Summary

Utilisation d’immunomarquage pour analyser des Microtubules stables et dynamiques naissants dans l’embryon de poisson zèbre

Published: September 20, 2017
doi:

Summary

Immunomarquage des méthodes pour analyser des populations distinctes des microtubules dans le cerveau en développement du poisson zèbre sont décrites ici, qui sont largement applicables à d’autres tissus. Le premier protocole décrit une méthode optimisée d’immunomarquage des microtubules stables et dynamiques. Le deuxième protocole fournit une méthode pour l’image et de quantifier les microtubules naissants spécifiquement.

Abstract

Les microtubules (MTs) sont des structures dynamiques et fragiles qui sont difficiles à image in vivo, en particulier chez les embryons de vertébrés. Immunomarquage méthodes sont décrites ici pour analyser des populations distinctes de MTs dans le développement du tube neural de l’embryon de poisson zèbre. Alors que l’accent est mis sur les tissus nerveux, cette méthodologie est largement applicable à d’autres tissus. Les procédures sont optimisés pour les dès le début à mi-somitogenèse-stade embryons (1 somite à 12 somites), cependant ils peuvent être adaptés à un éventail d’autres stades avec des ajustements relativement mineurs. Le premier protocole fournit une méthode pour évaluer la distribution spatiale des MTs stables et dynamiques et d’effectuer une analyse quantitative de ces populations avec logiciel de traitement d’image. Cette approche vient compléter les outils existants à la dynamique des microtubules image et de la distribution en temps réel, en utilise des lignées transgéniques ou expression transitoire de constructions étiquetées. En effet, ces outils sont très utiles, mais ils ne distinguent pas facilement MTs dynamiques et stables. La capacité de l’image et d’analyser ces populations distinctes de microtubules a des implications importantes pour la compréhension des mécanismes qui sous-tendent la polarisation de la cellule et la morphogenèse. Le deuxième protocole décrit une technique pour analyser spécifiquement les MTs naissantes. Ceci est accompli en capturant les propriétés de croissance de novo de MTs au fil du temps, suite à la dépolymérisation des microtubules avec la nocodazole de drogue et une période de récupération après le lavage de la drogue. Cette technique n’a pas encore été appliquée à l’étude des MTs chez les embryons de poisson-zèbre, mais est un test utile pour étudier la fonction in vivo des protéines impliquées dans l’assemblage des microtubules.

Introduction

Les microtubules (MTs) sont des polymères de α – et β-tubuline qui s’assemble en protofilaments linéaire, dont plusieurs se combinent pour former un tube creux1,2. MTs sont des structures polarisées, avec l’essor de plus fins et croissance lente moins les extrémités qui sont ancrées à centrosome ou autres organisation des microtubules center (MTOC)3. De novo Formation de MT est initiée par nucléation à l’anneau γ-tubuline complexe (γ-TURC), qui fournit un modèle pour les MT Assemblée4. Dans une cellule donnée, deux populations de MTs se distinguées ce tour-ci au fil à des vitesses différentes. Dynamiques MTs explorent leur environnement cellulaire par la commutation entre les phases de croissance et de rétrécissement dans un processus appelé instabilité dynamique5. Contrairement aux MTs dynamiques, stables MTs sont non productrices et ont une demi-vie plus longue que la dynamique MTs6.

Des décennies de recherche en biologie cellulaire a fourni une sophistiqué panoplie d’outils pour étudier la fonction et la structure de la MT et a donné lieu à un vaste corpus de connaissances sur ces éléments du cytosquelette. Par exemple, MTs jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien de la polarité cellulaire, qui est attribuable non seulement à leur polarité intrinsèque, mais aussi à la distribution subcellulaire différentielle des stable versus dynamique MTs7, 8. en revanche, beaucoup moins est entendu sur l’architecture de MT et de fonctionner dans des environnements de (3-d) en trois dimensions plus complexes, tels que les embryons de vertébrés, en partie en raison de relever le défi de l’imagerie du cytosquelette MT à haute résolution. Malgré cette limitation, la récente génération de GFP-transgénique exprimant les lignes que MTs de l’étiquette ou une expression transitoire de marqueurs de MT fluorescent-étiquetées a augmenté notre compréhension des changements dynamiques qui subissent une MTs et leur cellulaire et rôle de développement de l’embryon de poisson zèbre. L’ensemble du réseau MT peut être photographié sur des lignées transgéniques dans laquelle tubuline est soit directement marqué9 ou tubuline polymères sont indirectement étiquetés à l’aide de protéines associées à la MT Doublecortin-like-kinase (Dclk) ou Ensconsin (EMTB)10, 11. Autres lignes (et constructions) ont été générées qui permet d’évaluer des polarité intrinsèque MT par marquage spécifiquement MT plus fins ou ancrées à un centrosome moins les extrémités11,12,13, 14. la puissance de ces outils réside dans la possibilité d’étudier la dynamique de la MT en direct, les organismes de développement. Ces études ont révélé, par exemple, la distribution spatiale et dynamique de MTs dans les populations de cellules spécifiques, l’orientation du mitotique broches en tissus subissant la morphogenèse (indicateur du plan de division cellulaire), la polarité du polymère MT en ce qui concerne les processus tels que l’élongation cellulaire et de la migration et les taux de croissance MT déterminé par comète vitesse9,13,15. La limitation de ces outils est qu’ils ne sont pas facilement discriminatoires entre les populations stables et dynamiques de MT.

Puisant dans la littérature de biologie cellulaire riche, méthodes d’immunomarquage à l’image des MTs stables et dynamiques dans l’embryon de poisson zèbre sont décrites ici, qui sont complémentaires à l’usage des lignées transgéniques. La généralisation de ces méthodes d’immunomarquage dans le poisson-zèbre a été quelque peu gênée par la difficulté à préserver l’intégrité de la MT au cours de la procédure de fixation. 1 Protocole décrit une méthode optimisée d’immunomarquage total, dynamique, et MTs stables dans les sections du développement postérieur de poisson-zèbre efficaces. En outre, une méthode simple utilisant commercialement logiciels disponibles sont décrite afin de quantifier ces populations de MT. MTs stables sont distinguent des MTs dynamiques basés sur plusieurs modifications post-traductionnelles de α-tubuline, tels que l’acétylation et détyrosination, qui s’accumulent sur les MTs stables au fil du temps16,17. Chez l’embryon de poisson zèbre, acétylation apparaît au MTs ciliaires et axonales alors pas stable interphase MTs18, limiter l’utilité de ce marqueur à un sous-ensemble de MTs stabilisées. En revanche, détyrosination semble se produire sur toutes les MTs stables dans l’ embryon de poisson zèbre18. Cette modification post-traductionnelle expose l’acide glutamique carboxy-terminale de le α-tubuline (tubuline détyrosinée)18 et peut être détectée à l’aide d’anti-Glu-tubuline19. Bien que détyrosination se produit préférentiellement sur MTs stables, des preuves expérimentales indiquent que cette modification post-traductionnelle est un résultat de, plutôt qu’une cause de, MT stabilité16. La population de MT réciproque, composée de MTs dynamiques, se distingue à l’aide d’un anticorps, anti-Tyr-tubuline, qui reconnaît spécifiquement la forme tyrosinée de tubuline α19. Après l’immunomarquage avec ces marqueurs et imagerie confocale, l’analyse quantitative des MTs (longueur, nombre et abondance relative) est possible dans des régions définies du tube neural en voie de développement. Une méthode simplifiée est fournie ici pour réaliser cette analyse à l’aide de logiciels de traitement d’images 3D. Cette méthode peut être appliquée pour répondre aux questions au sujet de la morphogénèse et la création ou la maturation des cellules polarité20. En effet, l’élaboration de tableaux polarisées de MTs stables accompagne de nombreuses manifestations du développement, y compris les photorécepteurs morphogenèse21, épithélialisation des cellules dans le développement du tube neural18 et axon formation8.

Protocole n° 2 décrit une adaptation in vivo d’une épreuve de biologie cellulaire pour analyser des MTs au cours de leur Assemblée phase (/ l’ancrage de la nucléation et croissance)22,23. Naissantes MTs sont nucléés à centrosome et par la suite fixés au subdistal appendices de la mère centriole23. On décrit une méthode pour analyser naissant MT repousse après la dépolymérisation. Ce protocole fournit des détails sur le traitement de la nocodazole pour dépolymériser MTs, la procédure de lavage des drogues et la période de récupération après le traitement. MT repousse est contrôlée à intervalles régulierslavage post s par immunomarquage avec des marqueurs pour MTs totales (anti-β-tubuline) aux côtés de marqueurs pour le centrosome (anti-γ-tubuline) et noyau (4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)), selon les procédures décrites dans le protocole 1. L’étape de dépolymérisation MT du présent protocole est essentielle car elle permet d’évaluation de la croissance de MT de novo plutôt qu’extension de MTs préexistants. Cette technique est donc distincte des autres procédures publiées pour mesurer les taux de croissance de MT (en absence de dépolymérisation) à l’aide d’un marqueur plus comme l’ailier liaison protéine 3 fondue à la protéine fluorescente verte (GFP-EB3), comme illustré dans la Tran et al., 11de 2012. En outre, ce test est particulièrement utile pour analyser les embryons défectueux en Assemblée de novo MT, tels que les mutants de NEDD1 rapportées antérieurement, dans lequel le recrutement de la γ-tubuline à centrosome est entravé, ayant pour résultat incomplet la formation du tube neural et défauts neuronale24.

Protocol

déclaration d’éthique : les procédures décrites ci-dessous suivre l’Université des directives de soins aux animaux le comté de Baltimore Maryland. 1. analyse de Stable et dynamique MTs à l’aide d’immunomarquage (protocole 1) dechorionation manuelle des embryons avant fixation obtenir fraîchement pondus embryons par excès système décanter et puis à recueillir les embryons restants dans une boîte de Pétri de plastique (voir Tabl…

Representative Results

Analyse des MTs stables et dynamiques à l’aide d’immunomarquageDans le Protocole N° 1, la répartition des sous-populations MT au cours de début (neural quille) et stades avancés (tige neurales) du développement du tube neural se révèle, à l’aide de Glu-tubuline et Tyr-tubuline comme marqueurs pour MTs stables et dynamiques, respectivement. Dynamiques MTs prédominent dans le cerveau postérieur au stade de la quille neuronal (4-5 somite…

Discussion

Actuellement, il existe de nombreuses méthodes d’imagerie dynamique de MT dans le développement précoce de poisson-zèbre, allant de l’imagerie live de molécules marqués à immunomarquage de fixe tissu11,12,13,14. Bien que MTs dans une seule cellule peuvent exister dans les États stables ou dynamiques, épithélialisation est un processus dans lequel les MTs sont stabilisés progressi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La microscopie confocale a été achetée avec des fonds de l’US National Science Foundation (NSF), subvention #DBI-0722569. La recherche a été financée par le U.S. National instituts de santé/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGM) grant #GM085290 et le département américain de la défense (DOD) subvention #W81XWH-16-1-0466 décerné à Mr Brewster. E. Vital a été financée par une subvention de UMBC du Howard Hughes Medical Institute à travers le niveau préuniversitaire et programme d’enseignement de premier cycle sciences, subvention #52008090. S.P. Brown a été pris en charge par un département américain de l’éducation GAANN Fellowship, une bourse d’études supérieures Meyerhoff financé par subvention de NIH/NIGM, #GM055036 et un assistanat de recherche financé par le DOD américain grant #W81XWH-16-1-0466.

Materials

Low Melting Point Agarose IBI scientific IB70050 Only used for embedding.

Prepare 4% LMP agarose
by heating a solution of  4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave
until polymerized. Keep warm on a 50 ˚C hot plate with the cap secured
Agarose Used to treat petridishes.   Prepare 1% agarose
by heating a solution of  1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave
until polymerized. 
Nocodazole Sigma 487928-10MG Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots.  Store at -20 ˚C.
8% Formaldehyde Electron Microscopy Sciences 157-8-100 Aliquot and store at -20 ˚C.
Kpipes Sigma P7643
NaCl Sigma S7653
Tris-HCl Sigma T3253-500G
KCl Sigma P9333-500G
CaCl2·2H2O Sigma C5080
NP-40 American Bioanalyticals AB01424
EGTA Sigma E3889-25G
MgCl2 Sigma M2670-500G
Normal Goat Serum Millipore S26-100ml Aliquot and store at -20 ˚C.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BP1605
Triton-x American Bioanalyticals AB02025
Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus) Sigma P5147-1G make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 ˚C.
Anti-Fade mounting medium Invitrogen P10144
DAPI Invitrogen D1306 Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 µl DAPI stock  with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 ˚C for months.
Mouse anti-β-tubulin Developmental studies Hybridoma Bank E7 1/200
Rabbit anti-γ-tubulin Genetex GTX113286 1/500
Rabbit anti-α-tubulin Genetex GTX108784 1/1000*
Rabbit anti-detyrosinated-tubulin Millipore AB3201 1/200-1/1000*  Titrate antibody with first use of new lot.
Rabbit anti-tyrosinated-tubulin Millipore ABT171 1/500
Mouse anti-centrin Millipore 04-1624 1/1000
Goat 488 anti-rabbit Thermofisher A11008 1/500
Goat 594 anti-rabbit Thermofisher A11012 1/500
Goat 594 anti-mouse Thermofisher A11005 1/500
Goat 488 anti-mouse Thermofisher A11001 1/500
Vibratome Vibratome 1500
Forceps World Precision Instruments 555227F
100 mm petri dish Cell treat 229693
35 mm petri dish Cell treat 229638
50 ml falcon tube Fisher 14-432-22
Woven nylon mesh 70 um Amazon.com B0043D1SZG 
Micropipette Gilson F123602
Glass pipette Fisher NC-999363-9
Aquarium sealant Amazon.com, by MarineLand Silicone Sealer 1 oz (Tube) 
Ring stand Fisher 14-675BO
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID Cole-Parmer WU-06417-21
Modeling clay Amazon.com Sargent Art 22-4000 Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice
Clamp Fisher 02-215-466
60ml syringe Fisher 14-820-11
Embryo medium (E3) 34.8 g NaCl
1.6 g KCl
5.8 g CaCl2·2H2O
9.78 g MgCl2·6H2O

To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. 
Blocking Solution 50 ml TBS-NP-40
2.5 ml normal goat serum
1 g BSA
625 µl Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7.6) 155 mM NaCl
10 mM Tris HCl
0.1% NP-40
2x MAB (pH6.4) 160 mM KPIPES
10 mM EGTA
2 mM MgCl2
Commercial 3-D Image processing Software PerkinElmer Volocity (V 6.2)
Dry block heater  VWR 12621-108 Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.
Dissecting Microscope Leica MZ12
Confocal Microscope Leica SP5
Flat embedding mold emsdiasum.com BEEM 70904-01
Public domain image processing software NIH ImageJ (V 1.5)
* Success varies by lot number

References

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McFarland, R. J., Brown, S. P., Vital, E., Werner, J. M., Brewster, R. M. Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (127), e55792, doi:10.3791/55792 (2017).

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