Method Article

Pré-condicionamento hipóxico de células progenitoras derivadas da medula como fonte para a geração de células maduras de Schwann

DOI:

10.3791/55794

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June 14th, 2017

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1School of Biomedical Sciences, The University of Hong Kong, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The University of Hong Kong

In This Article

Summary

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As células do estroma da marrow (MSCs) com potencial neural existem dentro da medula óssea. Nosso protocolo enriquece essa população de células por meio de pré-condicionamento hipóxico e, posteriormente, as direciona para se tornar células maduras de Schwann.

Abstract

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Este manuscrito descreve um meio de enriquecer para os progenitores neurais da população de células do estroma da medula (MSC) e, posteriormente, direcioná-los para o destino das células maduras de Schwann. Nós submetimos MSCs de ratos e humanos a condições hipóxicas transitórias (1% de oxigênio por 16 h), seguido de expansão como neurospheres com substrato de baixa inserção com fator de crescimento epidérmico (EGF) / suplementação básica de fator de crescimento de fibroblastos (bFGF). As neurosferas foram semeadas em plástico de cultura de tecido revestido com poli-D-lisina / laminina e cultivadas em um coque gliogênico contendo β-Heregulin, bFGF e o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) para gerar células semelhantes a células de Schwann (SCLCs). Os SCLCs foram direcionados para o compromisso do destino via cocultura durante 2 semanas com neurônios de gânglios radiculares dorsais purificados (DRG) obtidos de ratos Sprague Dawley grávidas E14-15. As células maduras de Schwann demonstram persistência na expressão de S100β / p75 e podem formar segmentos de mielina. As células geradas dessa maneira têm potencialPplicações no transplante de células autólogas após lesão da medula espinhal, bem como na modelagem da doença.

Introduction

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O transplante de progenitores neurais e seus derivados demonstra promessa como estratégia de tratamento após lesão do nervo traumático 1 , 2 e neurodegeneração 3 , 4 . Antes da aplicação clínica, é essencial assegurar: i) um método para acessar e expandir uma fonte autóloga de células progenitoras e / ou ii) um meio para direcioná-las para tipos relevantes de células maduras 3 . O nosso interesse na terapia celular por lesão da medula espinhal levou-nos a buscar uma fonte celular robusta e autóloga de progenitores neurais de te....

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Protocol

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Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados em estrita conformidade com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovado pelo Comitê de Uso de Animais Vivos para Ensino e Pesquisa, Faculdade de Medicina Li Ka Shing, da Universidade de Hong Kong. As amostras de medula óssea humana foram obtidas da crista ilíaca de dadores saudáveis ​​após o consentimento informado. Os protocolos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional, a Universidade de Hong Kong.

1. Preparação de Culturas de MSC de Rato

  1. Colheita de MSCs do fêmur
    1. Autoclave todas as ferramentas de disseca....

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Results

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Uma visão geral das etapas-chave do nosso protocolo está ilustrada na Figura 1 . Em resumo, os MSC de ratos e humanos são selecionados por aderência ao plástico de cultura de tecidos. Os MSC expandidos são pré-condicionados com hipoxia e estão sujeitos a condições de formação de neurosfera. Neurospheres são banhados e permitidos para se diferenciar em SCLCs. Os SCLCs são cultivados com neurônios DRG purificados para gerar células Schwann comprometidas com o .......

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Discussion

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É essencial preservar a "cautela" dos MSCs antes do enriquecimento de progenitores neurais através de pré-condicionamento hipóxico e cultura da neurosfera. De nossa experiência, os MSCs multipotentes podem ser identificados de forma confiável por sua morfologia semelhante a fibroblastos alongada. Em contraste, os MSCs que adotaram uma morfologia quadrangular mais achatada, com fibras proeminentes de estresse citoesquelético, não adotam prontamente os destinos das células neurais e devem ser descartados. Em ger.......

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Disclosures

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Todos os autores deste manuscrito não têm divulgação para declarar.

Acknowledgements

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Os autores gostariam de reconhecer o Dr. Nai-Sum Wong para fornecer o aparelho de câmara de hipoxia e a Sra. Alice Lui para o suporte técnico.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
&alfa; MEMSigmaaldrichM4526
DMEM/F12Thermofisher scientific12400-024
Meio neurobasalThermofisher scientific21103-049
FBSBioseraFB-1280/500
B27Thermofisher scientific17504-001
Fator de crescimento epidérmico (EGF)Thermofisher scientific
Fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF) Peprotech100-18B/100UG
Fator de crescimento nervoso (NGF) MilliporeNC011
Fator de crescimento derivado de plaquetas-AA (PDGF-AA)Peprotech100-13A
Heregulina beta-3, domínio EGF (β-Her)Millipore01-201
UridinaSigmaaldrichU3003
5-Fluro-2' - desoxiuridina (FDU)SigmaaldrichF0503
Poli-D-lisina (PDL)SigmaaldrichP7886-1G
LamininaThermofisher científico23017015
GlutaMAXThermofisher científico35050061
Penicilina / estreptomicina (P/S)Thermofisher Scientific15140-122
TrypLE ExpressThermofisher Scientific12604-013
Placa de 10 cm para culturaaderenteTPP93100Usado para seleção de MSCs por adesão à cultura de tecidos
Placa de 6 poços para cultura aderenteTPP92006Usado para expansão de MSCs após a passagem
Placa UltraLow de 6 poços para cultura não aderenteCorning3471Usado para enriquecimento de progenitores neurais
anti-humano CD90 (Thy-1)BD Biosciences555593
anti-humano CD73BD Biosciences550256
anti-humano/rato STRO-1R& D SystemsMAB1038
R & anti-nestin humano D SystemsMAB1259
anti-humano CD45BD Biosciences555480
anti-rato CD90 (Thy-1)BD Biosciences554895
anti-rato CD73BD Biosciences551123
anti-rato nestinBD BiosciencesMAB1259
anti-rato CD45BD Biosciences554875
Anti-S100βDakoZ031101
Anti-p75MilliporeMAB5386
Anti-GFAPSigmaaldrichG3893
Anti-Classe III-beta tubulina (Tuj-1)CovanceMMS-435P
Núcleos anti-humanosMilliporeMAB1281
Câmara de hipóxiaBillups-RothenbergMIC-101
HEPES amortecedorSigmaaldrichH4034-100G
PHG0313

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
  2. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation....

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Hypoxic PreconditioningMarrow Stromal CellsNeural ProgenitorsSchwann Cell DifferentiationNeurosphere CultureDorsal Root GangliaCo culture TechniqueGlial Induction MediumS100 Beta ExpressionMyelin Segment Formation

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