Summary
Marvstromceller (MSCs) med nevrale potensial finnes i benmarg. Vår protokoll berikker denne populasjonen av celler via hypoksisk forbehandling og deretter dirigerer dem til å bli modne Schwann-celler.
Abstract
Dette manuskriptet beskriver et middel for å berike for nevrale progenitorer fra marvstromcelle (MSC) -populasjonen og deretter å henvise dem til den modne Schwann-cellens skjebne. Vi utsatte rotte og humane MSC til forbigående hypoksiske tilstander (1% oksygen i 16 timer) etterfulgt av ekspansjon som neurosfærer på lavt bindingsunderlag med epidermal vekstfaktor (EGF) / basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF) tilskudd. Neurosfærer ble sådd på poly-D-lysin / laminin-belagt vevskulturplast og dyrket i en gliogen cocktail inneholdende β-heregulin, bFGF og blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) for å danne Schwann-cellelignende celler (SCLCs). SCLCs ble rettet til skjebneforpliktelse via kokkultur i 2 uker med rensede dorsalrotganglia (DRG) -neuroner oppnådd fra E14-15-gravid Sprague Dawley-rotter. Eldre Schwann-celler viser utholdenhet i S100p / p75-uttrykk og kan danne myelin-segmenter. Celler generert på denne måten har potensial aPlikasjoner i autolog celletransplantasjon som følge av ryggmargsskade, samt i sykdomsmodellering.
Introduction
Transplantasjonen av nevrale progenitorer og deres derivater demonstrerer løfte som en behandlingsstrategi etter traumatisk nerveskade 1 , 2 og nevrogenerasjon 3 , 4 . Før klinisk bruk er det viktig å sikre: i) en metode for tilgang og utvidelse av en autolog kilde til stamme / stamceller og ii) et middel for å lede dem til relevante modne celletyper 3 . Vår interesse for celleterapi for ryggmargenskade førte oss til å søke en robust, autolog cellekilde av nevrale progenitorer fra voksenvev.
En subpopulasjon av MSCs stammer fra nevralkampen og er lett tilgjengelig fra marvhulen. Disse cellene er nevrale progenitorer som kan generere nevroner og glia 5 . Dyrmodeller av cerebral iskemi viser at hypoksi fremmer progresjonen Iferasjon og multipotens av nevrale progenitorer i hjernen 6 . Dette var grunnlaget for å utnytte hypoksisk forkjøling som et middel til å ekspandere på margenavledede nevrale progenitorer.
Transplantasjonen av Schwann-celler i den skadede ryggraden fremmer regenerering 2 . SCLC kan genereres fra MSCs ved hjelp av tilskudd med gliogene faktorer ( dvs. p-heregulin, bFGF og PDGF-AA), men demonstrerer fenotypisk ustabilitet. Ved tilbaketrekking av vekstfaktorer vender de tilbake til en fibroblastlignende fenotype 7 . Fenotypisk ustabilitet er uønsket ved celletransplantasjon på grunn av risikoen for avvikende differensiering og karsinogenese. Som Schwann-celleprecursorer er assosiert med axonbunter innenfor den embryonale perifere nerve 8 , ble vi ført til coculture-SCLCer med rensede embryonale DRG-neuroner 7 ,Ass = "xref"> 9. Resulterende modne Schwann-celler er skjebneforpliktet og demonstrerer funksjon in vitro 7 , 9 og in vivo 10 .
Vår protokoll for berikelse av nevrale progenitorer fra MSC er enkel og effektiv og resulterer i en økning i celle nummer for etterfølgende analyser. Avledningen av skjebnebegrensede Schwann-celler via coculture-plattformen gjør det mulig å studere glialdifferensiering og for generering av stabile og funksjonelle Schwann-celler for potensiell klinisk anvendelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i henhold til NIHs retningslinjer for pleie og bruk av laboratoriedyr og godkjent av komiteen for bruk av levende dyr for undervisning og forskning, Li Ka Shing fakultet for medisin, universitetet i Hong Kong. Humane beinmargeprøver ble oppnådd fra iliackampen av sunne givere etter å ha oppnådd informert samtykke. Protokoller ble godkjent av Institutional Review Board, University of Hong Kong.
1. Fremstilling av rotte-MSC-kulturer
- Harvest av MSC fra lårbenet
- Autoklaver alle disseksjonsverktøy ( dvs. fin disseksjon av saks, stikkontakt saks og tanntang) ved 180 ° C i minst 2 timer før bruk.
- Forbered MSC vekstmedium bestående av minimal essensiell medium-alfa-modifisering (αMEM) supplert med 15% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin / streptomycin (P / S, 1% v / v).
- Offer unge Sprague Dawley rotter (200-250 g kroppsvekt) ved pentobarbiton overdose (240 mg / kg kroppsvekt, intraperitoneal).
MERK: Margeprøver fra forskjellige rotter skal behandles separat. - Legg de ofrede dyrene i hvilestilling. Rengjør magen og underdelene grundig med 70% etanol.
- Fjern hud og subkutant vev over mediallårene ved hjelp av fint dissekerende saks og tang. Fjern lårmuskulaturen periferisk til lårbenet er utsatt. Fortsett dette proximalt og distalt inntil knel og hofteleddene ses. Disarticulate lårbenet gjennom hofte og kneledd ved hjelp av trukket skissesaks.
MERK: Ikke gjennomfør lårbenet for å utsette marvhulen på dette stadiet. Overfør intakte lårbener til en laminar flyt vevskultur hette for videre behandling. - Bruk sløv tippe skjær for å transversere de distale og proksimale endene av lårbenet gjennom metafysen.
- Plasser en 70 μm cellesilver over et 50 ml konisk rør. Sett inn en 21 G, 10 ml sprøyte som inneholder fosfatbuffert saltvann (PBS, 10 mM Na 2 HPO 4 , pH 7,4) i den eksponerte lårkanalen og spyl marvinnholdet inn i det koniske rør ved gjentatt spyling.
MERK: Ca 20 ml PBS brukes til å skylle hver lårben. Hvis fargen på det spylede innholdet forblir blodfarget og uklart, kan et større volum brukes. - Samle celler ved sentrifugering ved 480 xg i 5 min. Kast supernatanten. Resuspender cellepellet i 10 ml MSC vekstmedium. Plasser cellene på en 10 cm vevskulturskål. Plasser vevskulturskålene i en celleinkubator (37 ° C, 5% C02). Ta opp den første dagen for plating som dag 0.
MERK: I alle trinn som involverer sentrifugering, sett bremsen for maksimal retardasjon.
- Etablering og utvidelse av MSC kolonier
MERK: Denne protokollen rElies på vevskulturplastikkadhæren som et middel for å velge for MSCs inne fra marmhulen 11 . Benmarginnholdet tillates å kle seg til vevskulturplastikken i 2 dager.- På dag 2 skylles kulturplaten tre ganger med 10 ml PBS for å fjerne ikke-adherente celler. Erstatt PBS med 10 ml MSC vekstmedium etter skylling. Vask cellene med PBS og fyll på med MSC vekstmedium hver 3. dag.
MERK: MSC kolonier bør være synlige på dag 6-7 ( figur 2A ). - Passerer cellene om dagen 10 ved å fjerne vekstmediet og skyll cellene med PBS. Tilsett 1,5 ml rekombinant enzymatisk celledissociationsreagens og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter. Tilsett 3 ml MSC vekstmedium for å nøytralisere reaksjonen. Samle de frittstående celler ved sentrifugering ved 250 xg i 5 min.
- Kvantifiser cellene i pelleten ved hjelp av et hemocytometer etter en passende fortynning i PBS.
- Frøpassasjerte celler ved en tetthet på 40.000 celler / cm2 i en 10 cm kulturplate i MSC vekstmedium.
MERK: Rotte MSC skal nå 80-90% sammenflytelse innen 2 dager etter passering ( Figur 2B ). Celler kan passasjeres som beskrevet i trinn 1.2.2 for opptil 8 passasjer. MSCs kan karakteriseres ved hjelp av immuncytokjemi og deres evne til trilineardifferensiering ( Figur 3 ) 12 . Kun MSC-kulturer mellom passasjer 3 og 8 er gjenstand for etterfølgende hypoksisk forkjøling og oppfølging av nevrale progenitorer. MSCs med større passasjegruppe adopterer en flatt morfologi ( figur 2C ) og produserer ikke tilstrekkelig antall neural progenitorer. Disse kulturer bør kastes.
- På dag 2 skylles kulturplaten tre ganger med 10 ml PBS for å fjerne ikke-adherente celler. Erstatt PBS med 10 ml MSC vekstmedium etter skylling. Vask cellene med PBS og fyll på med MSC vekstmedium hver 3. dag.
2. Fremstilling av humane BMSC-kulturer
- Fortynn 1 ml humant benmargsaspirat med 9 ml MSC vekstmedium og plater denCeller på en 10 cm vevskulturskål. Opprettholde kulturer i en celleinkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Fjern mediet etter 2 dager og skyll kultene forsiktig tre ganger med 10 ml PBS for å fjerne ikke-adherente celler. Etter den siste skyllingen, fjern PBS og erstatt den med 10 ml MSC vekstmedium. Etterfyll vekstmediet etter hver 3 dagers kultur etter PBS-skyllingen.
MERK: MSC kolonier bør være synlige på dag 6-7. Antallet kolonier kan variere mellom fag. - Passere cellene på dag 10, som beskrevet i trinn 1.2.2. Kvantifiser cellene i pelleten ved hjelp av et hemocytometer etter en passende fortynning i PBS. Sæd de passerte cellene ved en tetthet på 40.000 celler / cm2 på en 10 cm kulturplate i MSC vekstmedium.
MERK: Human MSCs ( Figur 2D ) viser en lignende morfologi til rotte MSCs, og skal likevel nå 80-90% sammenløp innen 2 dager etter passasje. De burde være charaCterized ved hjelp av immuncytokjemi og deres evne til trilineardifferensiering 12 . Som med rotte-MSC'er, er humane MSC som er mellom passasje 3 og 8 gjenstand for etterfølgende hypoksisk forkjøling og nerveprogenitorberikning.
3. Hypoksisk forkjøling
- Demonter hypokankammerkomponentene ( dvs. base, lokk, skuffer) etter at klossen er slipt og tørk de enkelte delene rent med 70% etanol. Plasser kammerkomponentene i en laminar flytvevskulturkapsel for sterilisering under UV-lys i 15 minutter.
- Før hypoksisk forkjøling, fjern mediet og skyll rotte- og humane MSC-kulturer (avsnitt 1 og 2) med 10 ml PBS. Erstatt PBS med 10 ml MSC vekstmedium tilsatt 25 mM HEPES.
MERK: MSCene som er dyrket på 10 cm-retter, bør ha nådd 80-90% konfluens før de blir utsatt for hypoksisk forkjøling. - Plasser culTure retter i hypoksi kammeret. Monter kammerkomponentene igjen og stram klemklemmen. Spyl en gassblanding av 99% N 2 /1% O 2 inn i kammeret ved en strømningshastighet på 10 liter / min i 5 min.
- Forsegle hypoxiekammerets forbindende ender for å sikre at det ikke er gasslekkasje. Plasser kammeret inne i celleinkubatoren (37 ° C, 5% CO2) i 16 timer.
- Ved fullføring av den hypoksiske forkondisjoneringen, fjern kulturer fra kammeret som forberedelse for den etterfølgende nevrale progenitorberikningskultur.
4. Neural Progenitor Enrichment Culture
- Forbered neural progenitor medium bestående av Dulbeccos modifiserte eagle medium / Ham næringsblanding F12 (DMEM / F12) supplert med B27 (2% v / v), basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF, 20 ng / ml), epidermal vekstfaktor (EGF, 20 ng / ml) og P / S (1% v / v).
- Fjern de hypoksiske forkjølte rotte / humane MSCene, som beskrevet i trinn 1.2.2.Samle de frittstående celler ved sentrifugering ved 250 xg i 5 min. Kvantifiser cellene i pelleten ved hjelp av et hemocytometer etter passende fortynning i PBS.
- Resuspender cellene i neural progenitor medium og frø på low-attachment, 6-brønn plater med en tetthet på 6000 celler / cm2. Plasser kulturen i en celleinkubator (37 ° C, 5% CO2) i 12 dager. Replenish 75% av nevrale progenitor medium hver 3. dag.
MERK: Større, ikke-adherente celleklynger bør observeres etter dag 6-7. Ved dag 10-12 kan nevosfærer med diameter ≥ 100 μm observeres ( figur 4 ). Hypoksiske forutviklede MSC-preparater bør gi mer nevrosfærer sammenlignet med MSC dyrket under normoksiske forhold 9 . - Samle nevrospherer på dag 12 ved å aspirere dem i en 10 ml pipette og overføre dem til et 15 ml konisk rør. Sentrifuger nevroposene ved 250 xg i 5 minutter.
MERK: Neurospheres kan væreKarakterisert på dag 12 for nevrale stamcellermarkører, som nestin og GFAP 7 .
5. Generering av skjebne-engasjert Schwann-celler via kultivering med DRG-neuroner
- Fremstilling av rensede DRG-neuroner av rotte
- Autoklaver alle disseksjonsverktøy ( dvs. disseksjonssaks , tauer, to mikrodisseksjonspincer og microdissecting saks) ved 180 ° C i minst 2 timer før bruk.
- Coat 6-brønners vevskulturplater med poly-D-lysin (PDL, 10 μg / ml i PBS) ved 4 ° C over natten. Fjern PDL og skyll med 1,5 ml PBS per brønn.
- Fortsett med å belegge platene med laminin (10 μg / ml i PBS) ved 37 ° C i 2 timer. Skyll platene med 1,5 ml PBS per brønn.
- Forbered DRG-neuron vedlikeholdsmedium, bestående av nevobasalt medium tilsatt B27 (2% v / v), L-glutamin (1% v / v), nervevækstfaktor (NGF, 20 ng / ml) og P / S % V / v).
- Forbered DRG-neuronrensingsmedium, bestående av nevobasalt medium tilsatt B27 (2% volum / volum), L-glutamin (1%), NGF (20 ng / ml), P / S (1%), fluorodeoksyuridin (FDU, 10 Μg / mL) og uridin (10 μg / mL).
- Offer gravide rotter på svangerskapsdagen 14-15 ved pentobarbital overdose (240 mg / kg kroppsvekt, intraperitoneal).
- Legg de ofrede dyrene i hvilestilling. Rengjør magen grundig med 70% etanol.
- Klipp underlivets undervegg i lengden ved hjelp av fint dissekerende saks og pincet. Identifiser og fjern livmoren ved hjelp av disseksjonssaks. Kutt livmorveggen for å eksponere og pakke ut embryoer. Overfør embryoer til en steril, 10 cm kultiveringsfett fylt med PBS. Plasser kulturretten på isen.
- Overfør embryoen beregnet til disseksjon til en steril, 10 cm kulturskål fylt med PBS (romtemperatur) og plasser den under et disseksjonsmikroskop. Ha embryoen i utsatt stilling.
IKKEE: Den hvite ryggmargen og de vedlagte DRGene kan sees over det dorsale aspektet av embryoet, gjennom gjennomsiktig hud. - Sett inn microdissecting tang på hver side av ryggmargen og bruk stump disseksjon for å begynne å skille ryggraden fra det omkringliggende mykvevet. Klipp ryggraden fri fra dyret ved hjelp av mikrodisseksjonspincer langs halsåpningen og halen. Utfør ytterligere stum disseksjon over det ventrale aspektet av ledningen for å frigjøre det fra det omkringliggende myke vevet.
- Bruk microdissecting tang for å fjerne resterende mykvev over det dorsale aspektet av den frigjorte ryggmargen.
MERK: På dette stadiet bør bare ryggmargen, nerverøtter og tilhørende DRG forbli. - Løsne individuelle DRGer fra deres tilkoblede nerverøtter ved hjelp av microdissecting tang. Bruk en pipettpenn festet til en 1 ml spiss for å overføre DRGene til et 1,5 ml sterilt sentrifugerør som inneholder PBS.
MERK: For hvert 1,5 ml rør, maksimalt100 DRGer kan innkvarteres. - Sentrifuger DRGene ved 250 xg i 5 minutter og resuspender dem i rekombinant enzymatisk celledissocieringsreagens (200 μl per rør). Inkuber (37 ° C, 5% CO2) i 10 minutter. Sentrifuger DRGene ved 250 xg i 5 minutter, fjern supernatanten og resuspender i DRG-neuron vedlikeholdsmedium. Dissocier pelleten ved forsiktig triturering ved hjelp av en 200 μl pipettespiss. Kvantifiser cellene i pelleten ved hjelp av et hemocytometer etter en passende fortynning.
- Sæd cellene ved en tetthet på 5000 celler / cm2 i PDL / lamininbelagte 6-brønnsplater i 1,5 ml DRG-neuron vedlikeholdsmedium per brønn. Etter to dager med kultur, fjern DRG nevron vedlikeholdsmedium, skyll med PBS, og erstatt med DRG neuron rensemiddel.
MERK: For hver renseprosess behandler du DRG-kulturer med rensemiddel i 2 dager, etterfulgt av 1 ukers inkubasjon i vedlikeholdsmedium. Etter 3-4 rensingssykluser, remmenOval av all endogen glia forventes 7 . Dette bør ta omtrent 14 dager. Rensede kulturer tester positivt for nevronmarkøren TUJ1 og er fraværende for S100β-ekspresjon ( Figur 5 ).
- Generering av Schwann-cellelignende celler
- Fremstille glial-induksjonsmedium bestående av aMEM suppleret med p-heregulin (100 ng / ml), bFGF (10 ng / ml), blodplateavledet vekstfaktor (PDGF-AA, 5 ng / ml), FBS (10%) og P / S (1% v / v).
- Plate nevrosfærene fremstilt i avsnitt 4 i PDL / lamininbelagte 6-brønnsplater med en tetthet på 5-10 sfærer per cm2 i 1,5 ml glial induksjonsmedium per brønn. Erstatt glial induksjonsmedium hver 2. dag etter skylling av cellene med PBS.
MERK: Celler fra frøede nevrosfærer settes til å migrere utover ved dag 2. I dag 7 har migrerende celler et avsmalende utseende og skal demonstrere immunopositivitet for Schwann-cellenMarkører p75 nevrotrofinreseptor (p75) og S100β7. Disse cellene blir referert til som SCLCs.
- Coculture of SCLCs med DRG neurons
- Klargjør kokkulturmedium bestående av DRG-neuronvedlikeholdsmedium (trinn 5.1.4) og glialinduksjonsmedium (trinn 5.2.1) ved et volumforhold mellom 1: 1 og volum.
- Klargjør Schwann-cellevedlikeholdsmedium bestående av DMEM / F12 tilsatt FBS (5%), P-Heregulin (10 ng / ml) og P / S (1% v / v).
- Fjern kulturmediet fra dag 7 SCLC, skyll dem med PBS og inkuber dem med 0,5 ml / brønn rekombinant enzymatisk celledissocieringsreagens ved 37 ° C i 5 minutter. Resuspendere SCLCene i kokkulturmedium.
- Kvantifiser cellene ved hjelp av et hemocytometer etter en passende fortynning.
- Se SCLCene på rensede DRG-neuronkulturer ved en tetthet på 1000 celler / cm2. Opprettholde kulturen i 14 dager, med middels utskifting hver 2. dag.
MERK: Under coculture kjøpte SCLCs den spindellignende morfologien som er typisk for modne Schwann-celler ( figur 6 ). Disse cellene vedvarer i sin fenotype etter tilbaketrekking av vekstfaktorer og er i stand til å myelinere axoner in vitro og in vivo 7 , 10 . Positiviteten til Schwann-cellemarkører ( dvs. p75 og S100β) bør overvåkes ved immunfluorescens. - Etter ferdigstillelse av kultursøking, ble passasje-skjedde Schwann-celler, som beskrevet i trinn 1.2.2. Bruk 0,5 ml dissocieringsreagens per brønn. Kvantifiser cellene ved hjelp av et hemocytometer etter en passende fortynning.
- Resuspenge skjebne-engasjert Schwann-celler i Schwann-cellevedlikeholdsmedium ved en tetthet på 10.000 celler / cm2. Frøceller til PDL / laminin-belagte 6-brønnsplater for immunfluorescens.
MERK: Kokulturer inneholder uunngåelig MSC som har tatt en fibroblastCelle skjebne 7 . Disse cellene blir passert sammen med skjebne-engasjert Schwann-celler ved fullføring av kulturen. Schwann-celler som ligger på toppen av dette fibroblast-substratet, kan lett løsnes og videre utvides etter skylning med "kaldstråler" av PBS (4 ° C), som det er beskrevet andre steder 13 . Skjebne-skjulte celler kan utvides i vedlikeholdsmedium i 1 måned.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversikt over hovedstadiene i protokollen er illustrert i figur 1 . I sammendraget velges rotte- og humane MSCer for å vedheve vevskulturplast. Utvidede MSCs er forkjølt med hypoksi og er så gjenstand for neurosfæredannende tilstander. Neurosfærer er belagt og tillatt å skille seg inn i SCLC. SCLCs blir kultivert med rensede DRG-neuroner for å generere skjebnebegrensede Schwann-celler.
Morfologien til dyrkede rotte og humane MSC er illustrert i figur 2 . Deres sunne, koniske morfologi er vist i kontrast til det firkantede utseendet av MSC som opprettholdes for høye passasjer, som har mistet sin multipotensitet. Utvidet rotte og humane kolonier bør demonstrere uttrykket av MSC markører, et fravær av hematopoietiske stamcelle markører, og kapasiteten til trilineage difFerentiation ( figur 3 ). Sunn MSCs fra mellom passasjer 3 og 8 er underlagt hypoksisk forkjøling i 16 timer og blir deretter passert på kuleplater med lav adhesjon med EGF / bFGF-tilskudd. Hypoksisk forbehandling resulterer i større antall nevrosfærer, samt større gjennomsnittlige neurosfæren størrelser ( figur 4 ).
Neurosfærer plateres på PDL / laminin-belagte kulturplater og induseres til å bli SCLC ved dyrking i glial induksjonsmedium inneholdende P-Heregulin, bFGF og PDGF-AA. SCLCs utviser den karakteristiske avsmalnende morfologi av Schwann-celler og det tilsvarende markøruttrykk, men de er fenotypisk ustabile og vender tilbake til en fibroblastfenotype ved avbrudd av vekstfaktorer
Kokultur med sensoriske nevroner er en forutsetning for å skape en celle-inneboende svKløe til skjebnenes forpliktelse. Etablering av rensede DRG-nettverk oppnås ved hjelp av pulserende behandling med FDU og uridin for å fjerne endogen glia og bør bekreftes ved fravær av S100β immunopositivitet ( Figur 5 ). På dag 7 passeres SCLCs og kokes med rensede DRG-neuroner i 14 dager ( figur 6 ). Etter ferdigstillelse av dyrkningen skal modne, skjebne-engasjerte Schwann-celler oppstå.
Figur 1: Oversikt over protokollen. Benmarg er oppnådd fra enten rotter femur eller humant iliac crest aspirater. MSCs fra benmargenet kan feste og ekspandere på vevskulturplast. For å berikke for MSCer med nevrale potensial, forutses cellene i 1% 02 i 16 timer og blir deretter passert på low adhesion culture plAtes med bFGF / EGF tilskudd. Dette resulterer i dannelsen av neurospherer, som er plettet på PDL / laminin-belagt vevskulturplast og dyrket i glial-induksjonsmedium for å generere SCLC. SCLCs passerer og kokes med rensede DRG-neuroner i 2 uker for å lede dem til modenhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Etablering av MSC kolonier. Større MSC-kolonier bør være synlige 6-7 dager etter plating av benmargsceller på vevskulturplast. Et representativt bilde av en rotte-MSC-koloni er vist ( A ), mens humane kolonier viser et lignende utseende. Kolonier kan passeres på dag 10. Sett ved høyere forstørrelse, både rotte (B ) og humane ( D ) MSC'er utviser en karakteristisk fibroblastlignende morfologi etter passasje. MSCer som opprettholdes for høye passasjegrupper, oppnår en flatt, firkantet morfologi ( C ) og bør kasseres. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av MSCs. ( A - D ) Representative bilder av menneskelige MSCs. MSCs kan karakteriseres ved uttrykk av passende markører, slik som CD90 ( A ), CD73 ( B ) og Stro-1 ( C ), og ved fravær av hematopoietiske stamcellemarkører, slik som CD45 ( D ). ( E - G ) Rat MSCs isolert og utvidet som beskrevet i protokollen demonstrerer multipotens i deres evne til å danne adipocytter ( E ; fettavsetninger farget med Sudan Red), osteoblaster ( F ; pericellulær matriks farget med Alizarin Red) og kondrocytter ( G ; proteoglykaner farget med Safranin- O) under passende kulturbetingelser. Skalestenger = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Berikning av nevrale progenitorer fra MSCs. Både rotte ( A ) og humane ( C ) MSCer danner neurosfærer når de dyrkes ved vævskulturplast med lav adhesjon i medium tilsatt EGF / bFGF. Tallene og gjennomsnittlig diameter av rotte (
Figur 5: Etablering av rensede rotte DRG-nettverk. Renset DRG-nettverk etableres etter pulserende behandling med antimitotiske midler FDU og uridin (A). Neuritt-nettverk som er uten S100β-uttrykkende endogent glia (B), er klare for dyrking med SCLC. Skalestenger = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Generering av benmarg-avledede Schwann-celler via coculture med DRG-neuroner. Etter å ha fullført 2 uker med kulturer med rensede DRG-neuroner og humane SCLCs, kommer spindelformede, skjebne-engasjerte Schwann-celler fra både normoksie- og hypoksybehandlede grupper ( A og D ). Disse cellene uttrykker Schwann-cellemarkørene p75 (B og E) og S100β (C og F). Ekspresjonen av humant kjerneantigen (HuNeu) demonstrerer at de S100p-positive celler ikke forurenser glialceller som stammer fra rotte-DRG'er. Skalestenger = 100 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er viktig å opprettholde "stivhet" av MSC før anrikning av nevrale progenitorer via hypoksisk forbehandling og neurosfærekultur. Fra vår erfaring kan multipotente MSCs pålitelig identifiseres av deres langstrakte fibroblastlignende morfologi. I motsetning til dette, har MSC som har vedtatt en mer flatt, firkantet morfologi, med fremtredende cytoskeletale stressfibre, ikke lett å vedta nevrale cellefeller og bør kasseres. Generelt bruker vi ikke MSCer med passasjerer større enn åtte. For å bevare deres stilhet er det viktig å raskt passere MSC før de når 100% sammenløp. Omvendt er det uønsket å opprettholde MSC ved en for lav sammenflytelse. Fra vår erfaring, sørger MSC med en tetthet på 40.000 celler / cm2, eller bare passerer celler som er 80% sammenhengende i forholdet 1: 2, og gir de beste resultatene.
Riktig etablering og vedlikehold av DRG-nettverket er kritikerAl determinant av coculture suksess. Tiden som kreves for DRG-høsting, skal holdes på et minimum. Individuelle ganglia skal håndteres på atraumatisk måte, spesielt under løsrivelse fra ryggmargen, når det er best å bare håndtere nerverøttene. Generelt tar vi sikte på en periode på mindre enn 2 timer mellom dyretidspunktet og den enzymatiske fordøyelsen av høstede DRG, som en langvarig innhøstingsresultater i vevsmacerasjon og tap av celle-levedyktighet. Frigivelsen av DRG-neuroner fra substratet under kulturen oppstår ofte. For å forhindre at dette oppstår, bør belegget være tilberedt og utført nær tidspunktet for vevshøst. Generelt løsner store, ufordøpte DRG-klynger oftere og gir ikke suksess for coculture. Varigheten av enzymatisk fordøyelse og mengden triturering kan justeres, med sikte på å oppnå et nettverk med et utseende som ligner figur 5 .
Mens vår cocuDenne plattformen fremkaller konsekvent skjebnenes forpliktelse, bare 20-30% av kulturer utført i parallelle avkastningsforpliktede Schwann-celler 7 , 13 . Vi forbereder derfor nok DRG og SCLC til samtidig å utføre kulturer i tre til fire 6-brønne kulturplater. Vi antar at en kombinasjon av faktorer som er relatert til det underliggende DRG-nettverket, inkludert deres embryonalder, cellelevbarhet, tetthet og topografi, påvirker coculture suksess. Disse underliggende variablene må undersøkes og standardiseres videre. Bortsett fra begrensninger i dyrkningsutbyttet, bør man søke etter et middel for å erstatte kravet til rotte-avledede DRG-neuroner og animalske produkter. Videre bør protokollens varighet forkortes. Som en forkortet modifikasjon av protokollen vår har vi hatt suksess med å utlede modne Schwann-celler fra dag 10 nevosfærer sådd direkte på rensede DRG-neuroner, uten tidligere generering av SCLCs , 10 .
Neurosfærer beriket via vår metode tjener som en robust kilde til celler av nevron- og glial-linjer. Vår plattform for å styre forløperceller til skjebnenes forpliktelse har fordelen av å unngå genetisk manipulering, med dens inneboende risiko, og de resulterende cellene er av relevans for celletransplantasjon, sykdomsmodellering og studiet av glialdifferensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere av dette manuskriptet har ingen opplysninger om å erklære.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Dr. Nai-Sum Wong for å gi hypoxiekammerapparatet og fru Alice Lui for den tekniske støtten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
References
- Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation? J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
- Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
- Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
- Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
- Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
- Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
- Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
- Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).
