Summary
Sinirsel potansiyeli olan ilik stromal hücreleri (MSC'ler) kemik iliğinde mevcuttur. Protokolümüz hipoksik ön koşullandırma yoluyla bu hücre popülasyonunu zenginleştirir ve bundan sonra onları olgun Schwann hücreleri haline getirir.
Abstract
Bu el yazması, kemik iliği stromal hücresi (MSC) popülasyonundan nöral progenitörler için zenginleştirmek ve bundan sonra olgun Schwann hücre kaderini yönlendirmek için bir araç tanımlamaktadır. Sıçan ve insan MSC'leri, epidermal büyüme faktörü (EGF) / bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) takviyesi ile düşük bağlanma alt tabakasında nörosferler olarak genişleyen, ardından geçici hipoksik koşullara (1 saat boyunca% 1 oksijen) tabi tutuldu. Neurospheres, poli-D-lizin / laminin kaplı doku kültürü plastik üzerine ekildi ve Schwann hücresi benzeri hücreleri (SCLC'ler) üretmek için β-Heregulin, bFGF ve trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF) içeren bir gliojenik kokteylde kültürlendi. SCLC'ler, E14-15 gebe Sprague Dawley sıçanlarından elde edilen saflaştırılmış dorsal kök gangliyon (DRG) nöronları ile 2 hafta boyunca kokültür yoluyla kader taahhüdüne yönlendirildi. Olgun Schwann hücreleri S100β / p75 ekspresyonunda kalıcılık sergiler ve miyelin segmentleri oluşturabilir. Bu şekilde üretilen hücrelerin potansiyelleriOmurilik hasarını takiben otolog hücre transplantasyonunda ve hastalığın modellemesinde uygulanmalar.
Introduction
Sinir öncüleri ve türevlerinin transplantasyonu, travmatik sinir yaralanması 1 , 2 ve nörodejenerasyon 3 , 4'ü takiben bir tedavi stratejisi olarak vaat ettiğini göstermektedir. Klinik uygulamadan önce aşağıdakileri sağlamak önemlidir: i) otolog bir kök / progenitör hücresi kaynağına erişmek ve genişletmek için bir yöntem ve ii) bunları ilgili, olgun hücre tiplerine yönlendiren bir araç 3 . Omurilik yaralanması için hücre tedavisine olan ilgimiz yetişkin dokulardan nöral progenitörlerin sağlam, otolog bir hücre kaynağı aramamıza neden oldu.
MSC'lerin bir alt popülasyonu nöral krestten kaynaklanır ve kemik iliğinden kolaylıkla erişilebilir durumdadır. Bu hücreler nöronlar ve glia üretebilen sinir öncüleridır 5 . Serebral iskemi hayvan modelleri, hipoksinin prol Beyinde nöral progenitörlerin çıkarımı ve multipotansı 6 . Bu, kemik iliği kaynaklı nöral progenitörlerin üzerine genişleme aracı olarak hipoksik ön koşullanmayı kullanma temelini oluşturdu.
Yaralı omuriliğe Schwann hücrelerinin transplantasyonu rejenerasyon 2'yi teşvik eder. SCLC'ler, gliogenik faktörlerle ( yani, β-Heregulin, bFGF ve PDGF-AA) destek yoluyla MSC'lerden üretilebilir, ancak fenotipik instabiliteyi gösterirler. Büyüme faktörlerinin geri çekilmesi üzerine, fibroblast benzeri bir fenotipe dönüşürler 7 . Anormal farklılaşma ve karsinogenez riski nedeniyle, hücre transplantasyonunda fenotipik instabilite istenmez. Schwann hücresi prekürsörleri, embriyonik periferik sinir 8 içindeki akson demetleri ile ilişkili olduğu için, saflaştırılmış embriyonik DRG nöronları 7 ile birlikte kültürel SCLC'lere yol açtık ,Ass = "xref"> 9. Elde edilen olgun Schwann hücreleri , in vitro 7 , 9 ve in vivo 10'da kadere bağlı ve ispat fonksiyonudur.
MSC'lerden nöral progenitörlerin zenginleştirilmesi için protokolümüz basit ve etkili olup sonraki tahliller için hücre sayısının artmasına neden olur. Kader kaynaklı Schwann hücrelerinin kokültür platformu vasıtasıyla türetilmesi, glial farklılaşmanın incelenmesine ve potansiyel klinik uygulama için stabil ve fonksiyonel Schwann hücrelerinin oluşturulmasına izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, NIH Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na ve aynı zamanda Hong Kong Üniversitesi'nden Li Ka Shing Tıp Fakültesi Öğretim ve Araştırma için Canlı Hayvanların Kullanımı Komisyonu tarafından onaylanmış şekilde gerçekleştirildi. İnsanlara kemik iliği örnekleri, bilgilendirilmiş onayı aldıktan sonra sağlıklı bağışçıların iliyak kretinden elde edildi. Protokoller, Kurumsal Değerlendirme Kurulu, Hong Kong Üniversitesi tarafından onaylandı.
1. Sıçan MSC Kültürlerinin Hazırlanması
- MSK'ların femurdan hasat edilmesi
- Kullanmadan önce en az 2 saat boyunca 180 ° C'de tüm diseksiyon aletlerini ( yani ince kesme makası, küt uçlu kesme makası ve dişli forseps) otoklavlayın.
- % 15 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin (P / S,% 1 v / v) ile takviye edilmiş asgari esansiyel orta-alfa modifikasyonu (aMEM) içeren MSC büyüme ortamı hazırlayın).
- Genç erkek Sprague Dawley sıçanlarını (200-250 g vücut ağırlığı) pentobarbitone aşırı doz (240 mg / kg vücut ağırlığı, intraperitoneal) ile kurban edin.
NOT: Farklı farelerden alınan ilik örnekleri ayrı ayrı işlenmelidir. - Kurbağalanmış hayvanları yatay konuma getirin. Karnını ve alt ekstremitelerini% 70 etanol ile iyice temizleyin.
- İnce uyluk makası ve forseps kullanarak medial uylukların üzerindeki cildi ve cilt altı dokuyu çıkarın. Uyluk kaslarını çevresel olarak femur maruz kalana kadar çıkarın. Diz ve kalça eklemleri görene kadar bunu proksimal ve distal olarak devam ettirin. Küt uçlu kesme makası kullanarak kalça ve diz eklemi vasıtasıyla femurun parçalanması.
NOT: Kemik iliğini bu aşamada maruz kalacak şekilde transarm etmeyin. Hasarsız femurları ileri işlem için laminer bir akış doku kültür kaputuna aktarın. - Metrafizden femurun distal ve proksimal uçlarını kesmek için küt uçlu kesme makası kullanın.
- 50 mL konik tüpün üzerine 70 μm hücre süzgeç yerleştirin. Maruz kalmış femoral kanal içine fosfat tamponlu salin (PBS, 10 mM Na2HPO4, pH 7.4) içeren 21 G, 10 mL şırınga yerleştirin ve tekrar tekrar yıkama ile kemik iliği konik tüp içine yıkayın.
NOT: Her bir femurun yıkanması için yaklaşık 20 mL PBS kullanılır. Temizlenen içeriğin rengi kan lekeli ve bulanık kalırsa, daha büyük bir hacim kullanılabilir. - 5 dakika boyunca 480 xg'de santrifüje ederek hücreleri toplayın. Süpernatanı atın. Hücre pelletini 10 mL MSC büyüme ortamı içinde tekrar süspanse edin. 10 cm doku kültürü dish.Place bir hücre inkübatör (37 ° C,% 5 CO 2 ) içine doku kültürü yemekleri üzerine plakalar hücreleri. Kaplamanın ilk gününü 0 gün olarak kaydedin.
NOT: Santrifüjü içeren tüm adımlarda, maksimum yavaşlama freni ayarlayın.
- MSC kolonilerinin kurulması ve yaygınlaştırılması
NOT: Bu protokol rIlik boşluğundan MSC'leri seçmek için bir araç olarak doku kültürü plastik tutunması üzerinde durur 11 . Kemik iliği içeriğinin doku kültürü plastikine 2 gün boyunca yapışmasına izin verilir.- 2. günde yapışkan olmayan hücreleri çıkarmak için kültür plakalarını 10 mL PBS ile üç kez durulayın. Durulamadan sonra PBS'yi 10 mL MSC büyüme maddesi ile değiştirin. Hücreleri PBS ile yıkayın ve her 3 günde MSC büyüme maddesi ile doldurun.
NOT: MSC kolonileri 6-7. Günde görünür olmalıdır ( Şekil 2A ). - Büyüme ortamı çıkarılarak hücreleri 10 günde geçirin ve hücreleri PBS ile durulayın. 1.5 mL rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifini ilave edin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Reaksiyonu nötralize etmek için 3 mL MSC büyüme ortamı ekleyin. Ayrılmış hücreleri, 250 xg'de 5 dakika santrifüj ederek toplayın.
- PBS içinde uygun bir seyreltme sonrasında bir hemositometre kullanarak topaklardaki hücreleri ölçün.
- MSC büyüme ortamında 10 cm'lik bir kültür plakasına 40,000 hücre / cm2 yoğunluğunda pasif hücreleri tohumlandı.
NOT: Sıçan MSC'leri pasajdan sonraki 2 gün içinde% 80-90'a kadar birleşmelidir ( Şekil 2B ). Hücreler, adım 1.2.2'de tarif edildiği gibi, en fazla 8 pasaj için geçirilebilir. MSC'ler immünositokimya ve trilineaj farklılaşması için kapasiteleri ile karakterize edilebilir ( Şekil 3 ) 12 . Yalnızca 3. ve 8. pasajlar arasındaki MSC kültürleri, daha sonraki hipoksik ön koşullandırma ve sinirsel progenitör zenginleştirmeye tabidir. Geçiş sayısının daha yüksek MSC'leri düzleştirilmiş bir morfolojiyi benimser ( Şekil 2C ) ve yeterli sayıdaki sinir öncüsü üretmez. Bu kültürler atılmalıdır.
- 2. günde yapışkan olmayan hücreleri çıkarmak için kültür plakalarını 10 mL PBS ile üç kez durulayın. Durulamadan sonra PBS'yi 10 mL MSC büyüme maddesi ile değiştirin. Hücreleri PBS ile yıkayın ve her 3 günde MSC büyüme maddesi ile doldurun.
2. İnsan BMSC Kültürlerinin Hazırlanması
- 9 mL MSC büyüme ortamı ile 1 mL insan kemik iliği aspiratı seyreltin veHücreleri 10 cm'lik bir doku kültürü çanak üzerinde. Kültürleri hücre inkübatöründe muhafaza edin (37 ° C,% 5 CO 2 ).
- Ortamı 2 gün sonra çıkarın ve yapışık olmayan hücreleri çıkarmak için kültürleri üç kez 10 mL PBS ile hafifçe durulayın. Son durulamadan sonra, PBS'yi çıkarın ve 10 mL MSC büyüme ortamı ile değiştirin. PBS durulamadan sonra her 3 günde bir büyüme ortamını tekrar doldurun.
NOT: MSC kolonileri 6-7. Günde görünür olmalıdır. Kolonilerin sayısı konular arasında değişebilir. - Adım 1.2.2'de açıklandığı gibi, hücreleri 10. günde geçirebilirsiniz. PBS içinde uygun bir seyreltme sonrasında bir hemositometre kullanarak topaklardaki hücreleri ölçün. MSC büyüme ortamında 10 cm'lik bir kültür plakası üzerine pasifleştirilmiş hücreleri 40.000 hücre / cm2 yoğunluğunda tohumlandı.
NOT: İnsan MSC'leri ( Şekil 2D ), sıçan MSC'lerine benzer bir morfolojiyi gösterir ve aynı şekilde geçişten sonraki 2 gün içinde% 80-90'lık birleşmeye ulaşmalıdır. Onlar chara olmalılarİmmünositokimya ve trilineaj farklılaşması için kapasiteleri vasıtasıyla citerleştirilir 12 . Sıçan MSC'lerde olduğu gibi, geçit 3 ve 8 arasında olan insan MSC'leri, daha sonraki hipoksik önkoşullamaya ve sinirsel progenitör zenginleştirmeye tabidir.
3. Hipoksik Ön Şartlandırma
- Halka kelepçeyi bıraktıktan sonra hipoksi oda bileşenlerini ( örn. Taban, kapak, tepsiler) sökün ve tek tek parçaları% 70 etanolle silerek temizleyin. 15 dakika için UV ışığı altında sterilizasyon için oda bileşenleri bir laminer akış doku kültür kaputu yerleştirin.
- Hipoksik ön koşullandırmadan önce ortamı alın ve sıçan ve insan MSC kültürlerini (bölüm 1 ve 2) 10 mL PBS ile durulayın. PBS, 25 mM HEPES ile takviye edilmiş 10 mL MSC büyüme ortamı ile değiştirilir.
NOT: 10 cm'lik bulaşıklar üzerinde kültürlenen MSC'ler, hipoksik ön koşullandırmadan önce% 80-90'lık konfluene ulaşmış olmalıdır. - Cul'u yerleştirinYemekleri hipoksi odasında arayın. Bölme bileşenlerini tekrar monte edin ve halka kelepçe sıkın. % 99 N 2 /% 1 O 2 gaz karışımını 5 dakika süreyle 10 L / dk'lık bir akış oranında odacık içine boşaltın.
- Gaz kaçağı olmadığından emin olmak için hipoksi odacığının bağlantı uçlarını kapatın. Oda hücre inkübatör (37 ° C,% 5 CO 2 ) içinde 16 saat boyunca yerleştirin.
- Hipoksik önkoşullamanın tamamlanmasının ardından, sonraki nöral progenitör zenginleştirme kültürüne hazırlık amacıyla bölmeden kültürleri çıkarın.
4. Sinirsel Progenitör Zenginleştirme Kültürü
- B27 (% 2 v / v), bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 20 ng / mL), epidermal büyüme faktörü (EGF, 20 ng / mL) ile takviyeli Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı / Ham besin karışımı F12'den (DMEM / F12) oluşan sinirsel progenitör ortamını hazırlayın. 20 ng / mL) ve P / S (% 1 v / v).
- Adım 1.2.2'de açıklandığı gibi hipoksik önkoşullamış sıçan / insan MSC'lerini çıkarın.Ayrılmış hücreleri, 250 xg'de 5 dakika santrifüj ederek toplayın. PBS içindeki uygun seyreltme sonrasında bir hemositometre kullanarak topak içerisindeki hücreleri ölçün.
- Nöral progenitör ortamda hücreleri tekrar süspanse edin ve 6.000 hücre / cm2'lik bir yoğunluğa sahip düşük bağlanmış, 6 oyuklu plakalar üzerine tohum ekleyin. Kültürü bir hücre inkübatör (37 ° C,% 5 CO 2 ) 12 gün boyunca yerleştirin. Sinir öncü madde ortamının% 75'ini her 3 günde bir doldurun.
NOT: Boyutlanabilir yapışkan olmayan hücre kümeleri 6-7. Günde gözlemlenmelidir. 10-12. Günde, ≥ 100 μm çapında nevrosferler görülebilir ( Şekil 4 ). Hipoksik önkoşullamış MSC'ler normoksik koşullar altında kültüre edilen MSC'lere kıyasla daha fazla sinir küresi üretmelidir 9 . - 12 mL'de nörosferler toplayın ve 10 mL'lik bir pipete aspire edin ve bunları 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Sinirküreleri, 250 xg'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
NOT: Neurospheres olabilirNestin ve GFAP 7 gibi nöral progenitör belirteçleri için 12. günde karakterizedir.
5. Öldürülen Schwann Hücrelerinin DRG Nöronları ile birlikte Kültür yoluyla Üretilmesi
- Saflaştırılmış sıçan DRG nöronlarının hazırlanması
- Kullanmadan önce en az 2 saat süreyle tüm diseksiyon aletlerini ( yani diseksiyon makası, forseps, iki mikrodiseksiyon forsepsi ve mikrodiseksiyon makası) otoklavda tutun.
- Poly-D-lisin (PDL, PBS içinde 10 ug / mL) ile 6-iyi doku kültürü plakalar 4 ° C'de gece boyunca kaplayın. PDL'yi çıkarın ve göz başına 1.5 mL PBS ile durulayın.
- Plakları laminin (PBS içinde 10 ug / mL) ile kaplayarak, 37 ° C'de 2 saat süreyle uygulayın. Tabletleri göz başına 1.5 mL PBS ile durulayın.
- B27 (% 2 v / v), L-glutamin (% 1 v / v), sinir büyüme faktörü (NGF, 20 ng / mL) ve P / S ile desteklenen nörobazal ortamdan oluşan DRG nöron bakım ortamını hazırlayın % V / v).
- B27 (% 2 v / v), L-glütamin (% 1), NGF (20 ng / mL), P / S (% 1), florodeoksiüridin (FDU, 10) takviyeli nörobazal ortamdan oluşan DRG nöron saflaştırma ortamını hazırlayın Μg / mL), ve uridin (10 μg / mL).
- Hamile fareleri 14-15 gebelik haftasında pentobarbital aşırı doz ile kurutun (240 mg / kg vücut ağırlığı, intraperitoneal).
- Kurbağalanmış hayvanları yatay konuma getirin. Karnını% 70 etanol ile iyice temizleyin.
- İnce diseksiyon makası ve forseps kullanarak hayvanın alt karın duvarını boyuna kesin. Diseksiyon makası kullanarak rahmin tanımlanması ve çıkarılması. Embriyonları açığa çıkarmak ve çıkarmak için uterus duvarını kesin. Embriyoları PBS ile dolu steril, 10 cm'lik bir kültür kabına aktarın. Kültüre buz koyun.
- Diseksiyon için hazırlanan embriyo, PBS (oda sıcaklığı) ile dolu steril, 10 cm'lik bir kültür kabına aktarın ve diseksiyon mikroskopunun altında konumlandırın. Embriyo salladı konumda olsun.
DEĞİLE: Beyaz renkli omurilik ve eklenen DRG'ler, embriyonun dorsal yüzeyi üzerinde, yarı saydam cildi üzerinden görülebilir. - Spinal kordun her iki yanından mikro-delici forseps yerleştirin ve çevresindeki yumuşak dokudan omuriliği ayırmaya başlamak için künt diseksiyon uygulayın. Boyun açıklığı ve kuyruk sapı boyunca mikrodiseksiyon forseps kullanarak hayvan ücretsiz omurilik kesin. Çevreleyen yumuşak dokudan kurtarmak için kordonun ventral yüzeyi üzerinde daha fazla künt diseksiyon gerçekleştirin.
- Serbest omuriliğin dorsal yüzeyi üzerinde kalan yumuşak dokuyu çıkarmak için mikroskopi forseps kullanın.
NOT: Bu aşamada yalnızca omurilik, sinir kökleri ve bağlı DRG kalmalıdır. - Mikrodiseksiyon forseps kullanarak bağlanan sinir köklerinden bireysel DRG'ler ayırın. DRG'leri PBS içeren 1.5 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne aktarmak için 1 mL'lik bir uça tutturulmuş bir pipet kalemi kullanın.
NOT: Her bir 1.5 mL tüp için, maksimum100 DRG barındırabilir. - 5 dakika için 250 xg'de DRG'leri santrifüjleyin ve rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifine (tüp başına 200 μL) tekrar süspanse edin. 10 dakika inkübe edin (37 ° C,% 5 CO 2 ). 250 xg'de 5 dakika boyunca DRG'leri santrifüjleyin, süpernatanı alın ve DRG nöron bakım ortamında tekrar süspansiyon haline getirin. 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak peleti yumuşak öğütme ile parçalayın. Uygun bir seyreltme işleminden sonra bir hemositometre kullanarak pellet içindeki hücreleri ölçün.
- Hücreleri, hücre başına 1.5 mL DRG nöron bakım ortamında PDL / laminin kaplı 6 oyuklu plakalara 5,000 hücre / cm2 yoğunlukta tohum ekti. Kültür iki gün sonra DRG nöron bakım ortamı çıkarın, PBS ile durulayın ve DRG nöron saflaştırma orta ile değiştirin.
NOT: Her saflaştırma döngüsü için DRG kültürlerini saflaştırma ortamı ile 2 gün süreyle, ardından bakım ortamında 1 gün inkübe edin. 3-4 saflaştırma çevriminden sonra, remTüm endojen gliaların oval olması bekleniyor 7 . Bu yaklaşık 14 gün sürmelidir. Saflaştırılmış kültürler, nöronal markör TUJ1 için pozitiflik gösterir ve S100β ekspresyonu için yoktur ( Şekil 5 ).
- Schwann hücre benzeri hücrelerin üretilmesi
- Β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (% 10) ile desteklenmiş αMEM'den oluşan glial indüksiyon ortamını hazırlayın ve P / S (% 1 v / v).
- Bölüm 4'te hazırlanan nevroküreleri, her bir göz başına 1.5 mL glial indüksiyon ortamında cm2 başına 5-10 küre yoğunluğunda plakaya / laminin kaplı 6 oyuklu plakalara yerleştirin. Hücreleri PBS ile duruladıktan sonra glial indüksiyon maddesini her 2 günde değiştirin.
NOT: Çekirdekli sinirkürelerden alınan hücrelerin 2. günde dışarı doğru göç ettiği görülmektedir. 7. günde göç eden hücrelerin konik bir görünümü vardır ve Schwann hücresi için immünopozitiflik göstermelidirP75 nörotrofin reseptörü (p75) ve S100β 7 belirteçleri. Bu hücrelere SCLCs denir.
- DRG nöronları ile SCLC'lerin birlikte kültürlenmesi
- 1: 1 hacim / hacim oranında DRG nöron bakım ortamı (adım 5.1.4) ve glial indüksiyon ortamı (adım 5.2.1) içeren kokültür ortamını hazırlayın.
- FBS (% 5), β-Heregulin (10 ng / mL) ve P / S (% 1 v / v) ile takviye edilmiş DMEM / F12'den oluşan Schwann hücre bakım ortamını hazırlayın.
- 7. SCLC'lerden kültür ortamını çıkarın, PBS ile yıkayın ve 5 dakika süreyle 37 ° C'de rekombinant enzimatik hücre ayrışma reaktifinin 0,5 mL / çukuru ile inkübe edin. Kültür ortamında SCLC'leri tekrar süspanse edin.
- Uygun bir seyreltme işleminden sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri ölçün.
- Saflaştırılmış DRG nöron kültürlerine SCLC'leri 1,000 hücre / cm2 yoğunluğunda ekti. Her 2 günde bir orta yenileyerek, kültürleri 14 gün boyunca muhafaza edin.
NOT: Kokültür sırasında SCLC'ler olgun Schwann hücrelerine özgü iğ benzeri morfolojiyi elde etmiştir ( Şekil 6 ). Bu hücreler, büyüme faktörlerinden çekildikten sonra fenotiplerinde kalır ve aksonları in vitro ve in vivo miyelinasyon yapabilirler 7 , 10 . Schwann hücre belirteçlerinin pozitifliği ( yani, p75 ve S100β) immünofloresans ile izlenmelidir. - Kokültürü tamamladıktan sonra, kademe 1.2.2'de anlatıldığı gibi, kaderi tamamlayan Schwann hücrelerini geçin. Kuyu başına 0.5 mL ayrışma reaktifi kullanın. Uygun bir seyreltme işleminden sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri ölçün.
- Kaderle bağlı Schwann hücrelerini 10.000 hücre / cm2'lik bir yoğunlukta Schwann hücre bakım ortamında tekrar süspanse edin. İmmünofloresans için PDL / laminin kaplı 6 gözlü plakalara tohum hücreleri.
NOT: Kültürler kaçınılmaz olarak bir fibroblastHücre kaderi 7 . Bu hücreler, birlikte yetiştirme tamamlandıktan sonra, kadere bağlı Schwann hücreleriyle birlikte pasajlanır. Bu fibroblast substratumun üzerinde yer alan Schwann hücreleri, başka yerlerde tarif edildiği gibi, PBS'nin (4 ° C) "soğuk jetleri" ile yıkandıktan sonra kolayca sökülebilir ve daha da genişletilebilir. Kadere bağlı Schwann hücreleri bakım ortamında 1 ay boyunca genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolümüzdeki başlıca aşamalara genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir. Özetle, sıçan ve insan MSC'leri, doku kültürü plastiğine uyularak seçilir. Genişletilmiş MSC'ler hipoksi ile önkoşullandırılır ve daha sonra nörosfer oluşturan koşullara tabidir. Neurospheres kaplanır ve SCLCs ayrımına izin verilir. SCLC'ler, kadere bağlı Schwann hücreleri oluşturmak için saflaştırılmış DRG nöronlarıyla birlikte kültürlenir.
Kültive edilmiş fare ve insan MSC'lerin morfolojisi Şekil 2'de gösterilmektedir. Sağlıklı inceltilmiş morfolojisi, pasaj sayısının çokluğunu kaybetmiş MSC'lerin dörtgen görüntüsünün aksine gösterilmiştir. Genişletilmiş sıçan ve insan kolonileri MSC belirteçlerinin ekspresyonunu, hematopoietik kök hücre belirteçlerinin yokluğunu ve trilineage difüzyon kapasitesini göstermelidirFerentiasyon ( Şekil 3 ). Geçiş 3 ve 8 arasındaki sağlıklı MSC'ler, 16 saat süreyle hipoksik ön koşullandırma işlemine tabi tutulur ve bundan sonra, EGF / bFGF takviyesi ile düşük yapışkanlı kültür plakalarına geçirilir. Hipoksik önkoşullama, daha büyük nörosferlerin yanı sıra daha büyük nörosfer boyutlarına da neden olur ( Şekil 4 ).
Neurospheres, PDL / laminin kaplı kültür plakalarına kaplanır ve β-Heregulin, bFGF ve PDGF-AA içeren glial indüksiyon ortamında kültür yoluyla SCLC haline gelmeye yol açar. SCLC'ler, Schwann hücrelerinin karakteristik konik morfolojisini ve buna karşılık gelen işaretleyici ifadeyi sergiler, ancak fenotipik olarak kararsızdırlar ve büyüme faktörlerinin kesilmesi üzerine bir fibroblast fenotipine geri dönerler.
Duyusal nöronlar ile birlikte yetiştirme, hücreye içsel bir etki yaratmak için bir ön şarttırKader taahhüdü için kaşıntı. Saflaştırılmış DRG ağlarının oluşturulması, endojen glianın çıkarılması için FDU ve uridin ile darbeli tedavi ile başarılır ve S100β immünopozitifliğinin yokluğu ile teyit edilmelidir ( Şekil 5 ). 7. günde, SCLC'ler pasifleştirilir ve saflaştırılmış DRG nöronları ile 14 gün boyunca birlikte kültürlenir ( Şekil 6 ). Kokültür bittikten sonra, olgun, kadere bağlı Schwann hücreleri ortaya çıkmalıdır.
Şekil 1: Protokolün genel görünüşü. Kemik iliği sıçan femurlarından veya insan ilyak krest aspiratlarından elde edilir. Kemik iliğindeki MSC'ler doku kültürü plastik üzerine ekleyebilir ve genişletebilir. Sinirsel potansiyele sahip MSC'leri zenginleştirmek için hücreler 16 saat boyunca% 1 O2'ye önceden kondisyonlanır ve daha sonra düşük yapışma kültürü plBFGF / EGF takviyesiyle kombine edilebilir. Bu, PDL / laminin kaplı doku kültürü plâstiği üzerine kaplanan ve SCLC'ler oluşturmak için glial indüksiyon ortamında kültürlenen nevrosferlerin oluşumuyla sonuçlanır. SCLC'ler pasifleştirilir ve olgunlaşmalarını sağlamak için saflaştırılmış DRG nöronları ile 2 hafta boyunca birlikte kültürlenir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: MSC kolonilerinin kurulması. Boyutlanabilir MSC kolonileri doku kültürü plastik üzerine kemik iliği hücrelerinin kaplanmasından 6-7 gün sonra görülebilir olmalıdır. Bir sıçan MSC kolonisinin temsili bir görüntüsü ( A ) gösterilirken, insan kolonileri benzer bir görünüm sergilemektedir. Koloniler 10. günde pasajlanabilir. Daha yüksek bir büyütme gözüyle bakıldığında, her iki sıçan (B ) ve insan ( D ) MSC'ler geçtikten sonra karakteristik bir fibroblast benzeri morfoloji sergilerler. Yüksek geçit sayıları için korunan MSC'ler yassı, dörtgen morfolojiye ( C ) sahiptir ve atılmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: MSC'lerin Karakterizasyonu. ( A - D ) İnsan MSC'lerinin temsilci görüntüleri. MSC'ler CD90 ( A ), CD73 ( B ) ve Stro-1 ( C ) gibi uygun belirteçlerin ekspresyonu ve CD45 ( D ) gibi hematopoietik kök hücre belirteçlerinin olmaması ile karakterize edilebilir. ( E - G ) Sıçan MProtokolde tarif edildiği gibi izole edilmiş ve genişletilmiş SC'ler, adipositler (Sudan Kırmızısı ile lekelenmiş yağ depoları E ), osteoblastlar (Alizarin Kırmızısı ile lekeli perisellüler matris) ve kondrositleri ( G ; Safranin ile lekelenmiş proteoglikanlar) O) uygun kültür koşulları altında. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: MSC'lerden sinir öncülerinin zenginleştirilmesi. Hem sıçan ( A ) hem de insan (MS) MSC'ler, EGF / bFGF ile desteklenmiş ortamda düşük yapışma doku kültürü plastik üzerinde kültürlendiğinde nörosfer oluştururlar. Sıçanın sayıları ve ortalama çapı (
Şekil 5: Saflaştırılmış sıçan DRG ağlarının kurulması. Saflaştırılmış DRG şebekeleri, antimikotik ajanlar FDU ve uridin (A) ile darbeli tedaviden sonra oluşturulmuştur. S100β ifade eden endojen gliadan (B) yoksun olan nörit ağları, SCLC'lerle birlikte kültür hazırdır. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: DRG nöronları ile birlikte kültür yoluyla kemik iliği kaynaklı Schwann hücrelerinin üretilmesi. Saflaştırılmış DRG nöronları ve insan SCLC'leri ile 2 haftalık kokültür bittikten sonra, iğ şeklinde, kadere bağlı Schwann hücreleri hem normoksi hem de hipoksi ile tedavi edilen gruplardan ( A ve D ) ortaya çıkmaktadır. Bu hücreler, p75 (B ve E) ve S100β (C ve F) Schwann hücre belirteçlerini ifade eder. İnsan çekirdeği antigeninin (HuNeu) ifadesi, S100β-pozitif hücrelerin sıçan DRG'lerinden kaynaklanan glial hücreleri kirletmediğini göstermektedir. Ölçek çubukları = 100 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hipoksik ön koşullandırma ve nörosfer kültürünü kullanarak nöral progenitörleri zenginleştirmeden önce MSC'lerin "kök salanlığını" korumak esastır. Tecrübelerimize göre, multipotent MSC'ler, uzatılmış fibroblast benzeri morfolojileri ile güvenilir şekilde tanımlanabilir. Buna karşın, belirgin sitokkelet stres lifleri ile daha yassı, dört köşeli morfoloji benimseyen MSC'ler, nöral hücre kaderlerini kolayca kabul etmemekte ve atılmaları gerekmektedir. Genel olarak, pasaj rakamları sekizden büyük MSC'leri kullanmıyoruz. Köklerini korumak için MSC'leri% 100 birleşmeden önce derhal geçmek önemlidir. Tersine, MSC'leri çok düşük bir konfluansa sahip tutmak arzu edilmemektedir. Deneyimlerimize göre, MSC'leri 40.000 hücre / cm2'lik bir yoğunlukta tohumlamak ya da sadece% 1 oranında birleşme oranına sahip olan hücreleri pasifleştirmek en iyi sonuçları verir.
DRG ağının düzgün bir şekilde kurulması ve bakımı bir eleştirmenKokültür başarısının determinantı. DRG hasatı için gerekli süre asgari düzeyde tutulmalıdır. Bireysel gangliyonlar, özellikle sinir köklerini işlemek için en iyi olduğu zaman, omuriliğin ayrılması sırasında atravmatik bir şekilde ele alınmalıdır. Genel olarak, hayvan kurban etme zamanı ile hasat edilen DRG'lerin enzimatik sindirimi arasında 2 saatten daha kısa bir süre hedefleniyoruz çünkü uzun süren hasat doku maserasyonu ve hücre yaşayabilirliğini kaybetmektedir. Kültür sırasında DRG nöronlarının alt tabakadan ayrılması sıklıkla karşılaşılır. Bunun oluşmasını önlemek için, kaplama taze hazırlanmalı ve hasat zamanı yakınında yapılmalıdır. Genel olarak, geniş, sindirilmemiş DRG kümeleri daha sık ayrılır ve kokültür başarısı sağlamaz. Şekil 5'e benzeyen bir görünüm elde etmek amacıyla enzimatik sindirim süresi ve öğütme miktarı ayarlanabilir.
Bizim cocuPlatformu sürekli olarak kader taahhüdünü uyandırır, paralel olarak gerçekleştirilen kültürlerin sadece% 20-30'u kadere bağlı Schwann hücrelerine verim verir 7 , 13 . Bu nedenle, üç ila dört adet 6 kuyucuklu kültür plakalarında kokültürün eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilmesi için yeterli miktarda DRG ve SCLC hazırlıyoruz. Embriyonik yaş, hücre yaşayabilirliği, yoğunluk ve topografi gibi temel DRG ağı ile ilgili faktörlerin bir kombinasyonunun birlikte kültür başarısını etkilediği hipotezi altındayız. Bu altta yatan değişkenlerin daha fazla araştırılması ve standartlaştırılması gerekir. Kokültür verimindeki sınırlamalardan başka, sıçan kökenli DRG nöronlarının ve hayvan ürünlerinin yerine geçmenin bir aracı aranmalıdır. Ayrıca protokolün süresi kısaltılmalıdır. Protokolümüzün kısaltılmış bir modifikasyonu olarak, SCLC'lerin önceki nesli olmaksızın doğrudan saflaştırılmış DRG nöronlarına ekilen günde 10 nevrosferden olgun Schwann hücreleri elde etmede başarılı olduk. , 10 .
Yöntemimize göre zenginleştirilmiş nörosüreler, nöronal ve glial soy hücrelerinin sağlam bir kaynağı olarak kullanılırlar. Öncü hücreleri kader taahhütüne yönlendirmek için kullandığımız platformumuz, genetik manipülasyondan kaçınmanın kendine özgü riskleri ile avantajlıdır ve ortaya çıkan hücreler, hücre nakli, hastalık modelleme ve glial farklılaşmanın incelenmesi ile alakalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu yazının tüm yazarları beyan etmek için herhangi bir açıklama yapmamıştır.
Acknowledgments
Yazarlar, teknik destek için hipoksi oda aparatı ve Bayan Alice Lui'yi sağladıkları için Dr. Nai-Sum Wong'u onaylamak istiyorlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
References
- Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation? J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
- Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
- Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
- Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
- Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
- Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
- Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
- Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).
