Summary
Стромальные клетки костного мозга (MSC) с нейронным потенциалом существуют в костном мозге. Наш протокол обогащает эту популяцию клеток посредством гипоксической предварительной кондиции и после этого направляет их на зрелые клетки Шванна.
Abstract
В этой рукописи описывается средство обогащения для нейронных предшественников из популяции стромальных клеток костного мозга (MSC), а затем для направления их в зрелую судьбу клеток Шванна. Мы подвергли крысам и человеческим MSCs переходные гипоксические условия (1% кислорода в течение 16 часов), а затем расширение в виде нейросферов на субстрате с низкой степенью присоединения с добавлением фактора роста эпидермального фактора роста (EGF) / основного фибробласта (bFGF). Нейросферы высевали на поликультурный пластик, покрытый поли-D-лизином / ламинином, и культивировали в глиогенном коктейле, содержащем β-Heregulin, bFGF и тромбоцитарный фактор роста (PDGF) для генерации клеточных клеток Schwann (SCLC). SCLC были направлены на участие судьбы через сокультуру в течение 2 недель с очищенными нейронами дорзальных корневых ганглиев (DRG), полученными от E14-15 беременных крыс Sprague Dawley. Зрелые клетки Шванна демонстрируют стойкость в экспрессии S100β / p75 и могут образовывать миелиновые сегменты. Клетки, генерируемые таким образом, имеют потенциалПри трансплантации аутологичных клеток после травмы спинного мозга, а также при моделировании заболеваний.
Introduction
Трансплантация нейронных предшественников и их производных обещает быть стратегией лечения после травматического повреждения нерва 1 , 2 и нейродегенерацией 3 , 4 . Перед клиническим применением важно обеспечить: i) способ доступа и расширения на аутологичный источник клеток стебля / предшественника и ii) средство для направления их к соответствующим зрелым типам клеток 3 . Наш интерес к клеточной терапии для повреждения спинного мозга привел нас к поиску надежного, аутологичного источника клеток нервных предшественников из тканей взрослых.
Субпопуляция MSC происходит от нервного гребня и легко доступна из полости костного мозга. Эти клетки представляют собой нейронные предшественники, которые могут генерировать нейроны и глии 5 . Модели животных церебральной ишемии демонстрируют, что гипоксия способствует распространению Итерации и мультипотенции нейронных предшественников в мозге 6 . Это было основанием для использования гипоксического предварительного кондиционирования в качестве средства расширения на мозговых нейронных предшественниках.
Трансплантация клеток Шванна в поврежденный спинной мозг способствует регенерации 2 . SCLC могут быть получены из MSC посредством добавления глиогенных факторов ( то есть β-Heregulin, bFGF и PDGF-AA), но демонстрируют фенотипическую нестабильность. После отмены факторов роста они возвращаются к фибробластоподобному фенотипу 7 . Фенотипическая нестабильность нежелательна при трансплантации клеток из-за риска аберрантной дифференциации и канцерогенеза. Поскольку предшественники клеток Шванна связаны с расслоениями аксонов внутри эмбрионального периферического нерва 8 , мы были вовлечены в SCLC с культивированием с очищенными эмбриональными нейронами DRG 7 ,Ass = "xref"> 9. Результирующие зрелые клетки Шванна подвергаются суждению и демонстрируют функцию in vitro 7 , 9 и in vivo 10 .
Наш протокол по обогащению нейронных предшественников из MSC прост и эффективен и приводит к увеличению числа клеток для последующих анализов. Вывод суицидальных клеток Шванна через платформу кокультуры позволяет изучать глиальную дифференциацию и генерировать стабильные и функциональные клетки Шванна для потенциального клинического применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с животными, проводились в строгом соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Комитетом по использованию живых животных для обучения и исследований, Медицинский факультет Ли Ка Шинг, Университет Гонконга. Образцы костного мозга человека были получены из подвздошного гребня здоровых доноров после получения информированного согласия. Протоколы были одобрены Институциональным советом по обзору, Университет Гонконга.
1. Подготовка культур MSC крысы
- Урожай МСК с бедренной кости
- Автоклавируйте все инструменты для рассечения ( т. Е. Тонкие рассекающие ножницы, ножницы с тупым наконечником и зубчатые щипцы) при температуре 180 ° C в течение не менее 2 часов перед использованием.
- Подготовьте среду для роста MSC, содержащую минимальную альфа-модификацию альфа (αMEM), дополненную 15% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и пенициллином / стрептомицином (P / S, 1% об. / Об.).
- Жертвуйте молодых самцов крыс Sprague Dawley (200-250 г веса тела) путем передозировки пентобарбитоном (240 мг / кг веса тела, внутрибрюшинно).
ПРИМЕЧАНИЕ. Образцы костного мозга у разных крыс следует обрабатывать отдельно. - Поместите жертву животных в положение на спине. Полностью очистите живот и нижние конечности 70% этанолом.
- Удалите кожу и подкожную ткань над медиальными бедрами, используя тонкие рассекающие ножницы и щипцы. Удалите мышцы бедра по окружности до тех пор, пока бедра не будут выставлены. Продолжайте это проксимально и дистально до тех пор, пока не появятся коленные и тазобедренные суставы. Разделите бедренную кость через тазобедренный и коленный сустав, используя ножницы с затупленными наконечниками.
ПРИМЕЧАНИЕ. Не разрезайте бедренную кость, чтобы обнажить полость костного мозга на этом этапе. Перенесите неповрежденные бедра в вытяжной колпак ламинарного течения для дальнейшей обработки. - Используйте тупые режущие ножницы для опрокидывания дистального и проксимального концов бедренной кости через метафиз,
- Поместите фильтр размером 70 мкм на коническую трубку объемом 50 мл. Вставьте 21 G, 10 мл шприц, содержащий забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS, 10 мМ Na 2 HPO 4 , pH 7,4) в открытый бедренный канал и промойте содержимое костного мозга в коническую трубку повторной промывкой.
ПРИМЕЧАНИЕ. Приблизительно 20 мл PBS используют для промывки каждой бедра. Если цвет промытого содержимого остается окрашенным в кровь и мутным, может использоваться больший объем. - Собирают клетки центрифугированием при 480 мкг в течение 5 мин. Отбросьте супернатант. Ресуспендируют клеточный осадок в 10 мл среды для роста MSC. Нанесите клетки на 10 см планшет для культивирования ткани. Поместите чашки для культивирования ткани в инкубатор клеток (37 ° C, 5% CO 2 ). Запишите начальный день плакировки как день 0.
ПРИМЕЧАНИЕ. На всех этапах, связанных с центрифугированием, установите тормоз для максимального замедления.
- Создание и расширение колоний MSC
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот протокол rЭлиты на клеточной пластической адгезии в качестве средства для выбора MSC изнутри полости 11 . Содержание костного мозга разрешено прилипать к пластическому культуральному пластику в течение 2 дней.- На второй день промойте культуральные планшеты три раза с помощью 10 мл PBS для удаления неадгезивных клеток. Замените PBS 10 мл MSC ростовой среды после полоскания. Промойте клетки с PBS и пополняйте среду роста MSC каждые 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ. Колонии MSC должны быть видны к дню 6-7 ( рисунок 2A ). - Пропускайте клетки к 10-му дню путем удаления среды для роста и ополаскивания клеток с помощью PBS. Добавить 1,5 мл рекомбинантного ферментативного клеточного диссоциативного реагента и инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин. Добавьте 3 мл среды для роста MSC, чтобы нейтрализовать реакцию. Соберите отдельные клетки центрифугированием при 250 × g в течение 5 мин.
- Определите количество клеток в грануле, используя гемоцитометр после соответствующего разведения в PBS.
- Семена пассировали клетки с плотностью 40 000 клеток / см 2 в 10-сантиметровую культуральную пластинку в среде роста MSC.
ПРИМЕЧАНИЕ. MSCs крысы должны достигнуть слияния 80-90% в течение 2 дней после прохождения ( рис. 2B ). Клетки могут пассироваться, как описано на этапе 1.2.2, для до 8 проходов. MSC можно охарактеризовать с помощью иммуноцитохимии и их способности к дифференцировке трилинии ( рисунок 3 ) 12 . Только культуры MSC между проходами 3 и 8 подвергаются последующей гипоксической предварительной обработке и обогащению нейронных предшественников. MSCs большего числа проходов принимают сплюснутую морфологию ( рис. 2C ) и не дают достаточного количества нейронных предшественников. Эти культуры следует отбросить.
- На второй день промойте культуральные планшеты три раза с помощью 10 мл PBS для удаления неадгезивных клеток. Замените PBS 10 мл MSC ростовой среды после полоскания. Промойте клетки с PBS и пополняйте среду роста MSC каждые 3 дня.
2. Подготовка человеческих BMSC-культур
- Разбавьте 1 мл аспирата костного мозга человека с помощью 9 мл среды для роста MSC и нанеситеКлеток на 10-сантиметровой чашке для культивирования ткани. Поддерживайте культуры в клеточном инкубаторе (37 ° C, 5% CO 2 ).
- Удалите среду через 2 дня и осторожно промойте культуры три раза 10 мл PBS для удаления неадгезивных клеток. После окончательного полоскания удалите PBS и замените его 10 мл среды для роста MSC. Пополняйте среду для выращивания после каждых трех дней культуры после промывки PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ. Колонии MSC должны быть видны к дню 6-7. Количество колоний может варьироваться между субъектами. - Пропустите ячейки на 10-й день, как описано в шаге 1.2.2. Определите количество клеток в грануле, используя гемоцитометр после соответствующего разведения в PBS. Высевают пассированные клетки с плотностью 40 000 клеток / см 2 на 10 см культуральную пластинку в среде роста MSC.
ПРИМЕЧАНИЕ. Человеческие MSC ( рисунок 2D ) демонстрируют аналогичную морфологию для MSC крысы и также должны достигать слияния 80-90% в течение 2 дней после прохождения. Они должны быть чаройС использованием иммуноцитохимии и их способности дифференцировать трилинии 12 . Как и у MSC крыс, человеческие MSC, которые находятся между проходами 3 и 8, подвержены последующей гипоксической предварительной обработке и обогащению нейронных предшественников.
3. Гипоксическая предварительная подготовка
- Разблокируйте компоненты камеры гипоксии ( например, основание, крышка, лотки) после отпускания кольцевого зажима и протрите отдельные части с помощью 70% этанола. Поместите компоненты камеры в вытяжной шкаф ламинарного течения для стерилизации под ультрафиолетовым светом в течение 15 мин.
- Перед гипоксическим предварительным кондиционированием удалите среду и промойте культуры MSC крысы и человека (разделы 1 и 2) с помощью 10 мл PBS. Замените PBS 10 мл MSC-среды для роста, дополненной 25 мМ HEPES.
ПРИМЕЧАНИЕ. MSC, культивированные на 10 см блюдах, должны были достигнуть слияния 80-90%, прежде чем подвергаться гипоксической предварительной обработке. - Поместите кулВнутри камеры гипоксии. Соберите компоненты камеры и затяните кольцевой зажим. Промыть газовую смесь 99% N 2 /1% O 2 в камеру со скоростью потока 10 л / мин в течение 5 мин.
- Уплотните соединительные концы камеры гипоксии, чтобы убедиться, что утечка газа отсутствует. Поместите камеру внутри инкубатора ячейки (37 ° C, 5% CO 2 ) в течение 16 часов.
- По завершении гипоксического предварительного кондиционирования удаляйте культуры из камеры при подготовке к последующей культуре обогащения нейронных предшественников.
4. Культура обогащения нейрогенного прародителя
- Подготовьте среду нейронов-предшественников, состоящую из модифицированной Дульбекко среды Eagle Medium / Ham, содержащей питательную смесь F12 (DMEM / F12) с добавлением B27 (2% об. / Об.), Основного фактора роста фибробластов (bFGF, 20 нг / мл), эпидермального фактора роста (EGF, 20 нг / мл) и P / S (1% об. / Об.).
- Отсоедините гипоксические предварительно кондиционированные крысы / человеческие MSC, как описано в шаге 1.2.2.Соберите отдельные клетки центрифугированием при 250 × g в течение 5 мин. Определите количество клеток в грануле, используя гемоцитометр после соответствующего разведения в PBS.
- Ресуспендируют клетки в среде нейронных предшественников и семенах на низкоприспособленных 6-луночных планшетах с плотностью 6000 клеток / см 2 . Поместите культуру в клеточный инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 ) в течение 12 дней. Пополняйте 75% среды нервного предшественника каждые 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ. Значительные неадгезивные клеточные кластеры следует наблюдать на 6-7 день. К 10-12 день наблюдаются нейросферы диаметром ≥ 100 мкм ( рис. 4 ). Гипоксические предварительно кондиционированные MSC должны давать больше нейросферов по сравнению с MSCs, культивированными в нормоксических условиях 9 . - Собирайте нейросферы на 12-й день, всасывая их в 10-миллилитровую пипетку и перенося ее в 15-миллилитровую коническую трубку. Центрифугируйте нейросферы при 250 мкг в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ. Нейросферы могут бытьХарактеризуется на 12 день для маркеров нейронных предшественников, таких как нестин и GFAP 7 .
5. Поколение клеток Шванна, совершенных с помощью судьбы, через кокультуру с помощью нейронов DRG
- Получение очищенных нейронов DRG крысы
- Автоклавируйте все инструменты для рассечения ( например, ножницы для вскрытия, щипцы, два микродиссекционных щипца и ножницы для микродиссекции) при 180 ° C в течение не менее 2 часов перед использованием.
- Пальто 6-луночные планшеты для культивирования ткани с поли-D-лизином (PDL, 10 мкг / мл в PBS) при 4 ° C в течение ночи. Удалите PDL и смойте 1,5 мл PBS на лунку.
- Продолжайте покрытие пластин ламинином (10 мкг / мл в PBS) при 37 ° C в течение 2 часов. Промойте планшеты 1,5 мл PBS на лунку.
- Подготовьте поддерживающий нейронов DRG, состоящий из нейробазальной среды, дополненной B27 (2% об. / Об.), L-глутамина (1% об. / Об.), Фактора роста нервов (NGF, 20 нг / мл) и P / S (1 % Об. / Об.).
- Подготовить среду для очистки нейронов DRG, состоящую из нейробазальной среды, дополненной B27 (2% об. / Об.), L-глутамина (1%), NGF (20 нг / мл), P / S (1%), фтордезоксиуридина (FDU, 10 Мкг / мл) и уридина (10 мкг / мл).
- Жертвоприношение беременных крыс в день беременности 14-15 путем передозировки пентобарбитала (240 мг / кг массы тела, внутрибрюшинно).
- Поместите жертву животных в положение на спине. Полностью очистите живот 70% этанолом.
- Разрежьте нижнюю брюшную стенку животного в продольном направлении, используя тонкие рассекающие ножницы и щипцы. Определите и удалите матку с помощью ножниц для вскрытия. Вырежьте стенку матки, чтобы обнажить и извлечь эмбрионы. Перенесите эмбрионы в стерильную, 10 см культуральную чашку, заполненную PBS. Поместите блюдо культуры на лед.
- Перенесите эмбрион, предназначенный для вскрытия, в стерильную культуральную чашку размером 10 см, заполненную PBS (комнатная температура), и расположите ее под рассекающим микроскопом. Имейте эмбрион в положении лежа.
НЕE: Белесый спинной мозг и прикрепленные DRG можно увидеть через спинной аспект эмбриона через его полупрозрачную кожу. - Вставьте микродискретирующие щипцы вдоль обеих сторон спинного мозга и используйте тупое рассечение, чтобы начать разделение спинного мозга от окружающих мягких тканей. Вырежьте спинной мозг без животного, используя микродискретирующие щипцы вдоль шеи и хвоста. Выполните дальнейшую тупую рассечение по вентральному аспекту шнура, чтобы освободить его от окружающих мягких тканей.
- Используйте микродискретирующие щипцы для удаления остаточных мягких тканей по спинной стороне освобожденного спинного мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе остается только спинной мозг, нервные корни и прикрепленный DRG. - Отсоедините отдельные DRG от их соединительных нервных корешков с помощью микродиссектирующих щипцов. Используйте пипетку, прикрепленную к кончику 1 мл, чтобы перенести DRG в 1,5 мл стерильную пробирку с центрифугой, содержащую PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для каждой трубки 1,5 мл максимумМожно разместить 100 DRG. - Центрифугируют DRG при 250 × g в течение 5 мин и ресуспендируют их в реакторе рекомбинантной ферментативной клеточной диссоциации (200 мкл на пробирку). Инкубируйте (37 ° C, 5% CO 2 ) в течение 10 мин. Центрифугируйте DRG при 250 xg в течение 5 минут, удалите супернатант и повторно суспендируйте в поддерживающей среде нейронов DRG. Разложите таблетку осторожным растиранием, используя наконечник пипетки 200 мкл. Определите количество клеток в грануле, используя гемоцитометр после соответствующего разбавления.
- Высевают клетки с плотностью 5000 клеток / см 2 в 6-луночные планшеты с PDL / ламининовым покрытием в 1,5 мл поддерживающей среды нейронов DRG на лунку. После двух дней культивирования удалите поддерживающий среду нейронов DRG, промойте PBS и замените средой для очистки нейронов DRG.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для каждого цикла очистки обработайте культуры DRG средой для очистки в течение 2 дней, а затем инкубируйте 1 час в поддерживающей среде. После 3-4 циклов очисткиОжидается овал всех эндогенных глии. Это займет около 14 дней. Очищенные культуры положительно оценивают нейронный маркер TUJ1 и отсутствуют для экспрессии S100β ( рисунок 5 ).
- Генерация клеточных клеток Шванна
- Подготовьте глиальную индукционную среду, содержащую αMEM, дополненную β-Heregulin (100 нг / мл), bFGF (10 нг / мл), тромбоцитарный фактор роста (PDGF-AA, 5 нг / мл), FBS (10%) и P / S (1% об. / Об.).
- Пластину нейросферы, приготовленные в разделе 4 в 6-луночных планшетах с PDL / ламинином с плотностью 5-10 шаров на см 2 в 1,5 мл глиальной индукционной среды на лунку. Заменяйте глиальную индукционную среду каждые 2 дня после ополаскивания клеток PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ. Клетки из посевных нейросфер, как видно, мигрируют наружу к дню 2. К 7-му дню мигрирующие клетки имеют сужающийся вид и должны демонстрировать иммуноположительность для клетки ШваннаМаркеры p75 рецептор нейротропина (p75) и S100β7. Эти ячейки называются SCLC.
- Coculture SCLC с DRG нейронами
- Подготовьте среду для культивирования, состоящую из поддерживающей среды нейронов DRG (этап 5.1.4) и глиальной индукционной среды (этап 5.2.1) при соотношении объемного объема 1: 1.
- Подготовьте среду для поддержания клеток Шванна, состоящую из DMEM / F12, дополненной FBS (5%), β-Heregulin (10 нг / мл) и P / S (1% об. / Об.).
- Удаляют культуральную среду с 7-го дня SCLC, промывают их PBS и инкубируют с 0,5 мл / лунку рекомбинантного ферментативного клеточного диссоциативного реагента при 37 ° C в течение 5 мин. Ресуспендировать SCLC в среде сокультурообразования.
- Определите количество клеток, используя гемоцитометр после соответствующего разбавления.
- Высевают SCLC на очищенные культуры нейронов DRG с плотностью 1000 клеток / см 2 . Поддерживайте кокультуры в течение 14 дней, со средней заменой каждые 2 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ. Во время культивирования SCLCs приобрели шпиндельную морфологию, характерную для зрелых клеток Шванна ( рис. 6 ). Эти клетки сохраняются в своем фенотипе после изъятия факторов роста и способны миелинантные аксоны in vitro и in vivo 7 , 10 . Позитивность маркеров клеток Шванна ( т. Е. P75 и S100β) должна контролироваться иммунофлюоресценцией. - По завершении кокультуры, прохождение судьбы, занесенные в клетки Шванна, как описано в шаге 1.2.2. Используйте 0,5 мл реагента для диссоциации на лунку. Определите количество клеток, используя гемоцитометр после соответствующего разбавления.
- Ресуспендируют сукцинированные в Шванне клетки Шванна в поддерживающей среде клеток Шванна с плотностью 10 000 клеток / см 2 . Высевают клетки в 6-луночные планшеты с PDL / ламинином для иммунофлюоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ. Кокуляры неизбежно содержат MSC, которые приняли фибробластКлеточная судьба 7 . Эти клетки пассируются вместе с сущностными клетками Шванна по завершении кокультуры. Шванновские клетки, расположенные поверх этого фибробластного субстрата, могут быть легко отсоединены и дополнительно расширены после промывки «холодными струями» PBS (4 ° C), как было описано в другом месте 13 . Фантазированные клетки Шванна могут быть расширены в поддерживающей среде в течение 1 месяца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обзор основных этапов нашего протокола показан на рисунке 1 . Таким образом, крысиные и человеческие MSC выбираются путем прилипания к пластике тканевой культуры. Расширенные MSC предопределены гипоксией и затем подвержены условиям формирования нейросферы. Нейросферы покрыты и позволяют дифференцироваться в SCLC. SCLCs сокультивированы с очищенными нейронами DRG для генерации сукнантных клеток Шванна.
Морфология культивируемых крыс и человеческих MSCs проиллюстрирована на рисунке 2 . Их здоровая суженная морфология показана в отличие от четырехугольника MSC, поддерживаемого для высоких номеров проходов, которые потеряли многополярность. Расширенные крысы и колонии человека должны демонстрировать экспрессию маркеров MSC, отсутствие гемопоэтических маркеров стволовых клеток и способность к трилинии( Фиг. 3 ). Здоровые MSCs между проходами 3 и 8 подвергаются гипоксической предварительной обработке в течение 16 ч и затем пассируют на пластинки с низкой адгезией с добавкой EGF / bFGF. Гипоксическая предварительная обработка приводит к увеличению числа нейросефер, а также к более крупным размерам нейросферы ( рис. 4 ).
Нейросферы высевают на покрытые PDL / ламининовыми культуральными планшетами и индуцируют превращение SCLC в культуру в глиальную индукционную среду, содержащую β-Heregulin, bFGF и PDGF-AA. SCLC демонстрируют характерную коническую морфологию клеток Шванна и соответствующую маркерную экспрессию, но они фенотипически нестабильны и возвращаются к фенотипу фибробластов при прекращении роста факторов роста
Coculture с сенсорными нейронами является обязательным условием дляЗуд к участию в судьбе. Установление очищенных сетей DRG достигается посредством импульсной обработки с помощью FDU и уридина для удаления эндогенных глии и должно быть подтверждено отсутствием иммуноположительности S100β ( рисунок 5 ). На 7-й день SCLC пассируют и соконкулируют с очищенными нейронами DRG в течение 14 дней ( фиг. 6 ). По завершении сокультуры должны появиться зрелые, суровые Шваннские клетки.
Рисунок 1: Обзор протокола. Костный мозг получен из бедра крысы или аспирата подвздошной кишки человека. MSC из костного мозга могут прикрепляться и расширяться на пластике культуры тканей. Чтобы обогатить MSC с нейронным потенциалом, клетки предварительно кондиционируют в 1% O 2 в течение 16 ч и затем пассируют в культуру с низкой адгезией plС добавлением bFGF / EGF. Это приводит к образованию нейросферов, которые высевают на пластиковую пластиковую пластинку, покрытую PDL / ламинином, и культивируют в глиальной индукционной среде для получения SCLC. SCLC пассируют и концентрируют с очищенными нейронами DRG в течение 2 недель, чтобы направить их на зрелость. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Создание колоний MSC. Значительные колонии MSC должны быть видны через 6-7 дней после нанесения клеток костного мозга на пластику культуры тканей. Показан репрезентативный образ колонии MSC крысы ( A ), в то время как колонии людей демонстрируют аналогичный внешний вид. Колонии можно пройти через 10 дней. При более высоком увеличении оба крысы (B ), а человеческие ( D ) MSC демонстрируют характерную фибробластоподобную морфологию после прохождения. MSC, которые поддерживаются для высоких номеров прохода, приобретают сплюснутую, четырехугольную морфологию ( C ) и должны быть отброшены. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характеристика MSC. ( A - D ) Репрезентативные изображения человеческих MSC. MSC могут быть охарактеризованы выражением соответствующих маркеров, таких как CD90 ( A ), CD73 ( B ) и Stro-1 ( C ), а также отсутствием гематопоэтических маркеров стволовых клеток, таких как CD45 ( D ). ( E - G ) Крыса MSC, выделенные и расширенные, как описано в протоколе, демонстрируют мультипотентность в их способности образовывать адипоциты ( E , жировые отложения, окрашенные суданским красным), остеобласты ( F , перицеллюлярный матрикс, окрашенный красным ализарином) и хондроциты ( G ; протеогликаны, окрашенные сафранином- O) при соответствующих условиях культивирования. Шкала шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Обогащение нейронных предшественников из MSC. Оба MSCs крысы ( A ) и человека ( C ) образуют нейросферы при культивировании на пластике культуры с низкой адгезией ткани в среде, дополненной EGF / bFGF. Числа и средний диаметр крысы (
Рисунок 5: Создание очищенных сетей DRG крысы. Очищенные сети DRG устанавливаются после импульсной обработки антимитотическими агентами FDU и уридина (A). Нейритные сети, лишенные S100β-экспрессирующих эндогенных глии (B), готовы к культивированию с SCLC. Шкала шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Генерация клеток Schwann, полученных из костного мозга, посредством кокультуры с нейронами DRG. По завершении 2 недель культивирования с очищенными нейронами DRG и человеческими SCLC, веретеновидные, обусловленные судьбой клетки Шванна выходят из групп, получавших как нормоксию, так и гипоксию ( A и D ). Эти клетки экспрессируют маркеры клеток Шванна p75 (B и E) и S100β (C и F). Экспрессия человеческого ядра-антигена (HuNeu) демонстрирует, что S100β-позитивные клетки не загрязняют глиальные клетки, происходящие из DRG крысы. Шкала шкалы = 100 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Крайне важно сохранить «стебельность» MSC до обогащения нейронных предшественников посредством гипоксической предварительной кондиции и культуры нейросферы. По нашему опыту, мультипотентные MSC могут быть надежно идентифицированы по их удлиненной фибробластоподобной морфологии. Напротив, MSC, которые приняли более уплощенную, четырехугольную морфологию с выраженными клетками стволовых клеток, не с готовностью принимают судьбы нейронных клеток и должны быть отброшены. В общем, мы не используем MSC с номерами прохода больше восьми. Чтобы сохранить свою стебельность, очень важно быстро пройти MSC, прежде чем они достигнут 100% слияния. И наоборот, сохранение MSC при слишком низком слиянии нежелательно. По нашему опыту, посевные MSC с плотностью 40 000 клеток / см 2 или просто пассивные клетки, которые являются 80% конфлюэнтными при соотношении 1: 2, позволяют достичь наилучших результатов.
Правильное создание и обслуживание сети DRG является критическимДетерминант успеха кокультуры. Время, необходимое для сбора DRG, должно быть сведено к минимуму. Индивидуальные ганглии следует обрабатывать атравматично, особенно во время отрыва от спинного мозга, когда лучше всего обращаться с нервными корнями. В общем, мы стремимся к периоду менее 2 ч между временем жертвоприношения животных и ферментативным перевариванием собранных DRG, поскольку длительный урожай приводит к мацерации ткани и к потере жизнеспособности клеток. Часто встречается отслоение нейронов DRG от субстрата во время культивирования. Чтобы это не произошло, покрытие должно быть свежеприготовлено и выполнено почти во время сбора ткани. В целом, большие, непереваренные кластеры DRG отделяются чаще и не дают успеха в сокультуре. Продолжительность ферментативного переваривания и количество растирания можно регулировать с целью достижения сети с видом, напоминающим рисунок 5 .
Хотя наш cocuПлатформа подчёркивает постоянную приверженность делу, только 20-30% культур, выполняемых параллельно, дают участвующим в судьбе клеткам Шванна 7 , 13 . Поэтому мы готовим достаточно DRG и SCLC для одновременного выполнения сокультур в трех-четырех 6-луночных планшетах. Мы выдвигаем гипотезу о том, что сочетание факторов, связанных с основной сетью DRG, включая их эмбриональный возраст, жизнеспособность клеток, плотность и топографию, влияет на успех кокультуры. Эти базовые переменные необходимо дополнительно исследовать и стандартизировать. Помимо ограничений на выход сокультиваторов следует искать средства для замены требования к нейронам DRG, полученным из крысы, и к животным продуктам. Кроме того, продолжительность протокола должна быть сокращена. Как сокращенная модификация нашего протокола, мы добились успеха в получении зрелых клеток Шванна из 10-ти дней нейросефер, высеваемых непосредственно на очищенные нейроны DRG, без предварительного генерирования SCLC , 10 .
Нейросферы, обогащенные нашим методом, служат надежным источником клеток нейронных и глиальных линий. Наша платформа для направления клеток-предшественников на приверженность судьбы имеет то преимущество, что избегает генетических манипуляций с присущими ей рисками, а результирующие клетки имеют отношение к трансплантации клеток, моделированию заболеваний и изучению глиальной дифференциации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы этой рукописи не имеют раскрытия, чтобы заявить.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Най-Су Вонга за предоставление аппаратуры для гипоксии и г-жи Алисы Луи за техническую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
References
- Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation? J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
- Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
- Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
- Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
- Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
- Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
- Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
- Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).
