 e un assistentato di ricerca finanziato da l’US DOD grant n #W81XWH-16-1-0466.

Materials

Low Melting Point Agarose IBI scientific IB70050 Only used for embedding.

Prepare 4% LMP agarose
by heating a solution of  4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave
until polymerized. Keep warm on a 50 ˚C hot plate with the cap secured
Agarose Used to treat petridishes.   Prepare 1% agarose
by heating a solution of  1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave
until polymerized. 
Nocodazole Sigma 487928-10MG Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots.  Store at -20 ˚C.
8% Formaldehyde Electron Microscopy Sciences 157-8-100 Aliquot and store at -20 ˚C.
Kpipes Sigma P7643
NaCl Sigma S7653
Tris-HCl Sigma T3253-500G
KCl Sigma P9333-500G
CaCl2·2H2O Sigma C5080
NP-40 American Bioanalyticals AB01424
EGTA Sigma E3889-25G
MgCl2 Sigma M2670-500G
Normal Goat Serum Millipore S26-100ml Aliquot and store at -20 ˚C.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BP1605
Triton-x American Bioanalyticals AB02025
Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus) Sigma P5147-1G make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 ˚C.
Anti-Fade mounting medium Invitrogen P10144
DAPI Invitrogen D1306 Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 µl DAPI stock  with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 ˚C for months.
Mouse anti-β-tubulin Developmental studies Hybridoma Bank E7 1/200
Rabbit anti-γ-tubulin Genetex GTX113286 1/500
Rabbit anti-α-tubulin Genetex GTX108784 1/1000*
Rabbit anti-detyrosinated-tubulin Millipore AB3201 1/200-1/1000*  Titrate antibody with first use of new lot.
Rabbit anti-tyrosinated-tubulin Millipore ABT171 1/500
Mouse anti-centrin Millipore 04-1624 1/1000
Goat 488 anti-rabbit Thermofisher A11008 1/500
Goat 594 anti-rabbit Thermofisher A11012 1/500
Goat 594 anti-mouse Thermofisher A11005 1/500
Goat 488 anti-mouse Thermofisher A11001 1/500
Vibratome Vibratome 1500
Forceps World Precision Instruments 555227F
100 mm petri dish Cell treat 229693
35 mm petri dish Cell treat 229638
50 ml falcon tube Fisher 14-432-22
Woven nylon mesh 70 um Amazon.com B0043D1SZG 
Micropipette Gilson F123602
Glass pipette Fisher NC-999363-9
Aquarium sealant Amazon.com, by MarineLand Silicone Sealer 1 oz (Tube) 
Ring stand Fisher 14-675BO
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID Cole-Parmer WU-06417-21
Modeling clay Amazon.com Sargent Art 22-4000 Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice
Clamp Fisher 02-215-466
60ml syringe Fisher 14-820-11
Embryo medium (E3) 34.8 g NaCl
1.6 g KCl
5.8 g CaCl2·2H2O
9.78 g MgCl2·6H2O

To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. 
Blocking Solution 50 ml TBS-NP-40
2.5 ml normal goat serum
1 g BSA
625 µl Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7.6) 155 mM NaCl
10 mM Tris HCl
0.1% NP-40
2x MAB (pH6.4) 160 mM KPIPES
10 mM EGTA
2 mM MgCl2
Commercial 3-D Image processing Software PerkinElmer Volocity (V 6.2)
Dry block heater  VWR 12621-108 Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.
Dissecting Microscope Leica MZ12
Confocal Microscope Leica SP5
Flat embedding mold emsdiasum.com BEEM 70904-01
Public domain image processing software NIH ImageJ (V 1.5)
* Success varies by lot number

References

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Cite This Article
McFarland, R. J., Brown, S. P., Vital, E., Werner, J. M., Brewster, R. M. Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (127), e55792, doi:10.3791/55792 (2017).

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