Summary
Intracellular कैल्शियम रीसाइक्लिंग cardiomyocytes में सिस्टोलिक और डायस्टोलिक समारोह के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यहाँ, हम एक कैल्शियम इमेजिंग प्रणाली द्वारा cardiomyocytes में sarcoplasmic जालिका Ca2 + रिजर्व और डायस्टोलिक कैल्शियम हटाने समारोह का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
Intracellular कैल्शियम रीसाइक्लिंग cardiomyocytes में सिस्टोलिक और डायस्टोलिक समारोह के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । कार्डियक sarcoplasmic जालिका (SR) संकुचन के लिए एक सीए2 + जलाशय के रूप में कार्य करता है, जो छूट के दौरान intracellular ca2 + reuptakes । SR ca2 + धड़कता के लिए उपलब्ध आरक्षित कार्डियक contractibility के लिए समाप्त है, और intracellular Ca के हटाने2 + कार्डियक डायस्टोलिक समारोह के लिए महत्वपूर्ण है । कुछ pathophysiological शर्तों के तहत, जैसे मधुमेह और दिल की विफलता, बिगड़ा कैल्शियम क्लीयरेंस और एसआर सीए2 + स्टोर cardiomyocytes में हृदय रोग की प्रगति में शामिल हो सकता है । यहां, हम SRCa2 + आरक्षित और डायस्टोलिक Ca2 + हटाने का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । संक्षेप में, एक एकल cardiomyocyte enzymatically पृथक किया गया था, और intracellular Ca2 + प्रतिदीप्ति द्वारा इंगित फ्रा-2 एक कैल्शियम इमेजिंग प्रणाली द्वारा दर्ज किया गया था । कुल SR सीए2 + रिलीज उत्प्रेरण के लिए कैफीन को रोजगार, हम उत्तेजना प्रणाली और छिड़काव प्रणाली को जोड़ने के द्वारा एक स्वत: छिड़काव स्विच कार्यक्रम पूर्व निर्धारित । फिर, मोनो घातीय वक्र फिटिंग कैल्शियम यात्रियों और कैफीन प्रेरित कैल्शियम दालों के क्षय समय स्थिरांक का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । तदनुसार, SR ca के योगदान2 +-ATPase (सेरका) और Na+-ca2 + एक्सचेंजर (NCX) डायस्टोलिक कैल्शियम हटाने के लिए मूल्यांकन किया गया था ।
Introduction
Intracellular कैल्शियम ([सीए2 +]i) रीसाइक्लिंग cardiomyocytes1में सिस्टोलिक और डायस्टोलिक समारोह के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । जैसा कि हम जानते हैं, कैल्शियम प्रेरित Ca2 + रिहाई उत्तेजना संकुचन युग्मन, जो संकुचन के लिए बिजली के संकेत अनुवाद शुरू । झिल्ली ध्रुवीकरण sarcolemmal एल प्रकार सीए2 + चैनल, जो ryanodine रिसेप्टर्स 2 (RyR2) के माध्यम से कोशिका में एसआर से सीए2 + रिलीज प्रेरित सक्रिय करता है. क्षणिक ऊंचा cytoplasmic Ca2 + myofibrils के संकुचन शुरू होता है । diastole के दौरान, cytoplasmic ca2 + sr ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) के माध्यम से sr में reuptaken है और ना+-Ca2 + एक्सचेंजर (cardiomyocyte)2के माध्यम से NCX के बाहर पंप । इस प्रक्रिया में संकुचन की ओर जाता है-cardiomyocyte में छूट रीसाइक्लिंग ।
कार्डिएक एसआर सिकुड़ा मशीनरी के चारों ओर एक intracellular झिल्ली नेटवर्क है । यह संकुचन के लिए एक सीए2 + जलाशय के रूप में कार्य करता है, और यह विश्राम के दौरान intracellular ca2 + reअवशोषित । धड़कता के लिए उपलब्ध SR Ca2 + आरक्षित कार्डियक सिकुड़ना के लिए समाप्त हो गया है । इस बीच, intracellular Ca के हटाने2 + कार्डियक diastole के लिए महत्वपूर्ण है । मधुमेह और दिल की विफलता के रूप में कुछ pathophysiological स्थितियों, के तहत, बिगड़ा सीए2 + क्लीयरेंस और उदास SR ca2 + cardiomyocytes में स्टोर हृदय रोग की प्रक्रिया में शामिल किया जा सकता है2,3 ,4.
SR ca2 + रिलीज और डायस्टोलिक ca2 + हटाने cardiomyocytes में मापने के लिए, वहां दो व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण हैं: पैच के आधार पर NCX वर्तमान की अखंडता-क्लैंप5,6, और कैफीन प्रेरित सीए 2 + पल्स सीए2 + प्रतिदीप्ति इमेजिंग7,8,9पर आधारित है । पूर्व दृष्टिकोण तथ्य यह है कि Ca2 + SR से जारी काफी हद तक NCX द्वारा सेल के बाहर पंप है पर निर्भर करता है । हालांकि, इस दृष्टिकोण उंनत उपकरण और निपुण आपरेशन की अपनी आवश्यकता के द्वारा सीमित है । वर्तमान अध्ययन में, हम एक सुविधाजनक दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए SR ca2 + रिजर्व और ca2 + हटाने myocytes में एक कैफीन प्रेरित ca2 + पल्स एक ca2 + प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली पर आधारित को मापने के द्वारा मूल्यांकन । संक्षेप में, intracellular Ca2 + प्रतिदीप्ति फ्रा-2 द्वारा संकेत दिया है । उत्तेजना प्रणाली और छिड़काव प्रणाली को जोड़ने के द्वारा, हम स्वचालित रूप से छिड़काव और पेसिंग प्रणाली स्विचन के लिए एक कार्यक्रम प्रस्तुत करते हैं । 10 मिमी कैफीन तेजी से प्रेरित कुल सीए2 + सीनियर में जारी करने के लिए कार्यरत था कैल्शियम यात्रियों और कैफीन-प्रेरित कैल्शियम दालों की घातीय क्षय समय स्थिरांक (ताऊ) मोनो-घातीय वक्र फिटिंग, जो डायस्टोलिक Ca के लिए सेरका और NCX के योगदान को प्रतिबिंबित से प्राप्त किए गए2 + हटाने तदनुसार ।
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Protocol
- तालिका 1 में वर्णित के रूप में सभी समाधान तैयार करें ।
- ने Langendroff छिड़काव प्रणाली की स्थापना की । सामान्य Tyrode (NT) समाधान के साथ छिड़काव सिस्टम भरें, ३६.५ & #176; C पर तापमान सेट करें, और ट्यूब में किसी भी हवा के बुलबुले को खत्म.
- बकरों और anesthetize के intraperitoneal इंजेक्शन (ip) के द्वारा एक Sprague-Dawley चूहे को chloral हाइड्रेट (४०० मिलीग्राम/ 5 min. के बाद पूंछ या पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करके संवेदनाहारी स्थिति की पुष्टि करें
- एक शल्य कैंची के साथ असिरूप प्रक्रिया के तहत उदर गुहा खुला, असिरूप प्रक्रिया को लिफ्ट, और कैंची के साथ छाती खुला । पेरीकार्डियम निकालें, थोड़ा घुमावदार संदंश के साथ दिल उठा, महाधमनी चाप की पहचान, और बंद महाधमनी की जड़ से कैंची से दिल काट दिया ।
- एक ६०-mm डिश के लिए दिल हस्तांतरण और यह NT समाधान के साथ धो लो । दो सूक्ष्म विदारक संदंश के साथ महाधमनी पकड़ो, और यह Langendorff छिड़काव प्रवेशनी पर माउंट, और फिर दृढ़ता ligate महाधमनी पर प्रवेशनी शल्य टांके का उपयोग कर ।
नोट: एक कुशल ऑपरेटर 15 एस के भीतर इस प्रक्रिया को समाप्त कर सकते है - Perfuse दिल 30 मिलीलीटर NT समाधान के साथ कोरोनरी धमनियों के संचलन को ठीक करने के लिए । फिर, perfusate के लिए स्विच 30 मिलीलीटर Ca 2 + -मुक्त Tyrode समाधान (10 मिमी Taurine, 1 मिलीग्राम/एमएल BSA) दिल की धड़कन को रोकने के लिए । अगला, perfusate एक आइसोलेशन समाधान Collagenase करने के लिए स्विच (०.६ मिलीग्राम/एमएल) एंजाइम पाचन के लिए.
ध्यान दें: मधुमेह चूहों के बिना प्रयोगों के लिए Collagenase का उपयोग करें, या Collagenase द्वितीय मधुमेह चूहों के साथ प्रयोगों के लिए. - 20-25 मिनट के लिए पाचन के बाद, जल्दी से छिड़काव समाधान को बदलने के लिए Ca 2 + -मुक्त Tyrode समाधान आगे पाचन को रोकने के लिए । फिर, संदंश के साथ दिल पकड़, यह प्रवेशनी से काट, और एक ३५ मिमी KB समाधान युक्त पकवान में दिल जगह ( तालिका 1 देखें).
- टुकड़े ने LV वाल को कैंची और संदंश से भरा । atrium, राइट निलय और अलिंदनिलय जंक्शन क्षेत्र में कटौती । शेष ऊतक LV; यह KB समाधान के साथ एक नया ३५-mm डिश में स्थानांतरण । LV टिशू को छोटे टुकड़ों में कीमा कर लें ।
- धीरे एक फ़िल्टर्ड प्लास्टिक ड्रॉपर के साथ टुकड़े पिपेट, और 10 मिलीलीटर KB समाधान में पुन: निलंबित.
- के साथ कोशिकाओं को फ़िल्टर १५० & #181; m एपर्चर स्टेनलेस स्टील फ़िल्टर, और एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । 30 एस के लिए १५० x g पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । myocytes 10 मिलीलीटर kb समाधान में पुन: निलंबित, मुक्त 6 मिनट के लिए व्यवस्थित, supernatant त्यागें, और 10 मिलीलीटर kb समाधान में गोली फिर से निलंबित.
नोट: सभी कदम ३६ पर प्रदर्शन किया गया & #176; C in solution डाला with १००% हे 2 .
- KB समाधान में 20 मिनट के लिए बसने के बाद, supernatant त्यागें, और फिर से myocytes कैल्शियम पुनः आरंभ समाधान एक (०.३ mM ca 2 + , ४.५ एमएल ca 2 + -मुक्त Tyrode समाधान, १.५ एमएल NT समाधान) 10 min. के लिए
- से ऊपर की प्रक्रिया को दोहराने कैल्शियम पुनः आरंभ समाधान B (०.३ mM ca 2 + , 3 एमएल ca 2 + -मुक्त Tyrode समाधान, 3 मिलीलीटर NT समाधान) ।
- NT समाधान (१.२ mM Ca 2 + ) के साथ ऊपर की प्रक्रिया को दोहराने के लिए उपलब्ध myocytes शुद्ध । इस समाधान में पृथक LV myocytes का संग्रह करें और 4-6 h. के भीतर उनका अध्ययन करे
- चैंबर छिड़काव के लिए NT समाधान के साथ बहिर्वाह ट्यूब कनेक्ट (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ).
- लक्ष्य myocyte की सुई छिड़काव के लिए, बहु बैरल कई गुना टिप ( जैसे , छिड़काव पेंसिल, से, पेंसिल के रूप में जाना जाता है), micromanipulator में तय वाल्व नियंत्रित छिड़काव प्रणाली के लिए । NT समाधान जोड़ें और 10 मिमी कैफीन पेंसिल के प्रत्येक स्तंभ के लिए समाधान (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 1a ).
- हवा रुकावट से बचने के लिए ट्यूबों में किसी भी हवाई बुलबुले खाली ।
- 10 एस के लिए पेंसिल की माइक्रोन टिप से ड्रिप संख्या गिनती, और मैंयुअल रूप से प्रवाह नियामक को समायोजित करने के लिए 3 ड्रिप के एक अनुमानित वेग पर प्रवाह गति रखने/
- पिपेट 10 & #181; L सेल निलंबन स्लाइड पर, माइक्रोस्कोप के तहत एक सेल काउंटर द्वारा सेल संख्या गिनती, और घनत्व की गणना । ५०,००० सेल/एमएल. की अनुमानित एकाग्रता के लिए myocytes पतला
- फ्रा-2 acetoxymethyl (AM) शेयर (एक कैल्शियम सेंसिटिव डाई) में myocytes के 1 मिलीलीटर निलंबन में जोड़ने के लिए अंतिम एकाग्रता लाने के लिए 2 & #181; M. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए अंधेरे में रखें ।
- 30 एस के लिए १५० जी पर केंद्रापसारक, और NT समाधान के साथ cardiomyocytes पुनः निलंबित 2 बार ।
- लाइट बंद कर दें और कोशिकाओं को अंधेरे में रखें । 15 मिनट के लिए छिड़काव चैंबर में myocytes प्लेस । उसके बाद चैंबर छिड़काव (१.५ एमएल/मिनट) NT समाधान के साथ प्रारंभ करें । गति के साथ myocytes 1 हर्ट्ज क्षेत्र उत्तेजना का उपयोग कर एक उत्तेजक (लहर अवधि ४.० ms, पल्स आयाम ८.० वी) के लिए 5 min.
- अच्छा आकार के साथ एक myocyte का चयन करें (रॉड आकार, तेज धार, और स्पष्ट पार striations) और स्थिर उत्तेजित चिकोटी (कोई सहज संकुचन) 10x सूक्ष्म उद्देश्य लेंस के तहत. अगले, 40x करने के लिए सूक्ष्म इज़ाफ़ा बदलने के लिए, और एक क्षैतिज स्थिति में myocyte रखने के लिए सीसीडी कैमरा उन्मुखीकरण घुमाएँ.
- फ़्रेम एकल myocyte कक्ष फ़्रेमिंग एडाप्टर समायोजित कर रहा है । सुनिश्चित करें कि पृष्ठभूमि स्पष्ट है ।
- एक क्सीनन दीपक द्वारा उत्सर्जित प्रकाश को myocytes बेनकाब, ३४० या ३८० एनएम तरंग दैर्ध्य उत्तेजना फिल्टर के साथ, और एक 40x उद्देश्य के माध्यम से myocytes छवि । ५१० एनएम पर प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाएं । इस बीच, myocytes और रिकॉर्ड के sarcomere लंबाई परिवर्तन के साथ नरम धार मॉड्यूल का उपयोग कर ध्यान दें । एक दोहरे उत्तेजना प्रतिदीप्ति photomultiplier प्रणाली द्वारा
- रर प्रतिदीप्ति । कैल्शियम इमेजिंग सिस्टम के लिए रिकॉर्डिंग प्रोग्राम चलाएँ, क्लिक करें & #34; फ़ाइल/नई फ़ाइल & #34; कोई नई रिकॉर्डिंग फ़ाइल बनाने के लिए, और प्रतिदीप्ति और sarcomere लंबाई को सिंक्रोनस रिकॉर्ड करने के लिए & #34; start & #34; बटन पर क्लिक करें.
- इंटरलिंक द & #34; Aux Out & #34; पोर्ट इन के साथ उत्तेजित करता & #34; अनुरूप & #34 में; वाल्व नियंत्रण प्रणाली पर बंदरगाह ( उदा , वाल्व कमांडर, तालिका सामग्री देखें) एक BNC केबल द्वारा (TTL संकेत सिंक्रनाइज़ करने के लिए).
- पूर्व निर्धारित छिड़काव वाल्वों स्वचालित रूप से स्विचन के लिए एक कार्यक्रम के रूप में पहले से वर्णित < सुप वर्ग = "xref" > ८ , < सुप वर्ग = "xref" > ९ ; कार्रवाई के लिए विस्तृत चरण निंन के रूप में सूचीबद्ध हैं ।
- वाल्व नियंत्रण सॉफ्टवेयर में पैरामीटर तालिका 2 के अनुसार प्रीसेट, और क्लिक करें & #34;D ownload & #34; बटन प्रोग्राम में लोड अनुक्रम को डाउनलोड करने के लिए । क्लिक करें & #34; Trigger & #34; बटन ट्रिगर समारोह को सक्षम करने के लिए ।
नोट: वाल्व नियंत्रण प्रणाली TTL संकेत प्राप्त करने के बाद अनुक्रम निष्पादित कर सकते हैं । - अनुक्रम मोड के लिए पूर्व निर्धारित उत्तेजित करता है, और तालिका के अनुसार पैरामीटर सेट 3 .
- वाल्व नियंत्रण सॉफ्टवेयर में पैरामीटर तालिका 2 के अनुसार प्रीसेट, और क्लिक करें & #34;D ownload & #34; बटन प्रोग्राम में लोड अनुक्रम को डाउनलोड करने के लिए । क्लिक करें & #34; Trigger & #34; बटन ट्रिगर समारोह को सक्षम करने के लिए ।
- सेट पर उत्तेजितकर्ता को & #34; एस 1 स्टेप & #34; को १ हर्ट्ज पर LV myocytes को गति देना. NT समाधान के साथ १.५ मिलीलीटर/मिनट की गति से सुई छिड़काव शुरू करें ।
नोट: क्योंकि सुई धारा की गति चैंबर छिड़काव की तुलना में तेजी है, सुई धारा के प्रकाश अपवर्तन कक्ष छिड़काव के प्रकाश अपवर्तन से अलग है. प्रकाश अपवर्तन का अंतर इंगित करता है कि प्रभावी सुई छिड़काव की सीमा है, जो लक्ष्य myocyte. के चारों ओर
- कम शक्ति माइक्रोस्कोपी दृश्य के तहत एक लक्ष्य myocyte का चयन करें (बहाव के क्रम में नदी के ऊपर), और सुनिश्चित करें कि यह पेंसिल की सूक्ष्म टिप के द्वारा पहुंचा जा सकता है । 400x करने के लिए माइक्रोस्कोप आवर्धन बदलें । myocyte को क्षैतिज स्थिति में रखने के लिए सीसीडी कैमरा ओरिएंटेशन को घुमाएं । myocytes के साथ भरता है कि एक उपयुक्त खिड़की के लिए सेल फ्रेमन एडेप्टर के तहत आयताकार एपर्चर समायोजित करें । सुनिश्चित करें कि वहाँ न्यूनतम पृष्ठभूमि है; इस विंडो में अन्य myocytes या डेड सेल के मलबे की अनुमति न दें ।
- micromanipulator पर तय की पेंसिल की स्थिति को समायोजित, और ध्यान से दृष्टि क्षेत्र के दायरे की दूरी पर माइक्रो टिप 400x माइक्रोस्कोप आवर्धन के तहत लक्ष्य myocyte को जगह ।
- ज्यादातर लक्ष्य myocyte को कवर और सुनिश्चित करें कि myocyte सुई प्रवाह से बह नहीं किया जा सकता है करने के लिए सुई स्ट्रीम रेंज समायोजित करें ।
- ६० s basic पेसिंग के बाद, रोल उत्तेजित करने वाला कर्सर & #34;D 2 step & #34;.
नोट: प्रोटोकॉल के बाकी उत्तेजित करता है और वाल्व नियंत्रण प्रणाली द्वारा स्वचालित रूप से क्रियान्वित किया जाएगा । उपरोक्त सेटिंग के आधार पर, प्रोटोकॉल स्वचालित रूप से निष्पादित किया जा सका < मज़बूत वर्ग = "xfig" > चित्र 2a , 1 हर्ट्ज मूल पेसिंग के लिए NT समाधान के साथ ६० s. फिर पेसिंग और 2 एस के लिए देरी थामने, तेजी से 10 मिमी कैफीन छिड़काव के लिए 15 एस के लिए स्विच (कार्यात्मक Ca 2 + संग्रह SR में जारी करने के लिए), और फिर वापस NT समाधान के लिए स्विच करें । - रिकॉर्डिंग के अंत में, व्यक्तिगत myocytes के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का पता लगाने । क्लिक करें & #34;p ause & #34; बटन फ़ाइल रिकॉर्डिंग को रोकने के लिए, एक पास के रिक्त क्षेत्र में सूक्ष्म दृश्य ले जाएँ. क्लिक करें & #34; रर & #34; बटन सेकंड के लिए रिकॉर्डिंग फिर से शुरू करने के लिए, और रिकॉर्ड संख्यात्मक ३४० और ३८० एनएम तीव्रता मान पृष्ठभूमि सुधार के लिए.
- Open the & #34; ऑपरेशन/स्थिरांक & #34; संवाद बॉक्स और मानों को & #34 में भरें; पृष्ठभूमि & #34; प्रपत्र, क्रमशः; सॉफ़्टवेयर फ्रा 2 अनुपात मानों को पृष्ठभूमि से घटाकर सही कर सकता है ।
- कैल्शियम यात्रियों और बुनियादी sarcomere मंच पर छोटा पेसिंग की माप के लिए, चिकोटी दालों औसत, और फिर इस तरह के कैल्शियम यात्रियों के रूप में गतिशील मापदंडों का विश्लेषण, के समय लगातार कैल्शियम क्षणिक क्षय (ताऊ-1 हर्ट्ज), स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर का उपयोग कर.
नोट: सॉफ्टवेयर क्षय खंड अच्छी तरह से फिट नहीं है, तो मैनुअल मोनो घातीय वक्र फिटिंग के लिए गिरावट ट्रेस निर्यात.
कैफीन प्रेरित कैल्शियम दालों के लिए - , कैल्शियम हटाने समारोह के विश्लेषण के लिए एक खड़ी लहर के साथ ही पल्स का चयन करें. संकेत अशांति, असामान्य नाड़ी, या उन है कि दूर बीच में बह के साथ कोशिकाओं को शामिल न करें.
- कैफीन प्रेरित कैल्शियम पल्स के आयाम को मापने (सीए-कैफीन, SRCa 2 + रिजर्व के एक सूचकांक).
- कैफीन प्रेरित कैल्शियम पल्स के क्षय समय लगातार प्राप्त (ताऊ-कैफीन) मोनो-घातीय वक्र फिटिंग (10 एस अवधि) सॉफ्टवेयर से मैन्युअल रूप से (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2c ).
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Representative Results
यहां, हम उदाहरण के लिए streptozotocin (STZ)-प्रेरित मधुमेह चूहों (डीएम) और उंर मिलान Sprague-Dawley (एसडी) चूहों का वर्णन । 8 सप्ताह पुराने पुरुष एसडी चूहों (२०० ± 20 जी) STZ के एक एकल intraperitoneal इंजेक्शन प्राप्त (७० मिलीग्राम/kg, ip) नियंत्रण समूह के लिए डीएम समूह या साइट्रेट बफ़र के लिए । एक सप्ताह बाद STZ प्रशासन, चूहों के साथ रक्त ग्लूकोज & #62; १६.७ mmol/एल मधुमेह माना जाता था. 8 सप्ताह के बाद, LV myocytes enzymatically अलग थे । कैल्शियम पुनः आरंभ करने के बाद, myocytes के बारे में ७०-८०% है कि अस्तित्व के राज्य में रहते हैं । केवल एक रॉड के साथ myocytes-आकार, स्पष्ट striations, और स्थिर संकुचन रिकॉर्डिंग के लिए चयनित किया गया (चित्र 1b) । जैसा कि चित्र 1aमें दिखाया गया है, हम myocytes के लिए चैंबर छिड़काव और सुई छिड़काव की स्थापना की । छिड़काव वाल्व और पेसिंग प्रणाली स्वचालित रूप से चित्रा 2aमें वर्णित के रूप में एक पूर्व निर्धारित कार्यक्रम से बदल रहे थे । intracellular कैल्शियम प्रतिदीप्ति एक कैल्शियम इमेजिंग प्रणाली द्वारा दर्ज किया गया था । मान ± SEM के रूप में रिपोर्ट किया गया ।
एसडी समूह के साथ तुलना में, डीएम समूह कैफीन प्रेरित कैल्शियम पल्स (सीए-कैफीन) के महत्वपूर्ण निचले आयाम दिखाया (०.३३२ ± ०.००८ बनाम. ०.२७६ ± ०.००८, t-test: p & #60; ०.०५) और एक कम आंशिक कैल्शियम रिलीज एसआर (सीए-1 हर्ट्ज/ Ca-कैफीन) (७८.५ ± १.५% बनाम ७२.१ ± १.०%, t-test: p & #60; ०.०५) (चित्र b) । ताऊ-1 हर्ट्ज और ताऊ-कैफीन मोनो घातीय वक्र फिटिंग से प्राप्त किया गया; डीएम समूह उल्लेखनीय अब कैफीन प्रेरित कैल्शियम पल्स (ताऊ-कैफीन) के क्षय समय स्थिरांक दिखाया (१.८२२ ± ०.०७ एमएस बनाम २.८९६ ± ०.०८८ ms, t-test, p & #60; ०.०५), और ताऊ-1 हर्ट्ज/ताऊ-कैफीन अनुपात में उच्चतर स्तर (०.०७६ ± ०.००३ बनाम। ०.०८६ ± ०.००३, टी-टेस्ट, पी & #60; ०.०५) से एसडी समूह (चित्रा 2d) । इन परिणामों के संकेत उदास SR ca2 + आरक्षित और बिगड़ा सीए2 + मधुमेह cardiomyocytes में मंजूरी ।
चित्र 1. छिड़काव प्रणाली का चित्रण और पृथक LV myocytes. (क) कक्ष छिड़काव और पेंसिल छिड़काव का चित्रण. तीर छिड़काव कक्ष में NT समाधान के प्रवाह की दिशा को इंगित करता है । पेंसिल NT या कैफीन समाधान के साथ लक्ष्य myocyte आसपास के छिड़काव प्रदान करता है । माइक्रोन टिप चैंबर के ऊपर स्वतंत्र रूप से चालाकी से किया जा सकता है । (ख) एक रॉड के साथ पृथक LV myocytes के सूक्ष्म दृश्य आकार और स्पष्ट पार striations । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. एसआर कैल्शियम रिजर्व और कैल्शियम हटाने समारोह का आकलन. (A) स्विचिंग छिड़काव वाल्व और पेसिंग सिस्टम के लिए प्रोटोकॉल का रेखांकन स्वचालित रूप से । (ख) sr ca के सांख्यिकीय मान2 + रिजर्व और sr आंशिक ca2 + रिलीज़ 1 हर्ट्ज के लिए डीएम और एसडी समूहों में चिकोटी उत्तेजित. डीएम समूह ने एसडी समूह की तुलना में उल्लेखनीय कमी सीनियर सीए2 + रिजर्व और सीनियर आंशिक सीए2 + रिलीज दिखाई । (ग) सॉफ्टवेयर पैनल कैफीन प्रेरित कैल्शियम पल्स (ताऊ-कैफीन) के क्षय समय निरंतर के लिए एक मैन्युअल रूप से मोनो-घातीय वक्र फिटिंग दिखा । (D) बार रेखाचित्र की तुलना ताऊ-कैफीन और ताऊ-1 हर्ट्ज/ताऊ-डीएम और एसडी ग्रुप के बीच कैफीन । डीएम समूह ने ताऊ-कैफीन और ताऊ-1 हर्ट्ज/ताऊ-एसडी समूह की तुलना में कैफीन की महत्वपूर्ण वृद्धि हुई मूल्यों को दिखाया । मान = मतलब ± SEM, t-test प्रदर्शन किया गया, *p & #60; ०.०५ एसडी समूह के साथ तुलना में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| समाधान | सामग्री (मिमी में) |
| सामांय Tyrode (NT) समाधान | १३५ NaCl, ५.४ KCl, १.२ MgCl2, 10 ग्लूकोज, 10 HEPES, १.२ Na2HPO4, १.२ CaCl2, NaOH के साथ पीएच समायोजित ७.३५ |
| Ca2 + मुक्त Tyrode समाधान | १३५ NaCl, ५.४ KCl, १.२ MgCl2, 10 ग्लूकोज, 10 HEPES, १.२ Na2HPO4, 10 taurine, NaOH के साथ पीएच समायोजित करने के लिए ७.३५ |
| Collagenase आइसोलेशन समाधान | Collagenase A या Collagenase II + Ca2 + free Tyrode समाधान |
| KB समाधान | १२० कोह, १२० एल-Glutamic, 5 MgCl2, 10 HEPEs, 1 EGTA, 10 ग्लूकोज, 20 Taurine, KOH के साथ ७.३५ के लिए पीएच समायोजित |
| कैफीन छिड़काव समाधान | 10 NT समाधान में कैफीन |
तालिका 1. LV myocytes अलगाव और सेलुलर छिड़काव के लिए समाधान ।
| वाल्व | समय (दूसरा) |
| 2 | 15 |
| 1 | ६० |
तालिका 2. वाल्व नियंत्रण प्रणाली (वाल्व कमांडर) में मापदंडों के पूर्व निर्धारित ।
| पैनल प्रदर्शन | टिप्पणी |
| ४.० ms अवधि | विद्युत उत्तेजना क्षेत्र समय |
| ८.० वि | विद्युत वोल्टेज |
| एस १.० हर्ट्ज 999s | पेसिंग स्थिति में लक्ष्य myocyte खोजें |
| D2 001s | पेसिंग को थामने के लिए इस चरण का चयन करें और बेसल चिकोटी रिकॉर्डिंग के बाद 1s देरी |
| D3 015s * | "*" संकेत मिलता है कि उत्तेजित करता है एक 5v TTL संकेत आउटपुट कर सकते हैं |
| D4 060s | समाप्त कैफीन छिड़काव और myocyte सामांय स्थिति के लिए ठीक |
| अंत | $ s चरण रोलबैक |
तालिका 3. उत्तेजक में मापदंडों के प्रीसेट ।
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Discussion
कैल्शियम सीनियर से जारी फ्लक्स दिल में systole के लिए प्रमुख Ca2 + स्रोत है । कुछ हद तक, sr ca के आयाम2 + सामग्री और भिंन ca2 + sr से जारी की sr ca2 + हृदय संकुचन के लिए उपलब्ध आरक्षित प्रतिबिंबित । दूसरी ओर, सीनियर के सीए2 + रिजर्व एसआर सीए2 + reuptake, सीए की क्षमता पर निर्भर करता है2 + सीनियर के रिसाव, और diastole के दौरान सीनियर भर में उनके संतुलन12,13,14. हमारे प्रयोग में, 10 मिमी कैफीन की रैपिड आवेदन कुल सीए2 + जारी है और RyR चैनल खोलने के द्वारा सीनियर में सीए2 + reuptake को रोकने के लिए प्रेरित करने के उद्देश्य से है. इस प्रकार, कैफीन प्रेरित ca के आयाम2 + पल्स एसआर ca के एक सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है2 + रिजर्व. इसके अलावा, 1 हर्ट्ज और 3 हर्ट्ज में बुनियादी पेसिंग के साथ, हम आगे एसआर लोड और उसके अंतर्निहित तंत्र6की आवृत्ति निर्भरता की जांच कर सकता है.
कोशिका में Ca2 + को हटाने के कार्डियक डायस्टोलिक समारोह के लिए महत्वपूर्ण है । जैसा कि चित्र 2aमें दिखाया गया है, 1 हर्ट्ज क्षेत्र उत्तेजना के स्तर पर, कैल्शियम यात्रियों की गिरावट SR में सेरका के लिए जिंमेदार ठहराया गया था, cytomembrane में NCX, और धीमी गति से परिवहन प्रणालियों (mitochondrial ca2 + uniporter और sarcolemmal ca2 + -ATPase). के रूप में धीमी गति से तंत्र का योगदान नगण्य है, Ca के क्षय समय स्थिर2 + क्षणिक (ताऊ-1 हर्ट्ज) सेरका और NCX7,8,9की संयुक्त गतिविधि को दर्शाता है । कैफीन छिड़काव के स्तर पर, सेरका SR कैल्शियम रिजर्व बनाने में विफल रहा है । इस प्रकार, कैफीन प्रेरित कैल्शियम पल्स की गिरावट (ताऊ-कैफीन) मुख्य रूप से NCX के लिए जिंमेदार ठहराया गया था । तदनुसार, NCX समारोह ताऊ-कैफीन के लिए प्रासंगिक के रूप में नकारात्मक है । डायस्टोलिक Ca2 + हटाने के लिए NCX योगदान ताऊ-1 हर्ट्ज/ताऊ-कैफीन के अनुपात के लिए प्रासंगिक के रूप में सकारात्मक है । ताऊ-कैफीन और ताऊ-1 हर्ट्ज7,8,9के बीच अंतर के लिए प्रासंगिक के रूप में सेरका योगदान सकारात्मक है ।
प्रक्रिया को सफलतापूर्वक पूरा करने के लिए (चित्र 2), कुछ तकनीकी महत्वपूर्ण बिंदु है जो ध्यान दिया जाना चाहिए । सबसे पहले, एक स्वचालित प्रणाली की स्थापना पेसिंग और छिड़काव प्रणाली ठीक स्विचन के लिए महत्वपूर्ण है । पूर्व निर्धारित कार्यक्रम देरी समय सही नियंत्रण और कैफीन छिड़काव तेजी से लागू कर सकता है । दूसरे, इस प्रक्रिया के दौरान, myocytes छिड़काव समाधान से दूर धोया जा रहा है के जोखिम पर हैं । myocytes छुरा चैंबर डिश का पालन रखने के लिए, कोशिकाओं से अधिक 15 मिनट के लिए डिश में रिकॉर्डिंग से पहले रखा जाना चाहिए ।
इसके अलावा, कैफीन के आवेदन के लिए एक स्थिर सुई छिड़काव प्रणाली की स्थापना एक और महत्वपूर्ण कदम है । इस कदम के लिए तीन प्रमुख बिंदु हैं: (1) रैपिड चैनल स्विच और चिकनी सुई छिड़काव, (2) अच्छी तरह से नियंत्रित छिड़काव प्रवाह वेग, और (3) सुई टिप और लक्ष्य myocyte के बीच उचित दूरी. प्रवाह वेग, टिप दूरी, या समाधान चैनल स्विच में हस्तक्षेप की अनुचित सेटिंग एक स्वीकार्य कैफीन प्रेरित कैल्शियम पल्स प्राप्त करने की विफलता में परिणाम हो सकता है. कैफीन प्रेरित कैल्शियम दालों के लिए, केवल एक खड़ी लहर शिखा के साथ पल्स कैल्शियम हटाने समारोह के विश्लेषण के लिए चुना जा सकता है.
वैकल्पिक विधि पैच-दबाना प्रणाली पर आधारित अपेक्षाकृत सटीक डेटा प्रदान कर सकते हैं । हालांकि, कुछ कारकों, जैसे आवक-सुधार K+ वर्तमान, सटीकता को प्रभावित कर सकता है । इसके अलावा, उंनत उपकरण, कुशल तकनीशियन, और समय की खपत की एक उच्च आवश्यकता भी पैच-क्लैंप के आवेदन को सीमित कर सकते हैं । कुछ हद तक, हमारे प्रोटोकॉल की सीमा है कि यह SR लोड या सेरका और NCX की गतिविधि के प्रत्यक्ष मूल्यों प्रदान नहीं कर सकता है । पैरामीटर (जैसे, ca-कैफीन, ताऊ-कैफीन) केवल एसआर सामग्री और डायस्टोलिक सीए2 + हटाने परोक्ष रूप से योगदान बदलने को प्रतिबिंबित । हालांकि, इस प्रोटोकॉल सुविधा का लाभ, तकनीक और उपकरणों की कम सीमा है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (no. ८११००१५९, Dongwu लाइ; ८१४०११४७, Juhong झांग), झेजियांग प्रांत के चिकित्सा और स्वास्थ्य विज्ञान कार्यक्रम (सं. २०१६४६२४६, Dongwu लाइ), और स्वास्थ्य विज्ञान और हांग्जो सिटी (सं. 2013A28, डिंग लिन) की प्रौद्योगिकी योजना ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Alfa Aesar | 012314 | |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 012315 | |
| KCl | Alfa Aesar | 11595 | |
| HEPEs | Sigma | H3375 | |
| D-Glucose | Alfa Aesar | A16828 | |
| NaOH | Alfa Aesar | A18395 | |
| KOH | Alfa Aesar | A18854 | |
| KH2PO4 | Alfa Aesar | 011594 | |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 3337 | |
| L-Glutamic | Alfa Aesar | A15031 | |
| Taurine | Alfa Aesar | A12403 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
| BSA | Roche | 735094 | |
| caffeine | Sigma | C0750 | |
| Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
| Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
| Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
| Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
| Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
| valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
| Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
| Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
| Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
| Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
| Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |
References
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