격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

Summary

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리가 칼슘 이미징 시스템에 의해 sarcoplasmic 그물 캘리포니아^{2 +} 예약 및 cardiomyocytes에 확장기 칼슘 제거 기능을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 심장 sarcoplasmic 그물 (SR) Ca^{2 +} 수축, 어떤 reuptakes 세포내 캘리포니아^{2 +} 휴식 동안에 대 한 저수지 역할을 합니다. SR Ca^{2 +} 예약 비트 사용할 수 심장 contractibility에 대 한 결정 이며, 세포내 캘리포니아^{2 +} 의 제거는 심장 심장 확장 기능에 대 한 중요 한. 당뇨병과 심장 마비 같은 병 태 생리 조건에서 장애인된 칼슘 클리어런스 및 SR Ca^{2 +} 저장소 cardiomyocytes에 심장 부전의 진행에 관련 수 있습니다. 여기, 우리는 미술관^{2 +} 예약 및 확장기 Ca^{2 +} 제거 프로토콜을 설명 합니다. 간단히, 단일 cardiomyocyte 효소 고립 되었고 세포내 캘리포니아^{2 +} 형광 Fura-2에 표시 된 칼슘 이미징 시스템에 의해 기록 되었다. 총 SR 캘리포니아^{2 +} 릴리스 유도 대 한 카페인을 고용, 우리 interlinking 자극 시스템 및 관류 시스템에 의해 자동 관류 스위치 프로그램을 미리. 다음, 모노 지 수 곡선 피팅 칼슘 과도 및 카페인을 이용한 칼슘 펄스의 붕괴 시간 상수를 분석 하는 데 사용 되었다. 따라, 기여의 SR 캘리포니아^{2 +}-ATPase (SERCA) 및 Na⁺-캘리포니아^{2 +} 교환기 (NCX) 확장기 칼슘 제거를 평가 했다.

Introduction

세포내 칼슘 ([캘리포니아^{2 +}]_나) 재활용 cardiomyocytes¹에서 수축 기 및 확장기 함수 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 우리가 알고 있듯이, 칼슘 유도 Ca^{2 +} 릴리스는 수축 하는 전기 신호를 변환 시킵니다 흥분 수축 연결, 시작 합니다. 막 도발은 유도 캘리포니아^{2 + 2 +} 채널, SR에서 ryanodine 수용 체 2 (RyR2)를 통해 세포질으로 출시 sarcolemmal L 형 Ca를 활성화 합니다. 과도 높은 세포질 캘리포니아^{2 +} myofibrils의 수축을 시작합니다. SR 캘리포니아^{2 +}를 사용 하 여 SR에 reuptaken는 심장, 동안 세포질 캘리포니아^{2 +} -ATPase 2 (SERCA2)와 나⁺-캘리포니아^{2 +} 교환기 (NCX)²를 통해 cardiomyocyte 밖으로 펌핑. 이 프로세스는 cardiomyocyte 재활용 수축-이완 이끌어 낸다.

심장 SR은 세포내 막 네트워크 주변 수축 성 기계입니다. 그것은 캘리포니아^{2 +} , 수축에 대 한 저수지 역할을 하 고 reabsorbs 세포내 캘리포니아^{2 +} 휴식 중. SR 캘리포니아^{2 +} 예약 비트 사용할 수 심장 수축에 대 한 결정 이다. 한편, 세포내 캘리포니아^{2 +} 의 제거가 심장 심장에 대 한 중요 합니다. 일부 병 태 생리 조건 등 당뇨병과 심장 마비, 장애인된 캘리포니아^{2 +} 클리어런스 우울 SR 캘리포니아^{2 +} cardiomyocytes에 저장소 관련 되어있을 수 있습니다 심장 부전^{2,3 과정 ,4}.

SR 캘리포니아^{2 +} 릴리스 및 cardiomyocytes에 확장기 Ca^{2 +} 제거 측정, 널리 사용 되는 방법은 두 가지: 패치 클램프^5,6, 카페인 유발 Ca 기반으로 NCX 전류의 무결성 ^{2 +} 캘리포니아^{2 +} 형광 이미징^7,,89에 따라 펄스. 전 접근 그는 캘리포니아^{2 +} SR에서 발표는 크게 셀에서에 의해 펌핑 NCX 사실에 따라 달라 집니다. 그러나,이 접근의 고급 장비와 숙련 된 작업의 요구에 의해 제한 됩니다. 현재 연구에서 우리가 SR 캘리포니아^{2 +} 예비 그리고 캘리포니아^{2 +} 제거 myocytes에서 카페인 유발 Ca^{2 +} 펄스는 캘리포니아^{2 +} 형광 이미징 시스템에 따라 측정 하 여 평가 하는 편리한 접근 방식을 설명 합니다. 간단히, 세포내 캘리포니아^{2 +} 형광 Fura-2로 표시 됩니다. Interlinking 자극 시스템 및 관류 시스템, 선물이 관류를 전환 하 고 시스템을 자동으로 속도 위한 프로그램. 10mm 카페인 빠르게는 미스터에 총 캘리포니아^{2 +} 출시를 유도 하기 위해 고용 되었다 지 수 감퇴 시간 상수 (타우) 칼슘 과도 및 카페인을 이용한 칼슘 펄스의 확장기 캘리포니아^{2 +} 제거 SERCA NCX의 기여를 적절 하 게 반영 하는 피팅, 모노 지 수 곡선에서 얻은 했다.

Protocol

모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 실험 연구 센터, 중국 과학 아카데미의 중국 의료 및 절 강 대학에 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 되었습니다.

1. 솔루션 준비

1. 표 1에 설명 된 대로 모든 솔루션을 준비.

2. 격리의 왼쪽 심 실 (LV) Cardiomyocytes

참고: LV cardiomyocytes는 효소 Langendroff 관류 시스템을 사용 하 여 앞에서 설명한 ^{7 , 8 , , 9 10 , 11}.

Langendroff 관류 시스템을 설정합니다. 관류 시스템 표준 Tyrode (NT) 솔루션, 36.5 ° C에서 온도 설정를 튜브에서 모든 기포를 제거.
1. 그리고 무게 chloral 하이드 레이트 (400 mg/kg)의 복 주사 (ip)에 의해 Sprague-Dawley 쥐를 anesthetize. 5 분 후 꼬리 또는 발가락을 꼬집어 응답을 평가 하 여 마 취 상태 확인
2. 수술 시저와 칼 프로세스 아래 복 부 구멍을 열고, 칼 프로세스 들어올린는 시저와 가슴을 열고. 심 낭을 제거, 약간 리프트 심장 곡선된 겸 자와, 대동맥 아치, 식별 및 대동맥의 루트에서가 위, 심장 차단.
3. 60 mm 접시에는 마음을 전송 하 고 NT 솔루션으로 그것을 씻어. 대동맥 두 마이크로 해 부 집게와 고 Langendorff 관류 정에 마운트 누른 다음 단단히 대동맥 수술 봉합을 사용 하 여 정 맥에 선.
   참고: 숙련 된 연산자 15이이 프로세스를 완료할 수 있다 s.
4. 심장 관상 동맥의 순환 회복을 30 mL NT 솔루션 perfuse. 그런 다음 Ca ^{2 +} 30 mL는 perfusate 전환-무료 Tyrode 솔루션 (10 mM 황소자리, 1 mg/mL BSA)는 심장 박동을 중지. 다음, 효소 소화의 콜라 A 격리 솔루션 (0.6 mg/mL)는 perfusate 전환.
   참고: 당뇨병 쥐 없이 당뇨병 쥐, 또는 콜라 II와 실험에 대 한 실험에 대 한 사용 콜라 A.
5. 소화 20-25 분, 후 신속 하 게 변경 관류 솔루션 캘리포니아 ^{2 +}-무료 Tyrode 솔루션 추가 소화 중지. 다음, 집게로 마음을 잡고, 정에서 그것을 잘라 고 KB 솔루션을 포함 하는 35 mm 접시에는 마음을 배치 (표 1 참조).
6. LV 벽 집게와가 위를 해 부. 심 방, 우 심 실 및 것 접합 영역을 잘라. 나머지 조직이 이다 라스베가스; KB 솔루션과 새로운 35 mm 접시에 그것을 전송. 작은 조각으로 LV 조직 말하다.
7. 부드럽게 필터링 된 플라스틱 스 포 이트와 조각 플라스틱 하 고 다시 10 mL KB 솔루션에 중단.
8. 150 µ m 조리개 스테인레스 스틸 필터와 15 mL 원심 분리기 튜브에 셀 필터링. 30 s 및 삭제는 상쾌한 150 x g에서 원심. 다시 10 mL KB 솔루션, 무료 myocytes 정착 6 분에 대 한 일시 중단 상쾌한, 삭제 하 고 다시 10 mL KB 솔루션에 펠 릿을 중단.
   참고: 모든 단계 솔루션 100% O ₂ 기름에 36 ° C에서 수행 했다.

3. 칼슘 Reintroduction

1. KB 솔루션에서 20 분 동안 정착 후 상쾌한, 삭제 하 고 다시 칼슘 reintroduction 솔루션 A myocytes를 일시 중지 (0.3 m m 캘리포니아 ^{2 +}, 4.5 mL 캘리포니아 ^{2 +}-무료 Tyrode 솔루션, 1.5 mL NT 솔루션) 10 분에 대 한
2. 칼슘 reintroduction 솔루션 B 위의 절차를 반복 (0.3 m m 캘리포니아 ^{2 +}, 3 mL 캘리포니아 ^{2 +}-무료 Tyrode 솔루션, 3 mL NT 솔루션).
3. NT 솔루션 (1.2 m m 캘리포니아 ^{2 +}) 가능한 myocytes 정화 위의 절차를 반복 합니다. 이 솔루션에서 격리 된 LV myocytes를 저장 하 고 4-6 헤 내 공부

4. 설정 최대의 관류 시스템

1. 챔버 관류 ( 그림 1A)에 대 한 NT 솔루션 유입 튜브를 연결.
2. 대상 myocyte의 바늘 관류에 대 한 연결 (예를 들어, 관류 연필, 연필 이제부터 하 라고) 멀티 배럴 매니폴드 팁는 micromanipulator에 고정, 관류 시스템 제어 밸브에. 연필 ( 그림 1A)의 각 열에 NT 솔루션 및 10mm 카페인 솔루션 추가.
3. 어떤 공기 방울을 공기 막힘을 피하기 위해 튜브에 대피.
4. 물방울 개수 미크론 팁에서 10 연필 s, 수동으로 조정 흐름 레 귤 레이 터 3 물방울/10 미의 대략적인 속도에서 흐름의 속도 유지 하 고

5. 측정 세포내 캘리포니아 ^{2 +} 변이 및 Sarcomere 단축 ^{7 , , 8 9}

1. 슬라이드에서 피 펫 10 µ L 세포 현 탁 액 현미경, 셀 카운터로 핸드폰 번호를 계산 하 고 밀도 계산. 50, 000 셀/mL의 대략 농도에 myocytes 희석.
2. 추가 Fura-2 acetoxymethyl (오전) 주식 (칼슘 민감한 염료) 2 µ M. 최종 농도가지고 myocytes의 1 mL 정지로 실 온에서 20 분 동안 어둠 속에서 유지.
3. 30 s, 그리고 다시 중단 NT 솔루션 cardiomyocytes 2 번에 대 한 150 g에서 원심 분리기.
4. 차례 빛와 어둠 속에서 셀을 계속. 15 분 동안 관류 챔버에 myocytes 장소. 그런 다음 NT 솔루션 챔버 관류 (1.5 mL/min)를 시작 합니다. 5 분에 대 한 자극 (파 기간 4.0 ms, 펄스 진폭 8.0 V)를 사용 하 여 1 Hz 필드 자극에 myocytes 속도
5. 좋은 모양 myocyte 선택 (막대 모양, 가장자리, 샤 프와 크로스 강선 취소) 및 현미경 대물 렌즈 10x에서 안정적인 자극된 경련 (자발적 수축). 다음, 40 x, 현미경 배율 변경 하 고 수평 위치에 있는 myocyte를 유지 수 있는 CCD 카메라 방향 회전.
6. 셀 프레임 어댑터를 조정 하 여 단일 myocyte 프레임. 배경 지우기 확인.
7. 340 또는 380 nm 파장 여기 필터와 크 세 논 램프에서 방출 되는 빛에 myocytes 고 40 x 목표를 통해 myocytes 이미지. 510에서 형광 신호를 감지 nm. 한편,는 myocytes의 sarcomere 길이 변화 및 소프트에 지 모듈을 사용 하 여 동시에 녹화.
듀얼-여기 형광 광 전 증폭 관 시스템의 기록
8. 형광 칼슘 이미징 시스템의 녹음 프로그램 실행, 클릭 합니다 " 파일/새 파일 " 새로운 기록 파일을 만들고 클릭 하는 " 시작 "를 동기적으로 형광 및 sarcomere 버튼.

6. SR 캘리포니아 ^{2 +} 예약 및 확장기 캘리포니아 ^{2 +} 제거 기능 ^{7 , , 8 9} 평가

1. Interlink는 " 보조 아웃 "에 포트 와 자극 기는 " 아날로그에 " 밸브 제어 시스템에 포트 (예를 들어, 밸브 사령관, 재료의 표 참조) BNC 케이블 (TTL 신호를 동기화)을 여.
2. 미리 관류 밸브를 자동으로 앞에서 설명한 ^{8 , 9}; 전환 프로그램 작업에 대 한 자세한 내용은 다음과 같습니다.
   1. 프리셋 밸브에서 매개 변수 표 2에 의하여 소프트웨어를 제어 하 고 클릭에 " 다운로드 " 다운로드 순서 단추를 프로그램에 로드 된. 클릭은 " Trigg어 " 트리거 기능을 사용 하도록 단추.
      참고: 밸브 제어 시스템 TTL 신호를 받은 후 시퀀스를 실행할 수 있습니다.
   2. 미리 시퀀스 모드를 자극 하 고 표 3에 의하여 매개 변수 설정.
3. 설정에서 자극 기 " s 1 단계 " LV 페이스를 myocytes에서 1 Hz. NT 솔루션 1.5 mL/min의 속도로 바늘 관류 시작.
   참고: 챔버 관류 보다 바늘 스트림의 속도 이므로 바늘 스트림의 빛 굴절은 다릅니다 챔버 관류의 빛 굴절. 빛 굴절의 차이 대상 myocyte를 포위 하는 효과적인 바늘 관류의 범위를 나타냅니다.
4. (순서로 다운스트림 업스트림 하의), 낮은 전력 미세한 보기 아래 대상 myocyte를 선택 하 고 있는지 확인 하십시오 그것은 연필의 마이크로 팁에 의해 도달 될 수 있다. 400 x 현미경 배율을 변경 합니다. CCD 카메라 방향을 수평 위치에 있는 myocyte를 계속 회전 합니다. 셀 프레임 어댑터는 myocytes 채웁니다 적당 한 창 아래 사각형 조리개를 조정 합니다. 최소한의 배경; 인지 확인 다른 myocytes 또는이 창에서 죽은 세포 파편을 허용 하지 않습니다.
5. Micromanipulator에 고정 하는 연필의 위치를 조정 하 고 신중 하 게 마이크로 팁 현미경 배율 x 400 미만 대상 myocyte 비전 필드의 반지름의 거리에서 장소.
6. 주로 대상 myocyte를 커버 하는 myocyte 수 없습니다 휩 쓸 바늘 흐름 확인을 바늘 스트림 범위 조정.
7. 후 60 s 기본 자극 커서를 롤, 속도 " d 2 단계 ".
   참고: 프로토콜의 나머지 자극 기 밸브 제어 시스템에 의해 자동으로 실행 될 것입니다. 위의 설정에 따라 프로토콜 수 자동으로 실행 될 그림 2A, 1 Hz 60 NT 솔루션으로 서 기본에서 s. 성 고 2 지연 일시 중지 s, 10mm 카페인 관류 15로 빠르게 전환 s (기능 SR에서 캘리포니아 ^{2 +} 스토리지 출시), 다음 NT 솔루션으로 다시 전환 하는 고.
8. 개별 myocytes의 배경 형광 검출 기록의 끝에. 클릭은 " 일시 중지 " 근처 빈 영역에 미세한 보기 이동 파일 녹음, 일시 정지 버튼. 클릭은 " 기록 " 초, 녹화 재개 버튼 및 숫자 340 및 380 nm 강도 값 배경 보정에 대 한 기록.
9. 오픈는 " 작업/정 "에 값을 입력 하 고 대화 상자는 " 배경 " 형성, 각각, 소프트웨어 백그라운드를 빼서 Fura 2 비율 값을 수정할 수 있습니다.

7. 데이터 분석 ⁹

1. 칼슘 과도 및 기본 서 성 단계에서 단축 sarcomere의 측정, 평균 트 위치 펄스, 고 칼슘 과도의 시간 상수 같은 동적 매개 변수 분석 칼슘 과도 감퇴 (타우 1 Hz) 자동으로 소프트웨어를 사용 하 여.
   참고: 소프트웨어 부패 세그먼트에 잘 맞지 않는, 수동 모노 지 수 곡선 맞춤에 대 한 감소 추적 내보냅니다.
2. 카페인 유발 칼슘 펄스에 대 한 칼슘 제거 기능 분석에 대 한 가파른 파도 펄스를 선택. 신호 방해, 비정상적인 펄스, 또는 멀리 미드웨이 흘러 그 셀 제외.
3. 카페인 유발 칼슘 펄스 (Ca-카페인, 미술관 ^{2 +} 예비에의 인덱스)의 진폭을 측정.
4. 모노 지 수 곡선 피팅 (10 s 내구) 수동으로 소프트웨어 ( 그림 2C)에서 카페인을 이용한 칼슘 펄스 (타우-카페인)의 붕괴 시간 상수 얻을.

Representative Results

여기, 우리가 설명 streptozotocin (STZ)-당뇨병 쥐 (DM)를 유도 및 나이 일치 Sprague-Dawley (SD) 쥐 예. 8 주 오래 된 남성 SD 쥐 (200 ± 20g) 컨트롤 그룹에 대 한 DM 그룹 또는 구 연산 염 버퍼 STZ (70 mg/kg, ip)의 단일 복 주사를 받았다. STZ 관리 후 1 주일 혈당과 쥐 > 16.7 mmol/L 당뇨병으로 간주 됐다. 8 주 후, LV myocytes 효소 격리 했다. 칼슘 reintroduction 후 myocytes 생존 상태에 남아 있는의 약 70-80%입니다. 막대 모양, 명확한 강선 및 안정적인 수축만 myocytes 기록 (그림 1B)에 대 한 선정 됐다. 그림 1A에서 같이, 우리 챔버 관류와 바늘 관류 myocytes에 대 한 설정 합니다. 관류 밸브 및 시스템 속도 자동으로 전환 되었다 미리 프로그램에 의해 그림 2A에 설명 된 대로. 세포내 칼슘 형광 칼슘 이미징 시스템에 의해 기록 되었다. 값은 평균 ± SEM.로 보고 되었다

SD 그룹에 비해, DM 그룹 카페인 유발 칼슘 펄스 (Ca-카페인)의 중요 한 낮은 진폭 보여준 (0.332 ± 0.008 vs. 0.276 ± 0.008, t-검정: p < 0.05)와 낮은 소수 칼슘 릴리스 SR (Ca 1 Hz / Ca-caffeine) (78.5 ± 1.5% 대 72.1 ± 1.0%, t-검정: p < 0.05) (그림 2B). 타우-1 Hz와 타우 카페인 모노 지 수 곡선 맞춤;에서 가져온 DM 그룹 보여준 놀라운 더 긴 감퇴 카페인 유발 칼슘 펄스 (타우-카페인)의 시간 상수 (1.822 ± 0.07 ms vs. 2.896 ± 0.088 ms, t-검정, p < 0.05), 그리고 타우 1 Hz/타우-카페인 비율 (0.076 ± 0.003 vs. 에서 더 높은 수준 0.086 ± 0.003, t-검정, p < 0.05) SD 그룹 (그림 2D) 보다. 이러한 결과 우울된 SR 캘리포니아^{2 +} 예비 표시 하 고 캘리포니아^{2 +} 클리어런스 당뇨병 cardiomyocytes에 장애인.

그림 1입니다. 관류 시스템 및 고립 된 LV myocytes 그림. (A) 챔버 관류와 연필 관류의 그림. 화살표는 관류 챔버에 NT 솔루션의 흐름 방향을 나타냅니다. 연필 관류를 NT 또는 카페인 솔루션 대상 myocyte 주변을 제공 합니다. 미크론 팁 챔버 위에 자유롭게 조작할 수 있습니다. (B)의 미세한 보기 막대 모양으로 LV myocytes를 격리 하 고 크로스 강선을 취소 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. SR 칼슘 보유 및 칼슘 제거 기능 평가. (A) 스위칭 관류 밸브 및 자동으로 시스템을 서 성 대 한 프로토콜의 그림. (B) 통계 값 SR 캘리포니아^{2 +} 예약 및 SR 소수 캘리포니아^{2 +} 의 출시 1 자극에 대 한 DM 및 SD 그룹 기. DM 그룹^{2 +} 예비 SR 소수 캘리포니아^{2 +} 릴리스 SD 그룹 보다 상당한 감소 SR Ca 보였다. (C) 소프트웨어 패널 카페인 유발 칼슘 펄스 (타우-카페인)의 지속적인 부패에 대 한 피팅 수동으로 모노 지 수 곡선을 보여주는. (D) 타우 카페인과 타우 1 Hz/타우-카페인 DM 및 SD 그룹 사이 비교 막대 그래프. DM 그룹 타우 카페인과 타우 1 Hz/타우-카페인 보다 SD 그룹의 중요 한 증가 값을 보여주었다. 값 = 평균 ± SEM, t-검정을 수행 했다, *p < 0.05 SD 그룹에 비해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

솔루션	내용 (mM)에
보통 Tyrode (NT) 솔루션	135 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 MgCl2, 10 포도 당, 10 HEPES, 1.2 나2HPO의4, 1.2 CaCl2, 7.35에 NaOH로 pH를 조정
캘리포니아2 + 무료 Tyrode 솔루션	135 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 MgCl2, 10 포도 당, 10 HEPES, 1.2 나2HPO4, 10 taurine 7.35에 NaOH로 pH를 조정
콜라 격리 솔루션	A 콜라 또는 콜라 II + 캘리포니아2 + 무료 Tyrode 솔루션
KB 솔루션	120 코, 120 L-글루타민, 5 MgCl2, 10 HEPEs, 1 EGTA, 10 포도 당, 20 Taurine pH 7.35 코와를 조정합니다
카페인 관류 솔루션	NT 솔루션에서 10 카페인

표 1입니다. LV myocytes 고립과 휴대 관류에 대 한 솔루션입니다.

밸브	시간 (초)
2	15
1	60

표 2입니다. 밸브 제어 시스템 (밸브 사령관)에 매개 변수를 미리.

패널 디스플레이	댓글
4.0 ms 기간	전기 자극 필드 시간
8.0 V	전기 전압
S1 1.0 HZ 999S	성 상태에서 대상 myocyte 찾기
D 2 001S	일시 중지 성에이 단계를 선택 하 고 기저 트 위치 기록 후 1s를 지연
D3 015S *	"*" 표시는 자극 5V TTL 신호를 출력할 수 있습니다
D4 060S	마침 카페인 관류와는 myocyte 정상 상태로 복구
끝	s 1 단계로 롤백

표 3입니다. 매개 변수는 자극에의 사전 설정 합니다.

Discussion

SR에서 발표 하는 칼슘 속은 systole에에서 대 한 주요 캘리포니아^{2 +} 소스입니다. 어느 정도, SR 캘리포니아^{2 +} 콘텐츠의 진폭 및 소수 Ca^{2 +} SR에서 발표 반영 SR Ca^{2 +} 예비 심장 수축에 사용할 수 있는. 다른 한편으로, SR의 Ca^{2 +} 예약에 따라 SR 캘리포니아^{2 +} 재흡수, SR의 캘리포니아^{2 +} 누출 그리고 그들의 균형의 능력 SR에 걸쳐 심장^12,,1314동안. 우리의 실험에서 10 mM 카페인의 신속한 응용 프로그램 총 캘리포니아^{2 +} 출시와 RyR 채널을 개방 하 여 SR에 캘리포니아^{2 +} 재흡수를 방지 유도 목적 이다. 따라서, 카페인 유발 Ca^{2 +} 펄스의 진폭 SR 캘리포니아^{2 +} 예약에 대 한 인덱스로 사용 될 수 있습니다. 또한, 기본 서 1 Hz에 3 Hz, 사용 우리 더 SR 부하와 그 기본 메커니즘⁶주파수 의존 조사할 수 있습니다.

캘리포니아^{2 +} 세포질에서 제거 심장 심장 확장 기능을 위해 중요 하다. 1 Hz 필드 자극의 단계에서 그림 2A와 같이 칼슘 과도의 쇠퇴에 있던, 그리고 느린 전송 시스템 (미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} uniporter 및 sarcolemmal Ca^{2 + SR에 SERCA, NCX에 기인 했다} -ATPase). 느린 메커니즘의 기여도 무시할 수, 캘리포니아^{2 +} 과도 (타우 1 Hz)의 붕괴 시간 상수 SERCA 및 NCX^7,,89의 결합 된 활동을 반영 합니다. 카페인 관류의 단계에서 SERCA SR 칼슘 보유를 구축 하지 못했습니다. 따라서, 카페인을 이용한 칼슘 펄스 (타우-카페인)의 감소는 주로 NCX에 기인 된다. 대응 하 게, NCX 함수 관련 타우-카페인으로 부정적 이다. 확장기 캘리포니아^{2 +} 제거 NCX 기여 타우 1 Hz/타우-카페인의 비율에 관련 된으로 긍정적 이다. SERCA 기여 타우 카페인과 타우 1 Hz^7,,89의 차이에 관련 된으로 긍정적 이다.

성공적으로 절차를 완료 하려면 (그림 2), 몇 가지 기술 키 포인트는 주목 해야 한다. 첫째, 자동화 시스템 구축 스위칭 속도 및 관류 시스템 정확 하 게 중요 하다. 미리 설정 된 프로그램 지연 시간 정확 하 고 빠르게 카페인 관류를 적용. 둘째, 과정에 myocytes 관류 솔루션에 의해 멀리 세척 되 고 위험에 있습니다. 유지는 myocytes 안정적 챔버 접시 준수, 셀 녹음 하기 전에 15 분 이상 접시에 배치 합니다.

또한, 카페인의 응용 프로그램에 대 한 안정적인 바늘 관류 시스템을 설정 하는 것은 또 다른 중요 한 단계입니다. 이 단계에 대 한 세 가지 핵심 포인트는: (1) 빠른 채널 스위치와 매끄러운 바늘 관류, (2) 잘 제어 관류 흐름 속도, 및 (3) 적절 한 바늘 끝 사이 거리 및 myocyte를 대상. 흐름 속도, 팁의 거리, 또는 간섭 솔루션 채널 스위치에서의 부적절 한 설정 허용 카페인 유발 칼슘 펄스를 획득의 실패 될 수 있습니다. 카페인을 이용한 칼슘 펄스, 칼슘 제거 기능 분석에 대 한 가파른 웨이브 크레스트와 펄스만 선택 수 있습니다.

패치 클램프 시스템에 따라 다른 방법을 상대적으로 정확한 데이터를 제공할 수 있습니다. 그러나, 내부 조정 K⁺ 전류, 등 몇 가지 요소 정확도 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 첨단된 장비, 숙련 된 기술자와 시간 소비의 높은 요구 사항 또한 패치 클램프의 응용 프로그램을 제한할 수 있습니다. 어느 정도 우리의 프로토콜 제한 SR 부하의 직접 값 또는 SERCA NCX의 활동을 제공 하지 수는 있습니다. 매개 변수 (예를 들어, 캘리포니아-카페인, 타우 카페인)만 반영 하지 변화 SR 콘텐츠 및 확장기 캘리포니아^{2 +} 제거에 기여 직접. 그러나,이 프로토콜 편의 기술 및 장비의 적은 제한의 이점이 있다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Alfa Aesar	012314
MgCl2	Alfa Aesar	012315
KCl	Alfa Aesar	11595
HEPEs	Sigma	H3375
D-Glucose	Alfa Aesar	A16828
NaOH	Alfa Aesar	A18395
KOH	Alfa Aesar	A18854
KH2PO4	Alfa Aesar	011594
MgSO4	Alfa Aesar	3337
L-Glutamic	Alfa Aesar	A15031
Taurine	Alfa Aesar	A12403
EGTA	Sigma	E3889
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	LS004177
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436