Summary
Marvstromala celler (MSCs) med neurala potential finns inom benmärgen. Vårt protokoll berikar denna population av celler via hypoxisk förkonditionering och därefter leder dem till mogna Schwann-celler.
Abstract
Detta manuskript beskriver ett medel för att berika för neurala progenitorer från marvstromcells-populationen (MSC) och därefter för att rikta dem till den mogna Schwanncellfasen. Vi utsatte råtta och humana MSC till övergående hypoxiska tillstånd (1% syre under 16 timmar) följt av expansion som neurospherer vid substrat med lågt bindande medel med epidermal tillväxtfaktor (EGF) / basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) -tillskott. Neurospheres såddes på poly-D-lysin / lamininbelagd vävnadskulturplast och odlades i en gliogen cocktail innehållande P-Heregulin, bFGF och blodplätt-härledd tillväxtfaktor (PDGF) för att alstra Schwann-cellliknande celler (SCLC). SCLCs riktades till ödetes engagemang via odling i 2 veckor med renade dorsala rotganglier (DRG) neuroner erhållna från E14-15 gravida Sprague Dawley-råttor. Mogna Schwann-celler uppvisar persistens i S100p / p75-uttryck och kan bilda myelin-segment. Celler som alstras på detta sätt har potential aPlikationer vid autolog celltransplantation efter ryggmärgsskada, såväl som vid sjukdomsmodellering.
Introduction
Transplantationen av neurala progenitorer och deras derivat demonstrerar löfte som en behandlingsstrategi efter traumatisk nervskada 1 , 2 och neurodegenerering 3 , 4 . Före klinisk tillämpning är det viktigt att säkerställa: i) en metod för att komma åt och expandera på en autolog källa till stam- / stamceller och ii) ett sätt att rikta dem till relevanta mogna celltyper 3 . Vårt intresse för cellterapi mot ryggmärgsskada ledde oss till att söka en robust autolog cellkälla av neurala progenitorer från vuxna vävnader.
En subpopulation av MSCs härstammar från den neurala krönet och är lättillgänglig från marvhålan. Dessa celler är neurala progenitorer som kan generera neuroner och glia 5 . Djurmodeller av cerebral ischemi visar att hypoxi främjar prol Iferation och multipotens av neurala progenitorer i hjärnan 6 . Detta var grunden för att utnyttja hypoxisk förkonditionering som ett sätt att expandera på margen-härledda neurala progenitorer.
Transplantationen av Schwann-celler i den skadade ryggmärgen främjar regenerering 2 . SCLC kan genereras från MSC genom tillskott med gliogena faktorer ( dvs P-Heregulin, bFGF och PDGF-AA) men uppvisar fenotypisk instabilitet. Vid återtagande av tillväxtfaktorer återgår de till en fibroblastliknande fenotyp 7 . Fenotypisk instabilitet är oönskade vid celltransplantation på grund av risken för avvikande differentiering och karcinogenes. Eftersom Schwann-cellprekursorer är associerade med axonbuntar i den embryonala perifera nerven 8 , ledde vi oss till odlings-SCLCs med renade embryonala DRG-neuroner 7 ,Röv = "xref"> 9. Resulterade mogna Schwann-celler är öde-engagerade och demonstrera funktion in vitro 7 , 9 och in vivo 10 .
Vårt protokoll för anrikning av neurala progenitorer från MSC är enkelt och effektivt och resulterar i en ökning av cellantalet för efterföljande analyser. Avledningen av öde-engagerade Schwann-celler via odlingsplattformen möjliggör studier av glialifferentiering och för generering av stabila och funktionella Schwann-celler för potentiell klinisk tillämpning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som involverar djur utfördes i strikt överensstämmelse med NIH Guide för vård och användning av laboratoriedjur och godkänd av kommittén för användning av levande djur för undervisning och forskning, Li Ka Shing medicinska fakultet, University of Hong Kong. Mänskliga benmärgsprover erhölls från iliac-kammen av friska givare efter att ha erhållit informerat samtycke. Protokoll godkändes av Institutional Review Board, University of Hong Kong.
1. Framställning av rått-MSC-kulturer
- Skörd av MSC från lårbenet
- Autoklavera alla dissektionsverktyg ( dvs finspridande sax, trubbiga skärsaxar och tandade tångar) vid 180 ° C i minst 2 timmar före användning.
- Förbered MSC-tillväxtmedium bestående av minimalt essentiellt medium-alfa modifiering (aMEM) kompletterat med 15% fetalt bovint serum (FBS) och penicillin / streptomycin (P / S, 1% v / v).
- Offra unga Sprague Dawley-råttor (200-250 g kroppsvikt) genom pentobarbitondosering (240 mg / kg kroppsvikt, intraperitoneal).
OBS: Marvprover från olika råttor ska behandlas separat. - Placera de avlivade djuren i viloläge. Rengör magen och underbenen noggrant med 70% etanol.
- Ta bort huden och subkutan vävnad över mediallåren med fina dissekeringsaxlar och tångar. Ta bort lårmusklerna periferi tills lårbenet är utsatt. Fortsätt detta proximalt och distalt tills knä och höft leder ses. Diskutera lårbenet genom höft och knäled med hjälp av trubbiga snittaxlar.
OBS! Överför inte lårbenet för att exponera marvhålan vid detta skede. Överför intakta femor till en laminär flödesvävnadskulturhuv för vidare bearbetning. - Använd trubbiga tippade saxar för att transekera de distala och proximala ändarna av lårbenet genom metafysen.
- Placera en 70 μm cell-filter över ett 50 ml koniskt rör. Sätt in en 21 G, 10 ml spruta innehållande fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 10 mM Na2HP04, pH 7,4) i den exponerade lårgångskanalen och spola smälthalten i det koniska röret genom upprepad spolning.
OBS: Ca 20 ml PBS används för att spola varje lårben. Om färgen på det spolade innehållet förblir blodfärgat och grumligt kan en större volym användas. - Samla cellerna genom centrifugering vid 480 xg i 5 min. Kassera supernatanten. Resuspendera cellpelleten i 10 ml MSC-tillväxtmedium. Placera cellerna på en 10 cm vävnadskulturskål. Placera vävnadskulturskålen i en cellinkubator (37 ° C, 5% CO2). Spela in den första dagen för plätering som dag 0.
OBS! I alla steg med centrifugering, sätt in bromsen för maximal retardation.
- Etablering och expansion av MSC-kolonier
OBS: Detta protokoll rElier på vävnadskulturplastylhäftning som ett medel för att välja för MSCs inuti marvhålan 11 . Benmärgshalten får bindas till vävnadsodlingsplastiken i 2 dagar.- På dag 2 sköljs odlingsplattorna tre gånger med 10 ml PBS för att avlägsna icke-vidhäftande celler. Byt PBS med 10 ml MSC-tillväxtmedium efter sköljning. Tvätta cellerna med PBS och fyll på med MSC-tillväxtmedium var tredje dag.
OBS: MSC kolonier ska vara synliga vid dag 6-7 ( Figur 2A ). - Passera cellerna efter dag 10 genom att avlägsna tillväxtmediet och skölja cellerna med PBS. Tillsätt 1,5 ml rekombinant enzymatisk celldissociationsreagens och inkubera vid 37 ° C under 5 min. Tillsätt 3 ml MSC-tillväxtmedium för att neutralisera reaktionen. Samla de lossade cellerna genom centrifugering vid 250 xg under 5 min.
- Kvantifiera cellerna i pelleten med hjälp av en hemocytometer efter en lämplig utspädning i PBS.
- Sädpassagerade celler vid en densitet av 40.000 celler / cm2 i en 10 cm odlingsplatta i MSC-tillväxtmedium.
OBS: Råtta MSC bör nå 80-90% konfluens inom 2 dagar efter passage ( Figur 2B ). Celler kan passeras enligt beskrivningen i steg 1.2.2 för upp till 8 passager. MSC kan karakteriseras med hjälp av immuncytokemi och deras kapacitet för trilineardifferentiering ( Figur 3 ) 12 . Endast MSC-kulturer mellan passagerna 3 och 8 är föremål för efterföljande hypoxisk förkonditionering och neural progenitorberikning. MSC med större passagerantal antar en planad morfologi ( Figur 2C ) och producerar inte tillräckligt många neurala progenitorer. Dessa kulturer bör kasseras.
- På dag 2 sköljs odlingsplattorna tre gånger med 10 ml PBS för att avlägsna icke-vidhäftande celler. Byt PBS med 10 ml MSC-tillväxtmedium efter sköljning. Tvätta cellerna med PBS och fyll på med MSC-tillväxtmedium var tredje dag.
2. Framställning av humana BMSC-kulturer
- Späd 1 ml humant benmärgsaspirat med 9 ml MSC-tillväxtmedium och plåterCeller på en 10 cm vävnadskulturskål. Bibehålla kulturerna i en cellinkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Ta av mediet efter 2 dagar och skölj kulturerna tre gånger försiktigt med 10 ml PBS för att avlägsna icke-vidhäftande celler. Efter slutsköljningen, ta bort PBS och ersätt det med 10 ml MSC-tillväxtmedium. Replandera tillväxtmediet efter varje 3 dagars odling efter PBS-sköljningen.
OBS: MSC-kolonier ska vara synliga vid dag 6-7. Antalet kolonier kan variera mellan ämnen. - Passera cellerna på dag 10, som beskrivs i steg 1.2.2. Kvantifiera cellerna i pelleten med hjälp av en hemocytometer efter en lämplig utspädning i PBS. Utsätt de passagerade cellerna med en densitet av 40 000 celler / cm 2 på en 10 cm odlingsplatta i MSC-tillväxtmedium.
OBS: Mänskliga MSCs ( Figur 2D ) visar en liknande morfologi till rått-MSCs och bör också nå 80-90% sammanflöde inom 2 dagar efter passage. De borde vara charaCterized med hjälp av immuncytokemi och deras kapacitet för trilinage differentiering 12 . Liksom hos rått-MSC: er, är humana MSC: er som är mellan passage 3 och 8 föremål för efterföljande hypoxisk förkonditionering och neural progenitorberikning.
3. Hypoxisk förkonditionering
- Demontera hypoxikammarkomponenterna ( dvs. bas, lock, brickor) efter att ha släppt ringen och torka de enskilda delarna rena med 70% etanol. Placera kammarkomponenterna i en laminär flödesvävnadskulturhuv för sterilisering under UV-ljus under 15 minuter.
- Före hypoxisk förkonditionering, avlägsna mediet och skölj råttan och humana MSC-kulturer (sektionerna 1 och 2) med 10 ml PBS. Ersätt PBS med 10 ml MSC-tillväxtmedium kompletterat med 25 mM HEPES.
OBSERVERA: De MSC som odlas på 10 cm rätter bör ha nått 80-90% konfluens innan de utsätts för hypoxisk förkonditionering. - Placera culRätter i hypoxikammaren. Montera kammarkomponenterna igen och dra åt klämman. Spola en gasblandning av 99% N2 / 1% O2 i kammaren vid en flödeshastighet av 10 1 / min under 5 min.
- Försegla hypoxikammarens anslutande ändar för att säkerställa att det inte finns någon gasläckage. Placera kammaren inuti cellinkubatorn (37 ° C, 5% CO2) i 16 timmar.
- Efter fullbordandet av den hypoxiska förkonditioneringen, avlägsna kulturerna från kammaren för framställning av den efterföljande neurala progenitorberikningskulturen.
4. Neural Progenitor Enrichment Culture
- Beredda neurala progenitormedium bestående av Dulbeccos modifierade örnmedium / Ham-näringsämnesblandning F12 (DMEM / F12) kompletterat med B27 (2% volym / volym), basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF, 20 ng / ml), epidermal tillväxtfaktor (EGF, 20 ng / ml) och P / S (1% volym / volym).
- Lossa de hypoxiska förkonditionerade råtta / humana MSC: erna, som beskrivs i steg 1.2.2.Samla de lossade cellerna genom centrifugering vid 250 xg under 5 min. Kvantifiera cellerna i pelleten med hjälp av en hemocytometer efter lämplig utspädning i PBS.
- Resuspendera cellerna i neuralt progenitormedium och frö på låghäftande plattor med 6 brunnar vid en densitet av 6000 celler / cm2. Placera kulturen i en cellinkubator (37 ° C, 5% CO2) under 12 dagar. Replenish 75% av det neurala progenitormediet var tredje dag.
OBS! Stora icke-vidhäftande cellkluster bör observeras vid dag 6-7. Vid dag 10-12 kan neurospherer med en diameter ≥ 100 μm observeras ( Figur 4 ). Hypoxa förkonditionerade MSC bör ge mer neurosfärer jämfört med MSC-odlingar som odlas under normoxiska förhållanden 9 . - Samla neurospheres på dag 12 genom att aspirera dem i en 10 ml pipett och överföra dem till ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera neurosfärerna vid 250 xg under 5 min.
OBS: Neurospheres kan varaKännetecknad av dag 12 för neurala progenitormarkörer, såsom nestin och GFAP 7 .
5. Generering av öde-engagerade Schwann-celler via odling med DRG-neuroner
- Framställning av renade rått-DRG-neuroner
- Autoklavera alla dissektionsverktyg ( dvs dissektsaxar , tångar, två mikrodissektionstänger och mikrodissektionsaxor) vid 180 ° C i minst 2 timmar före användning.
- Coat 6-brunns vävnadskulturplattor med poly-D-lysin (PDL, 10 | ig / ml i PBS) vid 4 ° C över natten. Ta bort PDL och skölj med 1,5 ml PBS per brunn.
- Fortsätt med beläggning av plattorna med laminin (10 μg / ml i PBS) vid 37 ° C i 2 timmar. Skölj plåtarna med 1,5 ml PBS per brunn.
- Förbered DRG neuron underhållsmedium, bestående av neurobasalt medium kompletterat med B27 (2% volym / volym), L-glutamin (1% volym / volym), nervtillväxtfaktor (NGF, 20 ng / ml) och P / S % V / v).
- Förbered DRG-neuronreningsmedium, bestående av neurobasalt medium kompletterat med B27 (2% volym / volym), L-glutamin (1%), NGF (20 ng / ml), P / S (1%), fluorodeoxiuridin (FDU, 10 Μg / ml) och uridin (10 | ig / ml).
- Offra gravida råttor vid gestationsdagen 14-15 genom pentobarbitalöverdosering (240 mg / kg kroppsvikt, intraperitoneal).
- Placera de avlivade djuren i viloläge. Rengör magen noggrant med 70% etanol.
- Klipp djurets nedre bukvägg i längdriktningen med fina dissekeringsaxlar och tångar. Identifiera och ta bort livmodern med hjälp av dissektionssax. Klipp ut livmoderväggen för att exponera och extrahera embryonerna. Överför embryonerna till en steril, 10 cm odlingsskål fylld med PBS. Placera kulturrätten på is.
- Överför embryot avsedd för dissektion till en steril, 10 cm odlingsskål fylld med PBS (rumstemperatur) och placera den under ett dissektionsmikroskop. Får embryot i benäget läge.
INTEE: Den vitliga ryggmärgen och de bifogade DRG kan ses över embryonets dorsala aspekt genom sin genomskinliga hud. - Sätt i microdissecting tångar längs vardera sidan av ryggmärgen och använd trubbig dissektion för att börja separera ryggmärgen från den omgivande mjukvävnaden. Skär ryggmärgen fri från djuret med hjälp av microdissecting tångar längs nacköppningen och svansstubben. Utför ytterligare trubbig dissektion över den ventrala sidan av ledningen för att frigöra den från omgivande mjukvävnad.
- Använd microdissecting tångar för att ta bort resterande mjukvävnad över den ryggformiga ryggmärgen.
OBS! Vid detta skede bör endast ryggmärgen, nervroten och den bifogade DRG förbli. - Lossa enskilda DRG från deras anslutande nervrotsar med hjälp av microdissecting tang. Använd en pipettpenna fäst vid en 1 ml spets för att överföra DRG till ett 1,5 ml sterilt centrifugrör innehållande PBS.
OBS: För varje 1,5 ml rör, högst100 DRG kan rymma. - Centrifugera DRG: erna vid 250 xg under 5 min och resuspendera dem i rekombinant enzymatisk celldissocieringsreagens (200 | il per rör). Inkubera (37 ° C, 5% CO2) i 10 min. Centrifugera DRG: erna vid 250 xg under 5 min, avlägsna supernatanten och resuspendera i DRG neuron underhållsmedel. Dissociera pelleten genom försiktig triturering med hjälp av en 200 μl pipettspets. Kvantifiera cellerna i pelleten med hjälp av en hemocytometer efter en lämplig utspädning.
- Frö cellerna vid en densitet av 5000 celler / cm2 i PDL / lamininbelagda plattor med 6 brunnar i 1,5 ml DRG neuron underhållsmedel per brunn. Efter två dagars odling avlägsnar DRG-neuronunderhållsmediet, skölj med PBS och ersätt med DRG-neuronreningsmedium.
OBS: För varje reningscykel behandla DRG-kulturerna med reningsmedium i 2 dagar följt av 1 inkuberingsdag i underhållsmedium. Efter 3-4 rening cykler, remOval av all endogen glia förväntas 7 . Detta bör ta cirka 14 dagar. Renade kulturer testar positivt för neuronmarkören TUJ1 och är frånvarande för S100p-uttryck ( Figur 5 ).
- Generering av Schwanncellliknande celler
- Preparera glial induktionsmedium bestående av aMEM kompletterat med P-Heregulin (100 ng / ml), bFGF (10 ng / ml), blodplätt-härledd tillväxtfaktor (PDGF-AA, 5 ng / ml), FBS (10%) och P / S (1% volym / volym).
- Placera neurosfärerna framställda i avsnitt 4 i PDL / lamininbelagda plattor med 6 brunnar vid en densitet av 5-10 sfärer per cm2 i 1,5 ml glial induktionsmedium per brunn. Byt glial induktionsmedium varannan dag efter sköljning av cellerna med PBS.
OBS: Celler från utsäde neurospherer ses att migrera utåt vid dag 2. Vid dag 7 har migrationsceller ett avsmalnande utseende och bör demonstrera immunopositivitet för Schwann-cellenMarkörer p75 neurotrofinreceptor (p75) och S100P7. Dessa celler kallas SCLC.
- Coculture av SCLCs med DRG-neuroner
- Förbereda odlingsmedium bestående av DRG-neuronunderhållsmedium (steg 5.1.4) och glialinduktionsmedium (steg 5.2.1) vid ett volymförhållande volymförhållande 1: 1.
- Förbereda Schwann-cellunderhållsmedium bestående av DMEM / F12 kompletterat med FBS (5%), P-Heregulin (10 ng / ml) och P / S (1% volym / volym).
- Ta bort odlingsmediet från dag 7 SCLC, skölj dem med PBS och inkubera dem med 0,5 ml / brunn av rekombinant enzymatisk celldissociationsreagens vid 37 ° C under 5 min. Resuspendera SCLC: erna i odlingsmedium.
- Kvantifiera cellerna med hjälp av en hemocytometer efter lämplig utspädning.
- Se SCLC: erna på renade DRG-neuronkulturer vid en densitet av 1000 celler / cm2. Underhålla kulturerna i 14 dagar, med medium ersättning varannan dag.
OBS: Under odling förvärvade SCLCs den spindelliknande morfologin som är typisk för mogna Schwann-celler ( Figur 6 ). Dessa celler kvarstår i sin fenotyp efter uttag av tillväxtfaktorer och kan myelinera axoner in vitro och in vivo 7 , 10 . Positiviteten hos Schwann-cellmarkörer ( dvs p75 och S100β) bör övervakas genom immunofluorescens. - Vid fullbordandet av odling är passagerarfasade Schwann-celler, såsom beskrivs i steg 1.2.2. Använd 0,5 ml dissociationsreagens per brunn. Kvantifiera cellerna med hjälp av en hemocytometer efter lämplig utspädning.
- Resuspendera öde-engagerade Schwann-celler i Schwann-cellunderhållsmedium vid en densitet av 10 000 celler / cm 2 . Fröceller i PDL / lamininbelagda plattor med 6 brunnar för immunofluorescens.
OBS: Kokulturer innehåller oundvikligen MSC som har antagit en fibroblastCell öde 7 . Dessa celler passeras tillsammans med öde-engagerade Schwann-celler vid fullbordandet av kulturen. Schwannceller som ligger ovanpå detta fibroblast-substrat kan lätt lösas och expanderas vidare efter sköljning med "kallstrålar" av PBS (4 ° C), såsom har beskrivits någon annanstans 13 . Öde-engagerade Schwann-celler kan expanderas i underhållsmedium i 1 månad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En översikt över nyckelstadierna i vårt protokoll illustreras i Figur 1 . Sammanfattningsvis väljs råtta och humana MSC för att vara vidhäftning till vävnadskulturplast. Utvidgade MSC är förkonditionerade med hypoxi och utsätts sedan för neurosfärbildande tillstånd. Neurospheres pläteras och får differentiera i SCLC. SCLCs odlas med renade DRG-neuroner för att generera öde-engagerade Schwann-celler.
Morfologin för odlad råtta och humana MSCs illustreras i figur 2 . Deras hälsosamma avsmalnande morfologi visas i kontrast till det fyrkantiga utseendet hos MSC som upprätthålls för höga passagerantal, som har förlorat deras multipotens. Utökade råtta och humana kolonier bör visa uttryck för MSC-markörer, en frånvaro av hematopoetiska stamcellsmarkörer och kapaciteten för trilineage difFerentiation ( Figur 3 ). Friska MSCs från mellan passagerna 3 och 8 utsätts för hypoxisk förkonditionering i 16 timmar och passeras därefter till odlingsplattor med låg adherens med EGF / bFGF-tillskott. Hypoxisk förkonditionering resulterar i större antal neurosfärer, såväl som större genomsnittliga neurosfärstorlekar ( Figur 4 ).
Neurospheres pläteras på PDL / lamininbelagda odlingsplattor och induceras att bli SCLC genom odling i glial induktionsmedium innehållande P-Heregulin, bFGF och PDGF-AA. SCLCs uppvisar den karakteristiska avsmalnande morfologin hos Schwann-celler och motsvarande marköruttryck, men de är fenotypiskt instabila och återgår till en fibroblastfenotyp vid avbrytandet av tillväxtfaktorer
Kokultur med sensoriska neuroner är en förutsättning för att åstadkomma en cellintrinsisk swKliar till ödet engagemang. Inrättandet av renade DRG-nätverk uppnås genom pulserad behandling med FDU och uridin för att avlägsna endogen glia och bör bekräftas genom avsaknad av S100p-immunopositivitet ( Figur 5 ). På dag 7 passeras SCLCs och odlas med renade DRG-neuroner i 14 dagar ( Figur 6 ). Vid slutförandet av kulturen bör mogna, ödespecifika Schwannceller uppstå.
Figur 1: Översikt över protokollet. Benmärgen erhålls från antingen råtta femur eller humant iliac crest aspirat. MSCs från benmärgen kan fästa och expandera på vävnadskulturplastik. För att berika för MSCs med neurala potentialen förkonditioneras cellerna i 1% 02 i 16 timmar och passeras därefter på låg adhesionskultur plAtes med bFGF / EGF-tillskott. Detta resulterar i bildandet av neurosfärer, vilka är pläterade på PDL / lamininbelagd vävnadskulturplast och odlad i glial induktionsmedium för att alstra SCLC. SCLCs passageras och odlas med renade DRG-neuroner i 2 veckor för att rikta dem till mognad. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Upprättande av MSC-kolonier. Stora MSC-kolonier bör vara synliga 6-7 dagar efter plätering av benmärgsceller på vävnadskulturplast. En representativ bild av en rått-MSC-koloni visas ( A ), medan humana kolonier uppvisar ett liknande utseende. Kolonier kan passeras på dag 10. Sett vid högre förstoring, både råtta (B ) och humana ( D ) MSC: er uppvisar en karakteristisk fibroblastliknande morfologi efter passage. MSC som upprätthålls för höga passagerantal förvärvar en planad, kvadraterad morfologi ( C ) och bör kasseras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Karakterisering av MSCs. ( A - D ) Representativa bilder av mänskliga MSCs. MSC kan karakteriseras genom uttryck av lämpliga markörer, såsom CD90 ( A ), CD73 ( B ) och Stro-1 ( C ), och genom frånvaro av hematopoietiska stamcellmarkörer, såsom CD45 ( D ). ( E - G ) Råtta MSCs isolerade och expanderade som beskrivna i protokollet demonstrerar multipotens i deras förmåga att bilda adipocyter ( E ; fettavlagringar färgade med Sudan Red), osteoblaster ( F ; pericellulär matris färgad med Alizarin Red) och kondrocyter ( G ; proteoglykaner färgade med Safranin- O) under lämpliga odlingsbetingelser. Skalstänger = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Berikning av neurala progenitorer från MSC. Både råtta ( A ) och humana ( C ) MSCs bildar neurosfärer när de odlas på vävnadskulturplast med låg adhesion i medium kompletterat med EGF / bFGF. Antalet och medeldiametern hos råtta (
Figur 5: Etablering av renade råtta DRG-nätverk. Renade DRG-nätverk etableras efter pulserad behandling med de antimitotiska medlen FDU och uridin (A). Neuritnät som saknar S100p-uttryckande endogen glia (B) är klara för odling med SCLC. Skalstänger = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Generering av benmärgsavledda Schwann-celler via odling med DRG-neuroner. Efter avslutad 2 veckors odling med renade DRG-neuroner och humana SCLC, kommer spindelformade, öde-engagerade Schwann-celler från både normoxi- och hypoxibehandlade grupper ( A och D ). Dessa celler uttrycker Schwann-cellmarkörerna p75 (B och E) och S100p (C och F). Expressionen av humant kärnantigen (HuNeu) visar att de S100p-positiva cellerna inte kontaminerar glialceller som härrör från rått-DRG. Skalstänger = 100 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är viktigt att bevara MSC: ernas stamhet innan anrikning av neurala progenitorer genom hypoxisk förkonditionering och neurosfärkultur. Från vår erfarenhet kan multipotenta MSC på ett tillförlitligt sätt identifieras genom sin långsträckta fibroblastliknande morfologi. I motsats till detta, MSCs som har antagit en mer planerad, fyrkantig morfologi, med framträdande cytoskeletala stressfibrer, adopterar inte lätt neurala cellfetter och bör kasseras. I allmänhet använder vi inte MSCs med passagerantal som är större än åtta. För att behålla sin stilhet är det viktigt att MSC: erna ska gå fort innan de når 100% sammanflöde. Omvänt är upprätthållande av MSC vid en för låg sammanflöde oönskade. Från vår erfarenhet möjliggör sådd MSC med en densitet på 40 000 celler / cm 2 eller helt enkelt passerar celler som är 80% sammanfogade i ett 1: 2-förhållande, vilket ger de bästa resultaten.
Korrekt etablering och underhåll av DRG-nätverket är kritikerAl determinant av coculture framgång. Den tid som krävs för DRG-skörd bör hållas till ett minimum. Individuella ganglier ska hanteras på ett atraumatiskt sätt, särskilt vid lossning från ryggmärgen, när det är bäst att bara hantera nervrotsarna. I allmänhet strävar vi efter en period på mindre än 2 timmar mellan tiden för djuroffret och den enzymatiska matsmältningen av skördade DRG, som en förlängd skörd resulterar i vävnadsmaceration och förlusten av cellens livskraft. Avlägsnandet av DRG-neuroner från substratet under odling uppträder ofta. För att förhindra att detta inträffar bör beläggningen förberedas nyligen och utföras nära vävnadsskörden. I allmänhet avlägsnar stora, odelade DRG-klyftor oftare och ger inte odlingens framgång. Varaktigheten av enzymatisk uppslutning och mängden triturering kan justeras, i syfte att uppnå ett nätverk med ett utseende som liknar Figur 5 .
Medan vår cocuDen plattformen som konsekvent framkallar ödet engagemang, bara 20-30% av de kulturer som utförs i parallell utbyte öde-engagerade Schwann celler 7 , 13 . Vi förbereder därför tillräckligt med DRG och SCLC för att samtidigt utföra kulturer i tre till fyra 6-brunns odlingsplattor. Vi förutser att en kombination av faktorer som är relaterade till det underliggande DRG-nätverket, inklusive deras embryonalder, cellleabilitet, densitet och topografi, påverkar odlingssuccesen. Dessa underliggande variabler behöver undersökas och standardiseras ytterligare. Bortsett från begränsningar i odlingsutbytet bör man söka ett sätt att ersätta kraven på rått-härledda DRG-neuroner och animaliska produkter. Vidare bör protokollets varaktighet förkortas. Som en förkortad modifiering av vårt protokoll har vi haft framgång med att härleda mogna Schwann-celler från dag 10 neurospherer sådda direkt på renade DRG-neuroner, utan föregående generation av SCLC , 10 .
Neurospherer berikade via vår metod tjänar som en robust källa till celler av neuronala och gliala linjer. Vår plattform för att styra precursorceller till ödeplikten har fördelen att man undviker genetisk manipulation med sina inneboende risker och de resulterande cellerna är av betydelse för celltransplantation, sjukdomsmodellering och studier av glialifferentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare till detta manuskript har inga upplysningar att deklarera.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja erkänna Dr Nai-Sum Wong för att tillhandahålla hypoxiakammareapparaten och fru Alice Lui för det tekniska stödet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
References
- Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation? J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
- Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
- Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
- Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
- Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
- Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
- Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
- Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).
