Summary

Uso de inmunomarcación para analizar microtúbulos estables, dinámicos y emergente en el embrión de pez cebra

Published: September 20, 2017
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Summary

Inmunomarcación para analizar poblaciones distintas de los microtúbulos en el cerebro en desarrollo del pez cebra se describen los métodos, que son ampliamente aplicables a otros tejidos. El primer protocolo describe un método optimizado de inmunomarcación microtúbulos estables y dinámicos. El segundo protocolo proporciona un método para la imagen y cuantificar nacientes microtúbulos específicamente.

Abstract

Microtúbulos (MTs) son dinámicas y frágiles estructuras que son un reto a la imagen en vivo, particularmente en embriones de vertebrados. Aquí se describen los métodos de inmunomarcación para analizar poblaciones distintas de MTs en el tubo neural en desarrollo del embrión de pez cebra. Mientras el foco está en tejido neural, esta metodología es ampliamente aplicable a otros tejidos. Los procedimientos están optimizados para temprano a embriones en fase mediados somitogenesis (1 somite a 12 somitas), sin embargo se pueden adaptar a una amplia gama de otras etapas con ajustes relativamente menores. El primer protocolo proporciona un método para evaluar la distribución espacial de MTs estables y dinámicos y realizar un análisis cuantitativo de estas poblaciones con software de procesamiento de imagen. Este enfoque complementa las herramientas existentes para imagen microtúbulos dinámica y distribución en tiempo real, usa líneas transgénicas o la expresión transitoria de construcciones etiquetadas. De hecho, estas herramientas son muy útiles, sin embargo no distingue fácilmente entre MTs dinámicos y estables. La capacidad de la imagen y analizar estas poblaciones distintos microtúbulos tiene importantes implicaciones para los mecanismos de comprensión polarización celular y la morfogénesis. El segundo protocolo describe una técnica para analizar específicamente nacientes MTs. Esto se logra mediante la captura de las propiedades de crecimiento de novo de MTs en el tiempo, siguiendo la despolimerización de microtúbulos con el nocodazole drogas y un período de recuperación después de lavado de drogas. Esta técnica no se ha aplicado al estudio de MTs en embriones de pez cebra, pero es un valioso análisis para investigar la función en vivo de proteínas implicadas en el montaje del microtubule.

Introduction

Los microtúbulos (MTs) son polímeros de α – y β-tubulina que montar en protofilaments lineal, varios de los cuales se combinan para formar un tubo hueco1,2. MTs son estructuras polarizadas, con rápido crecimiento más extremos y de crecimiento lento menos extremos que están anclados en el centrosoma o de organización de microtúbulos centro (MTOC)3. De novo Formación de MT es iniciada por nucleación en el complejo de anillo de γ-tubulina (γ-TURC), que proporciona una plantilla para montaje MT4. En cualquier célula dada, dos poblaciones de MTs se pueden distinguir a su vez sobre a diferentes velocidades. Dinámicas MTs exploran su entorno celular por la conmutación entre las fases de crecimiento y contracción en un proceso conocido como inestabilidad dinámica5. A diferencia de dinámicas MTs, MTs estables son adultos y tienen una vida media más larga que la dinámica de MTs6.

Décadas de investigación en biología celular ha proporcionado un conjunto sofisticado de herramientas para el estudio de la función y la estructura de MT y dio lugar a un gran cuerpo de conocimiento sobre estos elementos citoesqueléticos. Por ejemplo, MTs juegan un papel central en el establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular, que es atribuible no sólo a su polaridad intrínseca, sino también a la distribución subcelular diferencial estable versus dinámica MTs7, 8. en cambio, mucho menos se entiende sobre MT arquitectura y función en entornos más complejos tridimensionales (3D), como el embrión de vertebrados, en parte debido al desafío de citoesqueleto MT en alta resolución de imagen. A pesar de esta limitación, la reciente generación de transgénico GFP-expresando las líneas eso etiqueta MTs o expresión transitoria de fluorescencia etiquetada MT marcadores ha aumentado nuestra comprensión de los cambios dinámicos que MTs y su celular y papel del desarrollo en el embrión de pez cebra. Toda la red de MT puede ser reflejada en líneas transgénicas en que tubulina es directamente etiquetados polímeros9 o tubulina indirectamente están etiquetados con las proteínas asociadas a MT Doublecortin como cinasa (Dclk) o Ensconsin (EMTB)10, 11. Se han generado otras líneas (y construcciones) que permiten una evaluación de polaridad intrínseca MT al etiquetado específicamente MT más extremos o centrosoma anclado menos extremos11,12,13, 14. el poder de estas herramientas reside en la capacidad para estudiar la dinámica de la MT en vivo, desarrollo de organismos. Estos estudios han puesto de manifiesto, por ejemplo, la distribución espacial y dinámica de MTs en poblaciones celulares específicas, la orientación de mitotic husos en tejidos sometidos a morfogénesis (un indicador del plano de división celular), la polaridad del polímero MT lo que se refiere a procesos tales como la elongación celular y la migración y tasa de crecimiento de MT determinada por cometa velocidad9,13,15. La limitación de estas herramientas es que ellos no fácilmente discriminar entre poblaciones de MT estables y dinámicas.

A partir de la literatura de biología celular rico, inmunomarcación imagen de MTs estables y dinámicos en el embrión del pez cebra se describen los métodos, que son complementarios al uso de líneas transgénicas. El uso generalizado de tales métodos de inmunomarcación en el pez cebra ha sido un poco obstaculizado por la dificultad de preservar la integridad de MT durante el procedimiento de fijación. 1 Protocolo describe un método optimizado para inmunomarcación total, dinámica, y estables MTs en las secciones del cerebelo en desarrollo del pez cebra. Además, un método sencillo usando comercialmente el software disponible se describe para cuantificar las poblaciones de MT. Estables MTs se distinguen de MTs dinámicos basados en varias modificaciones poste-de translación de la α-tubulina, como la acetilación y detyrosination, que se acumulan de MTs estables largo tiempo16,17. En el embrión de pez cebra, la acetilación se produce MTs ciliares y axonales pero no estable interfase MTs18, limitando la utilidad de este marcador a un subconjunto de estabilizado MTs. En cambio, detyrosination parece ocurrir sobre todo estables MTs en el embrión de pez cebra18. Esta modificación poste-de translación expone el ácido glutámico de carboxi-terminal de α-tubulina (tubulina detyrosinated)18 y puede ser detectada utilizando anti-Glu-tubulina19. Aunque detyrosination se produce preferentemente en MTs estables, la evidencia experimental indica que esta modificación poste-de translación es el resultado de, en lugar de una causa de estabilidad MT16. Se distingue la población MT recíproca, compuesto por dinámicos MTs, usando un anticuerpo, anti-Tyr-tubulina, que reconoce específicamente la forma de tyrosinated de α-tubulina19. Después de inmunomarcación con estos marcadores y la proyección de imagen confocal, el análisis cuantitativo de MTs (longitud, número y abundancia relativa) puede realizarse en regiones definidas del tubo neural en desarrollo. Para realizar este análisis utilizando software de procesamiento de imágenes 3D se facilita un método racionalizado. Este método puede ser aplicado para resolver las preguntas con respecto a la morfogénesis y el establecimiento o la maduración de la célula polaridad20. De hecho, la elaboración de matrices polarizados de MTs estables acompaña a muchos eventos del desarrollo, incluyendo fotorreceptor morfogénesis21, epitelización de las células en el desarrollo neural tubo18 y axón formación8.

Protocolo n ° 2 describe una adaptación en vivo de un ensayo de Biología de la célula para analizar MTs durante su Asamblea fase (nucleación/anclaje y crecimiento)22,23. Nacientes MTs están nucleadas en el centrosoma y posteriormente ancladas a subdistal apéndices del centriolo madre23. Se describe un método para analizar el incipiente rebrote MT después de despolimerización. Este protocolo proporciona detalles sobre el tratamiento del nocodazole a despolimerizar MTs, el procedimiento de lavado de la droga y el período de recuperación después del tratamiento. MT re-crecimiento se controla a intervalos regulareslavado de post s por inmunomarcación con marcadores para MTs totales (anti β-tubulina) junto con marcadores para el centrosoma (anti γ-tubulina) y núcleo (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), según los procedimientos generales descritos en el Protocolo 1. El paso de la despolimerización de MT de este protocolo es esencial ya que permite la evaluación del crecimiento de MT de novo en lugar de extensión de MTs preexistentes. Esta técnica es por lo tanto distinta de los otros procedimientos publicados para medir las tasas de crecimiento de MT (en ausencia de despolimerización) mediante el uso de un marcador de punta más como fin vinculante proteínas 3 fusionado a la proteína verde fluorescente (EB3-GFP), como se muestra en Tran et al., 201211. Además, este análisis es particularmente útil para el análisis de embriones defectuosos en Asamblea de novo MT, como los mutantes previamente divulgados de NEDD1 en el que se deteriora el reclutamiento de γ-tubulina en el centrosoma, dando por resultado incompleto formación del tubo neural y defectos neuronales24.

Protocol

declaración de ética: los procedimientos describen a continuación sigue la Universidad de las pautas de cuidado de los animales de Maryland Baltimore County. 1. Análisis de estable y dinámico MTs uso de inmunomarcación (protocolo 1) dechorionation Manual de embriones antes de la fijación obtener recién generado embriones vertiendo el agua de exceso del sistema y luego recoger embriones restantes en un plato de Petri de plástico (consulte la <strong…

Representative Results

Análisis de MTs estables y dinámicos mediante inmunomarcaciónEn el Protocolo 1, se revelaron la distribución de las subpoblaciones de MT durante temprano (quilla neural) y últimas etapas (barra neural) del desarrollo del tubo neural, con Glu-tubulina y Tyr-tubulina como marcadores para MTs estables y dinámicas, respectivamente. Dinámicas MTs predominan en el cerebelo en el estadio de la quilla neural (4-5 somitas) (figura 2…

Discussion

Actualmente existen muchos métodos para la proyección de imagen dinámica del MT en el desarrollo temprano del pez cebra, que van desde imágenes directo de moléculas etiquetadas inmunomarcación de fijo tejido11,12,13,14. Aunque MTs en una sola célula pueden existir en Estados estables o dinámicos, epitelización es un proceso en el cual MTs se estabilizan progresivamente con el tiempo. U…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El microscopio confocal fue adquirido con fondos de Estados Unidos National Science Foundation (NSF), grant #DBI-0722569. La investigación fue apoyada por los Estados Unidos nacional institutos de salud nacional Instituto de General ciencias médicas (NIH/NIGMS) grant #GM085290 y los Estados Unidos Departamento de defensa (DOD) grant #W81XWH-16-1-0466 adjudicado a R.M. Brewster. E. Vital fue apoyado por una beca a UMBC de la Howard Hughes Medical Institute a través del preuniversitario y licenciatura Ciencias Educación, grant #52008090. S.P. Brown fue apoyado por un departamento de los Estados Unidos de educación GAANN becas, una beca de postgrado de Meyerhoff financiado por subvenciones de NIH/NIGMS #GM055036 y una ayudantía de investigación financiado por el DOD de Estados Unidos grant #W81XWH-16-1-0466.

Materials

Low Melting Point Agarose IBI scientific IB70050 Only used for embedding.

Prepare 4% LMP agarose
by heating a solution of  4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave
until polymerized. Keep warm on a 50 ˚C hot plate with the cap secured
Agarose Used to treat petridishes.   Prepare 1% agarose
by heating a solution of  1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave
until polymerized. 
Nocodazole Sigma 487928-10MG Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots.  Store at -20 ˚C.
8% Formaldehyde Electron Microscopy Sciences 157-8-100 Aliquot and store at -20 ˚C.
Kpipes Sigma P7643
NaCl Sigma S7653
Tris-HCl Sigma T3253-500G
KCl Sigma P9333-500G
CaCl2·2H2O Sigma C5080
NP-40 American Bioanalyticals AB01424
EGTA Sigma E3889-25G
MgCl2 Sigma M2670-500G
Normal Goat Serum Millipore S26-100ml Aliquot and store at -20 ˚C.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BP1605
Triton-x American Bioanalyticals AB02025
Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus) Sigma P5147-1G make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 ˚C.
Anti-Fade mounting medium Invitrogen P10144
DAPI Invitrogen D1306 Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 µl DAPI stock  with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 ˚C for months.
Mouse anti-β-tubulin Developmental studies Hybridoma Bank E7 1/200
Rabbit anti-γ-tubulin Genetex GTX113286 1/500
Rabbit anti-α-tubulin Genetex GTX108784 1/1000*
Rabbit anti-detyrosinated-tubulin Millipore AB3201 1/200-1/1000*  Titrate antibody with first use of new lot.
Rabbit anti-tyrosinated-tubulin Millipore ABT171 1/500
Mouse anti-centrin Millipore 04-1624 1/1000
Goat 488 anti-rabbit Thermofisher A11008 1/500
Goat 594 anti-rabbit Thermofisher A11012 1/500
Goat 594 anti-mouse Thermofisher A11005 1/500
Goat 488 anti-mouse Thermofisher A11001 1/500
Vibratome Vibratome 1500
Forceps World Precision Instruments 555227F
100 mm petri dish Cell treat 229693
35 mm petri dish Cell treat 229638
50 ml falcon tube Fisher 14-432-22
Woven nylon mesh 70 um Amazon.com B0043D1SZG 
Micropipette Gilson F123602
Glass pipette Fisher NC-999363-9
Aquarium sealant Amazon.com, by MarineLand Silicone Sealer 1 oz (Tube) 
Ring stand Fisher 14-675BO
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID Cole-Parmer WU-06417-21
Modeling clay Amazon.com Sargent Art 22-4000 Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice
Clamp Fisher 02-215-466
60ml syringe Fisher 14-820-11
Embryo medium (E3) 34.8 g NaCl
1.6 g KCl
5.8 g CaCl2·2H2O
9.78 g MgCl2·6H2O

To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. 
Blocking Solution 50 ml TBS-NP-40
2.5 ml normal goat serum
1 g BSA
625 µl Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7.6) 155 mM NaCl
10 mM Tris HCl
0.1% NP-40
2x MAB (pH6.4) 160 mM KPIPES
10 mM EGTA
2 mM MgCl2
Commercial 3-D Image processing Software PerkinElmer Volocity (V 6.2)
Dry block heater  VWR 12621-108 Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.
Dissecting Microscope Leica MZ12
Confocal Microscope Leica SP5
Flat embedding mold emsdiasum.com BEEM 70904-01
Public domain image processing software NIH ImageJ (V 1.5)
* Success varies by lot number

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McFarland, R. J., Brown, S. P., Vital, E., Werner, J. M., Brewster, R. M. Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (127), e55792, doi:10.3791/55792 (2017).

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