Summary
Riciclaggio di calcio intracellulare svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione del reticolo sarcoplasmico Ca2 + riserva e funzione di rimozione del calcio diastolica in cardiomiociti da un sistema di imaging di calcio.
Abstract
Riciclaggio di calcio intracellulare svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti. Cardiaco reticolo sarcoplasmatico (SR) funge da Ca2 + serbatoio per contrazione, che reuptakes intracellulare Ca2 + durante il rilassamento. La SR Ca2 + riserva disponibile per beats è determinata per contractibility cardiaco, e la rimozione di intracellulare di Ca2 + è critica per la funzione cardiaca diastolica. In alcune condizioni fisiopatologiche, come il diabete e infarto, alterato del calcio liquidazione e SR Ca2 + store nei cardiomyocytes possono essere coinvolti nel progresso della disfunzione cardiaca. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione SRCa2 + riserva e diastolica Ca2 + rimozione. Brevemente, un singolo dei cardiomiociti era enzimaticamente isolato, e l'intracellulare Ca2 + fluorescenza indicata da Fura-2 è stata registrata da un sistema di imaging del calcio. Per assumere caffeina per indurre il rilascio totale di SR Ca2 + , abbiamo preimpostato un programma di interruttore automatico di aspersione di interconnessione del sistema di stimolazione e il sistema di perfusione. Quindi, l'adattamento delle curve mono-esponenziale è stato utilizzato per analizzare le costanti di tempo di decadimento di calcio transitori e impulsi di calcio indotta da caffeina. Di conseguenza, il contributo del SR Ca2 +-ATPasi (SERCA) e Na+-Ca2 + scambiatore (NCX) alla rimozione del calcio diastolica è stato valutato.
Introduction
Calcio intracellulare ([Ca2 +]i) riciclaggio svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti1. Come sappiamo, il calcio Ca2 + rilascio indotto avvia l'accoppiamento, di eccitazione-contrazione che traducono il segnale elettrico alla contrazione. La depolarizzazione della membrana attiva il sarcolemma Ca L-tipo2 + canali, che inducono il Ca2 + rilasciano da SR nel citoplasma attraverso recettori della rianodina 2 (RyR2). I transitori elevati citoplasmico Ca2 + avvia la contrazione delle miofibrille. Durante la diastole, citoplasmici Ca2 + è reuptaken nel SR per mezzo di SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) e pompato fuori del cardiomyocyte via Na+-Ca2 + scambiatore (NCX)2. Questo processo conduce alla contrazione-rilassamento riciclaggio nei cardiomiociti.
Il SR cardiaco è una rete di intracellulare della membrana che circonda il macchinario contrattile. Esso funge da Ca2 + serbatoio per la contrazione, e riassorbe intracellulare di Ca2 + durante il rilassamento. La SR Ca2 + riserva disponibile per beats è determinata per la contrattilità cardiaca. Nel frattempo, la rimozione di intracellulare di Ca2 + è critica per la diastole cardiaca. In alcune condizioni fisiopatologiche, come diabete e infarto, distanza2 + Ca alterata e depresso SR Ca2 + negozio in cardiomiociti può essere coinvolti nel processo di disfunzione cardiaca2,3 ,4.
Per misurare il rilascio di SR Ca2 + e Ca2 + rimozione diastolica in cardiomiociti, esistono due approcci ampiamente usati: l'integrità della corrente NCX basato su patch clamp5,6e la Ca indotta da caffeina 2 + pulse basato su Ca2 + fluorescenza imaging7,8,9. Il primo approccio dipende dal fatto che il Ca2 + rilasciato dal SR è in gran parte pompato fuori dalla cella di NCX. Tuttavia, questo approccio è limitato dalla sua esigenza di attrezzature avanzate e abile operazione. Nello studio presente, descriviamo un metodo conveniente per valutare la riserva di SR Ca2 + e Ca2 + rimozione nei miociti misurando un indotta da caffeina Ca2 + impulso basato su un Ca2 + fluorescenza sistema di imaging. Brevemente,intracellulare Ca 2 + la fluorescenza è indicata da Fura-2. Di interconnessione del sistema di stimolazione e il sistema di perfusione, vi presentiamo un programma per la perfusione di commutazione e automaticamente il sistema di stimolazione. 10 millimetri di caffeina è stata impiegata per indurre rapidamente il totale Ca2 + rilascio in SR. Le costanti di tempo di decadimento esponenziale (Tau) di calcio transitori e impulsi di calcio indotta da caffeina sono state ottenute da mono-esponenziale curva di raccordo, che riflettono la contribuiscono di SERCA e NCX alla diastolica Ca2 + rimozione di conseguenza.
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Protocol
tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal comitato di uso presso centro di ricerca sperimentale, Accademia delle scienze mediche cinese Cina e Università di Zhejiang e istituzionali Animal Care.
1. preparazione della soluzione
- preparare tutte le soluzioni, come descritto nella tabella 1.
2. isolamento di sinistra ventricolare (LV) cardiomiociti
Nota: LV cardiomiociti sono isolati enzimaticamente utilizzando un sistema di perfusione Langendroff come descritto in precedenza 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
- Ha istituito il sistema di perfusione Langendroff. Riempire il sistema di perfusione con soluzione di Tyrode normale (NT), impostare la temperatura a 36,5 ° C ed eliminare eventuali bolle d'aria nel tubo.
- Pesare e anestetizzare un ratto Sprague-Dawley tramite l'iniezione intraperitoneale (ip) di cloralio idrato (400 mg/kg). Confermare lo stato anestetico valutando la risposta di pizzico di punta o coda dopo 5 min
- Aprire la cavità addominale sotto il processo xifoideo con una forbice chirurgica, sollevare il processo xifoideo e aprite la cassa con la forbice. Rimuovere il pericardio, sollevare leggermente il cuore con pinzetta, identificare l'arco aortico e tagliare il cuore di forbici dalla radice dell'aorta.
- Trasferire il cuore a un piatto di 60 mm e lavare con soluzione di NT. Mantenere premuto l'aorta con due pinze di micro-dissezione e montarla sulla cannula di perfusione di Langendorff, poi legare saldamente l'aorta sulla cannula utilizzando suture chirurgiche.
Nota: Un operatore esperto può terminare questo processo entro 15 s. - Irrorare il cuore con una soluzione di 30 mL NT per ripristinare la circolazione delle arterie coronarie. Passare quindi il perfusato 30 mL Ca 2 +-libera soluzione di Tyrode (10mm taurina, 1 mg/mL BSA) per arrestare il battito cardiaco. Successivamente, passare il perfusato alla soluzione di isolamento di collagenasi A (0,6 mg/mL) per digestione degli enzimi di.
Nota: Uso della collagenosi A per esperimenti con ratti diabetici, o collagenasi II per esperimenti senza ratti diabetici. - Dopo la digestione per 20-25 min, cambiare rapidamente la soluzione di perfusione per il Ca 2 +-soluzione di Tyrode per arrestare ulteriore digestione libera. Quindi, tenere il cuore con il forcipe, tagliarlo dalla cannula e mettere il cuore in un piatto di 35 mm contenente soluzione KB (Vedi tabella 1).
- Sezionare la parete di LV con forbici e pinze. Tagliare l'atrio, ventricolo destro e la zona di giunzione atrioventricolare. Il tessuto restante è il LV; trasferirlo in un piatto nuovo 35mm con soluzione KB. Tritare il tessuto LV in piccoli pezzi.
- Delicatamente pipettare i pezzi con un contagocce di plastica filtrato e risospendere in soluzione 10 mL KB.
- Filtrare le cellule con 150 µm filtro di apertura in acciaio inox e trasferimento in una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare a 150 x g per 30 s e scartare il surnatante. Risospendere i miociti in soluzione 10 mL KB, libero accontentarsi di 6 min, eliminare il supernatante e risospendere il pellet in soluzione 10 mL KB.
Nota: Tutti i passaggi sono stati eseguiti a 36 ° C nelle soluzioni gassati con 100% O 2.
3. Reintroduzione del calcio
- dopo assestamento per 20 min in soluzione KB, scartare il surnatante e risospendere i miociti con soluzione di reintroduzione di calcio A (0,3 mM Ca 2 +, 4,5 mL Ca 2 +-soluzione gratuita Tyrode, NT di 1,5 mL di soluzione) per 10 min.
- Ripetere la procedura con soluzione di reintroduzione del calcio B (0,3 mM Ca 2 +, 3 mL Ca 2 +-soluzione gratuita Tyrode, NT di 3 mL di soluzione).
- Ripetere la procedura con soluzione di NT (1,2 mM Ca 2 +) per purificare i miociti disponibili. Memorizzare i miociti isolati di LV in questa soluzione e studiarli entro 4-6 h.
4. Set Up di aspersione System
- collegare il tubo di afflusso con la soluzione di NT per aspersione di alloggiamento ( Figura 1A).
- Per la perfusione dell'ago del miocita destinazione, collegare la punta collettore multi-canna (ad es., matita aspersione, indicato come matita d'ora in poi), risolto nel micromanipolatore, alla valvola controllato sistema di perfusione. Aggiungere la soluzione di NT e soluzione di caffeina 10 mM per ogni colonna della matita ( Figura 1A).
- Evacuare eventuali bolle d'aria nei tubi per evitare il blocco aria.
- Contare il numero di goccia dalla punta micron della matita per 10 s e di regolare manualmente il regolatore di flusso per mantenere la velocità di flusso alla velocità approssimativa di 3 flebo/10 s.
5. Misure di Ca intracellulare 2 + transitori e accorciamento del sarcomero 7 , 8 , 9
- sospensione di cellule di pipetta 10 µ l della diapositiva, contare i numeri delle cellule di un contatore di cellule sotto il microscopio e calcolare la densità. Diluire i miociti una concentrazione approssimativa di 50.000 cellule/mL.
- Aggiungi il Fura-2 acetossimetil (AM) magazzino (un colorante sensibile di calcio) in 1 mL di sospensione dei miociti per portare la concentrazione finale di 2 µM. tenere al buio per 20 min a temperatura ambiente.
- Centrifuga a 150 g per 30 s e risospendere i cardiomiociti con soluzione NT 2 volte.
- Disabilita spegne la luce e mantenere le cellule nel buio. Posto i miociti nella camera di perfusione per 15 min. Poi iniziare la perfusione di camera (1,5 mL/min) con soluzione di NT. Passo i miociti con stimolazione di campo 1 Hz utilizzando uno stimolatore (onda durata 4,0 ms, ampiezza di impulso 8.0 V) per 5 min.
- Selezionare un miocita con buona forma (forma di asta, spigoli vivi e deselezionare striature trasversali) e twitch stimolato stabile (nessuna contrazione spontanea) sotto i 10 x lente microscopica di obiettivo. Successivamente, modificare l'ingrandimento al microscopio a 40x e ruotare l'orientamento della telecamera CCD per mantenere miocita in posizione orizzontale.
- Telaio singolo miocita regolando l'adattatore di inquadratura delle cellule. Garantire che lo sfondo è chiaro.
- Esporre i miociti alla luce emessa da una lampada allo xeno, con 340 380 nm lunghezza d'onda di eccitazione filtri o e l'immagine i miociti attraverso un obiettivo 40x. Rilevare il segnale di fluorescenza a 510 nm. Nel frattempo, notare i cambiamenti di lunghezza del sarcomero dei miociti e registrare utilizzando il modulo del soft-bordo contemporaneamente.
- Record di fluorescenza da un sistema di fotomoltiplicatore dual-eccitazione fluorescenza. Eseguire il programma di registrazione per il calcio sistema di imaging, fare clic " File/Nuovo File " per creare un nuovo file di registrazione, scegliere il " inizio " pulsante per lunghezza in modo sincrono record di fluorescenza e sarcomero.
6. Valutazione di SR Ca 2 + riserva e diastolica Ca 2 + rimozione funzione 7 , 8 , 9
- Interlink la " Aux Out " porta in lo stimolatore con la " In analogici " porta sul sistema di controllo della valvola (ad es., comandante della valvola, vedere Tabella materiali) da un cavo BNC (per sincronizzare il segnale TTL).
- Preset un programma per le valvole di aspersione di commutazione automaticamente come descritto in precedenza 8 , 9; Procedura dettagliata per il funzionamento è elencata come segue.
- Preset i parametri della valvola di controllano software secondo la tabella 2 e scegliere il " Download " pulsante per scaricare la sequenza caricati nel programma. Fare clic sul " Trigger " pulsante per attivare la funzione trigger.
Nota: Il sistema di controllo della valvola possa eseguire la sequenza dopo la ricezione del segnale TTL. - Preset lo stimolatore alla modalità di sequenza e impostare i parametri come da tabella 3.
- Preset i parametri della valvola di controllano software secondo la tabella 2 e scegliere il " Download " pulsante per scaricare la sequenza caricati nel programma. Fare clic sul " Trigger " pulsante per attivare la funzione trigger.
- Impostare lo stimolatore a " S1 passo " di ritmo LV miociti a 1 Hz. iniziare la perfusione dell'ago alla velocità di 1,5 mL/min con soluzione NT.
Nota: Perché la velocità del flusso dell'ago è più veloce di aspersione di camera, la rifrazione della luce del flusso dell'ago è diversa dalla rifrazione della luce di aspersione di camera. La differenza di rifrazione della luce indica la gamma di aspersione efficace dell'ago, che circonda il bersaglio del miocita. - Selezionare un destinazione del miocita sotto la visualizzazione microscopica di bassa potenza (nella sequenza di a valle verso Monte), e assicurarsi che si raggiunge dalla micro punta della matita. Modificare l'ingrandimento del microscopio 400x. Ruotare l'orientamento della telecamera CCD per mantenere miocita in posizione orizzontale. Regolare l'apertura rettangolare sotto la scheda di inquadratura delle cellule a una finestra adatta che riempie con i miociti. Assicurarsi che vi sia un fondo minimo; non consentire altri miociti o detriti cellulari morti in questa finestra.
- Regolare la posizione della matita fissata sul micromanipolatore e posizionare con cura la micro punta alla distanza del raggio del campo di visione per il destinazione del miocita sotto 400 x ingrandimento del microscopio.
- Regolare l'intervallo di flusso dell'ago per gran parte coprire il bersaglio del miocita e assicurarsi che miocita non può essere spazzato via dal flusso dell'ago.
- Dopo 60 s base stimolazione, rotolare il cursore di stimolatore per il " passo D2 ".
Nota: Il resto del protocollo verrà eseguito automaticamente dal sistema di controllo di valvola e stimolatore. In base all'impostazione di cui sopra, il protocollo potrebbe essere eseguito automaticamente come in Figura 2A, 1 Hz base stimolazione con soluzione di NT per 60 s. Quindi mettere in pausa la cadenza e ritardo per 2 s, passare rapidamente alla perfusione di caffeina di 10 mM per 15 s (per funzionalmente rilasciare Ca 2 + archiviazione nella Repubblica slovacca) e quindi passare nuovamente alla soluzione NT. - Alla fine della registrazione, rilevare la fluorescenza di fondo per singoli miociti. Fare clic sul " pausa " pulsante per mettere in pausa il file di registrazione, spostare la vista al microscopio in una vicina area vuota. Fare clic sul " record " pulsante per riprendere la registrazione per secondi e registrare valori numerici 340 e 380 nm intensità per la correzione di fondo.
- Aperto il " operazione/costante " nella finestra di dialogo e riempire i valori nel " sfondo " formano, rispettivamente; il software può correggere i valori di rapporto di Fura 2 sottraendo background.
7. Dati analisi 9
- per misure di transienti di calcio e sarcomero accorciamento nella fase di stimolazione base, media gli impulsi di contrazione e quindi analizzare parametri dinamici, ad esempio transienti di calcio, la costante di tempo di decadimento transitoria di calcio (Tau-1 Hz), utilizzando il software automaticamente.
Nota: Se il software non si adatta bene il segmento di decadimento, esportare la traccia di declino per il montaggio manuale mono-esponenziale curva. - Per gli impulsi di calcio indotta da caffeina, selezionare solo il polso con un'onda ripida per l'analisi della funzione di rimozione del calcio. Escludere le celle con dispersione di segnale, impulso anormale o quelli che scorreva via midway.
- Misurare l'ampiezza dell'impulso indotta da caffeina calcio (Ca-caffeina, un indice di SRCa 2 + riserva).
- Per ottenere la costante di tempo di decadimento dell'impulso di calcio indotta da caffeina (Tau-caffeina) mono-esponenziale curva raccordo (durata 10 s) manualmente da software ( Figura 2).
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Representative Results
Qui, vi illustriamo streptozotocin (STZ) - ratti diabetici (DM) indotti e pari età Sprague - Dawley (SD) ad esempio i ratti. 8-settimana-vecchio maschio SD ratti (200 ± 20 g) hanno ricevuto una singola iniezione intraperitoneale di STZ (70 mg/kg, ip) per il buffer di gruppo o citrato di DM per il gruppo di controllo. Una settimana dopo amministrazione di STZ, ratti con glicemia > 16.7 mmol/L sono stati considerati diabetici. Dopo 8 settimane, i miociti di LV sono stati enzimaticamente isolati. Dopo la rintroduzione di calcio, c'è circa il 70-80% dei miociti che rimangano nello stato di sopravvivenza. Soli miociti con forma di asta, striature chiare e stabili contrazioni sono stati selezionati per la registrazione (Figura 1B). Come mostrato in Figura 1A, abbiamo istituito la camera perfusione e la perfusione dell'ago per miociti. Aspersione valvole e sistema di stimolazione sono stati commutati automaticamente da un programma predefinito come descritto nella Figura 2A. La fluorescenza di calcio intracellulare è stata registrata da un sistema di imaging di calcio. I valori sono stati riportati come media ± SEM
Rispetto al gruppo di SD, il gruppo di DM ha mostrato significativa minore ampiezza dell'impulso indotta da caffeina calcio (Ca-caffeina) (0,332 ± 0.008 vs. 0,276 ± 0,008, t-test: p < 0.05) e un minore rilascio di frazionario del calcio SR (Ca-1 Hz / CA-caffeine) (78,5 ± 1,5% vs 72,1 ± 1.0%, t-test: p < 0.05) (Figura 2B). Il Tau-1 Hz e Tau-caffeina sono stati ottenuti da mono-esponenziale curva raccordo; il gruppo di DM ha mostrato notevole deperimento più costanti di tempo dell'impulso di calcio indotta da caffeina (Tau-caffeina) (1,822 ± 0,07 ms vs. 2.896 ± 0,088 ms, test t, p < 0,05) e un livello superiore nel rapporto di Tau-1 Hz/Tau-caffeina (0,076 ± 0.003 vs. 0,086 ± 0.003, test t, p < 0.05) rispetto al gruppo di SD (Figura 2D). Questi risultati indicato il depresso SR Ca2 + riserva ed ha alterato il Ca2 + clearance nei cardiomiociti diabetici.
Figura 1. Illustrazione del sistema di perfusione e miociti isolati di LV. (A) illustrazione della perfusione camera e matita di aspersione. Le frecce indicano la direzione di flusso della soluzione NT nella camera di aspersione. La matita fornisce aspersione che circonda il bersaglio del miocita con soluzione NT o caffeina. La punta di micron può essere manipolata liberamente sopra la camera. (B) Vista microscopica di isolato LV miociti con forma di asta e deselezionare striature trasversali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Valutazione della funzione del calcio calcio e riserva rimozione SR. (A) illustrazione del protocollo per la perfusione valvole di commutazione e automaticamente il sistema di stimolazione. Statistica (B) valori di SR Ca2 + riserva e SR frazionario Ca2 + rilascio per 1Hz stimolato twitches nei gruppi di DM e SD. Il gruppo di DM ha mostrato significativa diminuzione SR Ca2 + riserva e SR frazionario Ca2 + rilascio rispetto al gruppo di SD. (C) pannello Software mostrando un'adattamento per il tempo di decadimento della curva manualmente mono-esponenziale costante di impulso di calcio indotta da caffeina (Tau-caffeina). (D) grafici a barre confrontando la Tau-caffeina e Tau-1 Hz/Tau-caffeina tra i gruppi DM e SD. Il gruppo di DM ha mostrato significativi valori aumentati di Tau-caffeina e Tau-1 Hz/Tau-caffeina rispetto al gruppo di SD. Valore = media ± SEM, sono stati effettuati test t, *p < 0,05 rispetto al gruppo di SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzioni | Contenuto (in mM) |
| Soluzione normale Tyrode (NT) | NaCl 135, 5.4 KCl, 1,2 MgCl2, glucosio 10, 10 HEPES, 1,2 Na2HPO4, 1,2 CaCl2, regolare il pH con NaOH a 7.35 |
| CA2 + soluzione di Tyrode libera | NaCl 135, 5.4 KCl, 1,2 MgCl2, glucosio 10, 10 HEPES, 1,2 Na2HPO4, 10 taurina, regolare il pH con NaOH a 7.35 |
| Soluzione di isolamento di collagenasi | Collagenosi A o collagenasi II + Ca2 + soluzione di Tyrode libera |
| Soluzione KB | KOH 120, 120 L-glutammico, 5 MgCl2, 10 HEPEs, 1 EGTA, glucosio di 10, 20 taurina, regolare il pH a 7.35 con KOH |
| Soluzione di perfusione di caffeina | 10 caffeina in soluzione di NT |
Tabella 1. Soluzioni per aspersione di isolamento e cellular miociti LV.
| Valvola | Tempo (secondo) |
| 2 | 15 |
| 1 | 60 |
Tabella 2. Preselezione dei parametri nel sistema di controllo valvola (comandante della valvola).
| Display del pannello | Commento |
| 4,0 ms di durata | tempo campo di stimolazione elettrica |
| 8.0 V | tensione elettrica |
| S1 1,0 HZ 999S | trovare il destinazione del miocita presso lo stato di stimolazione |
| D2 001S | Selezionare questo passaggio alla cadenza di pausa e ritardare 1s dopo la registrazione di contrazione basale |
| D3 015S * | "*" indica che lo stimolatore può produrre un segnale TTL 5V |
| D4 060S | finitura caffeina aspersione e miocita recuperare allo stato normale |
| FINE | rollback a passo S1 |
Tabella 3. Preselezione dei parametri nello stimolatore.
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Discussion
Flusso di calcio rilasciato dal SR è il Ca2 + fonte principale per sistole nel cuore. A una certa misura, l'ampiezza del SR Ca2 + contenuto e frazionario Ca2 + rilasciato dal SR riflettono la SR Ca2 + riserva disponibile per la contrazione cardiaca. D'altra parte, il Ca2 + riserva di SR dipende dalla capacità del loro equilibrio, Ca2 + perdita di SR e SR Ca2 + reuptake attraverso la SR durante la diastole12,13,14. Nel nostro esperimento, applicazione veloce di 10 millimetri di caffeina è mirato a indurre totale Ca2 + rilasciare e prevenire Ca2 + reuptake nella Repubblica slovacca con l'apertura del canale di RyR. Così, l'ampiezza dell'impulso a Ca2 + indotta da caffeina potrebbe essere utilizzato come indice di riserva di SR Ca2 + . Inoltre, con base la cadenza di 1 Hz e 3 Hz, abbiamo potuto approfondire la dipendenza dalla frequenza di carico SR e suo meccanismo sottostante6.
Rimozione di Ca2 + nel citoplasma è critica per la funzione cardiaca diastolica. Come mostrato in Figura 2A, nella fase di stimolazione di campo di 1 Hz, il declino dei transienti di calcio è stato attribuito al SERCA nella Repubblica slovacca, NCX nel cytomembrane e sistemi di trasporto lento (Ca2 + uniporter mitocondriale e sarcolemmal Ca2 + -ATPasi). Come il contributo dei meccanismi lenti è trascurabile, la costante di tempo di decadimento del Ca2 + transiente (Tau-1 Hz) riflette l'attività combinata di SERCA e NCX7,8,9. Nella fase di aspersione di caffeina, SERCA non è riuscito a costruire la riserva di calcio SR. Così, il declino dell'impulso di calcio indotta da caffeina (Tau-caffeina) pricipalmente è stato attribuito al NCX. Corrispondentemente, la funzione NCX è negativa come pertinenti alla Tau-caffeina. Il contributo di NCX alla diastolica2 + rimozione di Ca è positivo come rilevanti per il rapporto di Tau-1 Hz/Tau-caffeina. Il contributo di SERCA è positivo come rilevanti per la differenza tra Tau-caffeina e Tau-1 Hz7,8,9.
Per completare correttamente la procedura (Figura 2), ci sono alcuni punti chiave tecnici che dovrebbero essere notati. In primo luogo, che istituisce un sistema automatizzato è fondamentale per il sistema di stimolazione e l'aspersione di commutazione precisamente. Il programma preimpostato è in grado di controllare il tempo di ritardo con precisione e applicare rapidamente la perfusione di caffeina. In secondo luogo, durante il processo, i miociti sono a rischio di essere spazzata via dalla soluzione di perfusione. Per mantenere che i miociti aderiti stabilmente al piatto da camera, le cellule devono trovarsi nel piatto per più di 15 minuti prima della registrazione.
Inoltre, istituire un sistema di perfusione dell'ago stabile per l'applicazione di caffeina è un altro passo fondamentale. Ci sono tre punti chiave per questo passaggio: interruttore di canale (1) rapido e aspersione dell'ago liscia, velocità di flusso di perfusione (2) ben controllato e corretto (3) la distanza tra la punta dell'ago e del miocita di destinazione. Inadeguata impostazione della velocità di flusso, distanza punta o interferenze nell'interruttore canale soluzione potrebbe causare errore di acquisizione di un impulso di calcio indotta da caffeina accettabile. Per impulsi di calcio indotta da caffeina, solo il polso con una cresta di onda ripida poteva essere selezionato per l'analisi della funzione di rimozione del calcio.
Il metodo alternativo basato sul sistema di patch-clamp può fornire dati relativamente precisi. Tuttavia, alcuni fattori, come l'interno-raddrizzatore K+ corrente, possono influenzare la precisione. Inoltre, un più alto requisito di attrezzature avanzate, tecnico specializzato ed il consumo di tempo può anche limitare l'applicazione di patch-clamp. In una certa misura, il nostro protocollo ha la limitazione che potrebbe non fornire valori diretti del carico SR o attività di SERCA e NCX. I parametri (ad es., Ca-caffeina, Tau-caffeina) riflettono solo cambiando SR contenuti e contribuiscono alla diastolica Ca2 + rimozione indirettamente. Tuttavia, questo protocollo ha il vantaggio della convenienza, meno limitazione della tecnica e delle attrezzature.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (No. 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), il medico e salute scienza programma della provincia del Zhejiang (No. 201646246, Dongwu Lai) e la scienza di salute e Piano tecnologico della città di Hangzhou (n. 2013A28, Ding Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Alfa Aesar | 012314 | |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 012315 | |
| KCl | Alfa Aesar | 11595 | |
| HEPEs | Sigma | H3375 | |
| D-Glucose | Alfa Aesar | A16828 | |
| NaOH | Alfa Aesar | A18395 | |
| KOH | Alfa Aesar | A18854 | |
| KH2PO4 | Alfa Aesar | 011594 | |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 3337 | |
| L-Glutamic | Alfa Aesar | A15031 | |
| Taurine | Alfa Aesar | A12403 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
| BSA | Roche | 735094 | |
| caffeine | Sigma | C0750 | |
| Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
| Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
| Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
| Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
| Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
| valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
| Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
| Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
| Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
| Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
| Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |
References
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