Summary
Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar sarcoplasmático Ca2 + reserva e função de remoção de cálcio diastólica em cardiomyocytes por um sistema de imagem de cálcio.
Abstract
Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Retículo sarcoplasmático cardíaco (SR) serve como um reservatório de Ca2 + para a contração, que reuptakes intracelular Ca2 + durante o relaxamento. A SR Ca2 + reserva disponível para batidas é determinante para contractibility cardíaca, e a remoção de intracelular Ca2 + é crítica para a função cardíaca diastólica. Sob algumas condições fisiopatológicas, tais como diabetes e insuficiência cardíaca, liberação de cálcio prejudicada e SR Ca2 + loja em cardiomyocytes podem estar envolvidos no progresso da disfunção cardíaca. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar SRCa2 + reserva e diastólica Ca2 + remoção. Brevemente, um único casos estava enzimaticamente isolado, e a intracelular Ca2 + fluorescência indicada pelo Fura-2 foi gravada por um sistema de imageamento de cálcio. Para empregar a cafeína para indução total SR Ca2 + lançamento, nós um programa de interruptor automático perfusão pré-estabelecido pela interligação do sistema de estimulação e sistema de perfusão. Em seguida, o encaixe de curva mono-exponencial foi usado para a análise de constantes de tempo de decaimento de pulsos de cálcio induzida por cafeína e transientes de cálcio. Nesse sentido, a contribuição do SR Ca2 +-ATPase (SERCA) e at+-Ca2 + trocador (NCX) para remoção de cálcio diastólica foi avaliada.
Introduction
Cálcio intracelular ([Ca2 +]eu) reciclagem desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes1. Como sabemos, induzida por cálcio Ca2 + versão inicia o acoplamento, excitação-contração que traduzir o sinal elétrico para a contração. Despolarização da membrana ativa mecanismos L-tipo Ca2 + canais, que induzem Ca2 + lançamento do SR para o citoplasma via receptores ryanodine 2 (RyR2). Os transientes elevados citoplasmática Ca2 + inicia a contração das miofibrilas. Durante a diástole, citoplasmática Ca2 + é reuptaken para o SR mediante o SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) e bombeado fora os casos atravésdo nd+-Ca 2 + trocador (NCX)2. Este processo leva a reciclagem nos casos de contração-relaxamento.
O SR cardíaca é uma rede intracelular da membrana que rodeia a maquinaria contrátil. Ele serve como um reservatório de Ca2 + para a contração, e ele reabsorve intracelular Ca2 + durante o relaxamento. A SR Ca2 + reserva disponível para batidas é determinante para a contratilidade cardíaca. Entretanto, a remoção do intracelular Ca2 + é crítica para a diástole cardíaca. Sob algumas condições fisiopatológicas, loja em cardiomyocytes como diabetes e insuficiência cardíaca, prejudicada Ca2 + desembaraço e deprimido SR Ca2 + pode estar envolvida no processo de disfunção cardíaca2,3 ,4.
Para medir o SR Ca2 + liberação e diastólica Ca2 + remoção em cardiomyocytes, existem duas abordagens amplamente utilizadas: a integridade da corrente NCX baseado no remendo-braçadeira5,6e o Ca induzida por cafeína 2 + pulso baseado no Ca2 + fluorescência de imagem7,8,9. A primeira abordagem depende do fato de que o Ca2 + libertado o SR é largamente bombeado fora da célula por NCX. No entanto, essa abordagem é limitada pela sua exigência de equipamento avançado e hábil operação. No presente estudo, descrevemos uma abordagem conveniente para avaliar SR Ca2 + reserva e Ca2 + remoção em miócitos medindo induzida por cafeína Ca2 + pulso com base em um Ca2 + fluorescência sistema de imagem. Brevemente, intracelular Ca2 + fluorescência é indicada pelo Fura-2. Pela interligação do sistema de estimulação e sistema de perfusão, apresentamos um programa para mudar a perfusão e automaticamente o sistema de estimulação. cafeína de 10 mM foi empregada para induzir rapidamente total Ca2 + lançamento no Sr. As constantes de tempo de decaimento exponencial (Tau) de pulsos de cálcio induzida por cafeína e transientes de cálcio foram obtidas de mono-exponencial curva de encaixe, que refletem a contribuição da SERCA e NCX para remoção de Ca2 + diastólica em conformidade.
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Protocol
todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comité de uso no centro de pesquisa Experimental, China Academy de chinês ciências médicas e Universidade de Zhejiang e institucional Cuidado Animal.
1. preparação da solução
- preparar todas as soluções, conforme descrito na tabela 1.
2. isolamento de esquerda Ventricular (LV) Cardiomyocytes
Nota: LV cardiomyocytes são isolados enzimaticamente usando um sistema de perfusão Langendroff como descrito anteriormente, 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
- Configurar o sistema de perfusão Langendroff. Encher o sistema de perfusão com solução de Tyrode Normal (NT), defina a temperatura de 36,5 ° c e eliminar quaisquer bolhas de ar no tubo.
- Pesar e anestesiar um rato Sprague-Dawley por injeção intraperitoneal (ip) de hidrato de cloral (400 mg/kg). Confirmar o estado anestésico através da avaliação da resposta de pitada de cauda ou dedo do pé após 5 min.
- Abrir a cavidade abdominal sob o apêndice xifoide com uma tesoura cirúrgica, levantar o processo xifoide e abra o baú com a tesoura. Remover o pericárdio, ligeiramente levantar o coração com pinça curvada, identificar o arco aórtico e cortou o coração pela tesoura da raiz da aorta.
- Transferir o coração para um prato de 60 mm e lavá-lo com solução de NT. Segure a aorta com duas pinças microdissecando, monte-a da cânula de perfusão de Langendorff e então firmemente ligate da aorta para a cânula usando suturas cirúrgicas.
Nota: Um operador hábil pode terminar este processo no prazo de 15 s. - Perfundir o coração com solução de 30ml NT para recuperar a circulação das artérias coronárias. Em seguida, alternar o perfusato para 30ml Ca 2 +-livre solução de Tyrode (10mm taurina, 1 mg/mL BSA) para parar o batimento cardíaco. Em seguida, alternar o perfusato para solução de isolamento de colagenase A (0,6 mg/mL) para a digestão enzimática.
Nota: Utilização. um colagenase, para experimentos com ratos diabéticos, ou colagenase II para experimentos sem ratos diabéticos. - Após digestão por 20-25 min, alterar rapidamente a solução de perfusão para o Ca 2 +-livre solução de Tyrode para parar mais a digestão. Em seguida, segurar o coração com fórceps, cortá-lo da cânula e colocar o coração em um prato de 35 mm, contendo solução KB (ver tabela 1).
- Dissecar a parede de LV com tesoura e pinça. Corte o átrio, o ventrículo direito e a área de junção atrioventricular. O tecido remanescente é o LV; transferi-lo para uma nova placa de 35 mm com solução KB. Picar o tecido LV em pedaços pequenos.
- Suavemente Pipetar as peças com um conta-gotas plástico filtrada e ressuspender em solução 10ml KB.
- Filtrar as células com 150 µm filtro de aço inoxidável de abertura e transferir para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 150 x g, durante 30 s e descartar o sobrenadante. Ressuspender os miócitos em solução 10ml KB, gratuito se contentar com 6 min, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em solução 10ml KB.
Nota: Todas as medidas foram realizadas a 36 ° C em soluções gaseadas com 100% O 2.
3. Reintrodução de cálcio
- depois de ter resolvido por 20 min em solução KB, desprezar o sobrenadante e ressuspender os miócitos com solução de reintrodução de cálcio A (0,3 mM Ca 2 +, 4,5 mL de Ca 2 +-livre solução de Tyrode, NT de 1,5 mL de solução) durante 10 min.
- Repita o procedimento acima com solução de reintrodução de cálcio B (0,3 mM Ca 2 +, 3 mL de Ca 2 +-livre solução de Tyrode, NT de 3 mL de solução).
- Repita o procedimento acima com solução NT (1.2 mM) Ca 2 + para purificar os miócitos disponíveis. Armazenar os miócitos LV isolados nesta solução e estudá-los dentro de 4-6 h.
4. Set Up de perfusão sistema
- conectar o tubo de entrada com a solução de NT para perfusão de câmara ( figura 1A).
- Para perfusão de agulha de miócito o alvo, ligue a Multi barril ponta múltipla (por exemplo, lápis de perfusão, doravante conhecido como lápis), fixado no micromanipulador, com a válvula controlada sistema de perfusão. Adicionar a solução de NT e solução de cafeína de 10 mM para cada coluna do lápis ( figura 1A).
- Evacuar quaisquer bolhas de ar nos tubos para evitar o bloqueio de ar.
- Contar o número de gotejamento da ponta micron do lápis para 10 s e manualmente ajustar o regulador de fluxo para manter a velocidade de fluxo a uma velocidade aproximada de 3 s. gotejamento/10
5. Medições de intracelular Ca 2 + transitório e encurtamento do sarcômero 7 , 8 , 9
- suspensão de células pipeta de 10 µ l do slide, contar o número de células por um contador de células sob o microscópio e calcular a densidade. Diluir miócitos para uma concentração aproximada de 50.000 células/mL.
- Adicionar o Fura-2 acetoximetil (AM) estoque (um corante sensível de cálcio) em uma suspensão de 1 mL de miócitos para trazer a concentração final de 2 µM. manter no escuro por 20 min em temperatura ambiente.
- Centrifugar 150g por 30 s e ressuspender o cardiomyocytes com solução NT 2 vezes.
- Turn off a luz e manter as células no escuro. Coloca os miócitos na câmara de perfusão por 15 min. Então comece a perfusão de câmara (1,5 mL/min) com solução de NT. Ritmo, os miócitos com estimulação de campo 1 Hz usando um estimulador (duração onda 4,0 ms, amplitude de pulso 8.0 V) 5 min.
- Selecione um miócito com boa forma (forma de haste, borda em ponto e limpar as estrias transversais) e contração muscular estimulada estável (nenhuma contração espontânea) sob o microscópica lente objetiva de 10x. Em seguida, alterar a ampliação microscópica de 40x e girar a orientação da câmera CCD para manter o miócito na posição horizontal.
- Frame o único miócito ajustando o adaptador de enquadramento de célula. Certifique-se de que o plano de fundo é claro.
- Expor os miócitos a luz emitida por uma lâmpada de xénon, com 340 ou 380 nm de comprimento de onda da excitação filtros e os miócitos através de um objectivo de 40 x da imagem. Detectar o sinal de fluorescência em 510 nm. Entretanto, observe as mudanças de comprimento do sarcômero dos miócitos e gravar usando o módulo de macio-borda simultaneamente.
- Registro de fluorescência por um sistema de photomultiplier dual-excitação da fluorescência. Execute o programa de gravação para o cálcio, sistema de imagem, clique em " arquivo/novo arquivo " para criar um novo arquivo de gravação e clique no " iniciar " botão para comprimento de fluorescência e sarcômero sincronicamente registro.
6. Avaliação do SR Ca 2 + reserva e diastólica Ca 2 + função de remoção de 7 , 8 , 9
- Interlink o " Aux Out " porto em o estimulador com o " analógico em " porto no sistema de controle de válvula (por exemplo, comandante da válvula, consulte Tabela de materiais) por um cabo BNC (para sincronizar o sinal TTL).
- Um programa para mudar as válvulas de perfusão automaticamente como descrito anteriormente 8 , 9; pré-estabelecido As etapas detalhadas para a operação são listadas como seguindo.
- Preset os parâmetros na válvula controlam de software de acordo com a tabela 2 e clique o " Download " o botão para baixar a sequência carregado no programa. Clique o " Trigger " botão para habilitar a função de gatilho.
Nota: O sistema de controle de válvula pode executar a sequência depois de receber sinal TTL. - Pré-ajuste o estimulador para o modo de sequência e definir os parâmetros conforme tabela 3.
- Preset os parâmetros na válvula controlam de software de acordo com a tabela 2 e clique o " Download " o botão para baixar a sequência carregado no programa. Clique o " Trigger " botão para habilitar a função de gatilho.
- Definir o estimulador em " passo S1 " ao ritmo do LV miócitos de 1 Hz. iniciar a perfusão de agulha na velocidade de 1,5 mL/min com solução NT.
Nota: Porque a velocidade do fluxo de agulha é mais rápido do que a perfusão de câmara, a refração de luz do fluxo de agulha é diferente da luz refração da perfusão de câmara. A diferença de refração de luz indica o intervalo de perfusão de agulha eficaz, que rodeia o alvo miócito. - Selecione um miócito alvo sob a visão microscópica de baixa potência (na sequência de jusante para montante), e certifique-se que pode ser alcançado pela micro ponta do lápis. Altere a ampliação do microscópio para 400 x. Gire a orientação da câmera CCD para manter o miócito na posição horizontal. Ajuste a abertura retangular sob o adaptador de enquadramento de célula para uma janela apropriada que enche os miócitos. Certifique-se de que não há fundo mínimo; Não permita que outros miócitos ou restos de células mortas nesta janela.
- Ajustar a posição do lápis fixada sobre o micromanipulador e cuidadosamente coloque a ponta micro à distância do raio de campo de visão para o miócito alvo menos de 400 x ampliação do microscópio.
- Ajustar o intervalo de fluxo de agulha para principalmente cobrir o alvo miócito e certifique-se de que o miócito não pode ser arrastado pelo fluxo agulha.
- Após 60 s básica de estimulação, role o cursor estimulador para o " D2 passo ".
Nota: O resto do protocolo será executado automaticamente pelo sistema de controle de válvula e estimulador. Com base na configuração acima, o protocolo pode ser executado automaticamente como Figura 2A, 1 Hz básica de estimulação com solução NT para 60 s. Então pausar o ritmo e atraso de 2 s, alternar rapidamente para perfusão de cafeína 10 mM por 15 s (para funcionalmente versão Ca 2 + armazenamento no SR) e em seguida, mudar novamente para solução NT. - No final da gravação, detectar a fluorescência de fundo para myocytes individuais. Clique o " pausa " botão para pausar a gravação, o arquivo mover a visualização microscópica de uma área em branco nas proximidades. Clique o " registro " o botão para retomar a gravação por segundos e gravar numérica 340 e 380 nm intensidade valores para correção de fundo.
- Aberto a " constante de operação/" caixa de diálogo e preencher os valores para o " fundo " formar, respectivamente, o software pode corrigir valores de proporção Fura 2 subtraindo-se o plano de fundo.
7. Análise de dados 9
- para medições de transientes de cálcio e sarcômero encurtamento na fase de estimulação básica, média os impulsos de contração muscular e em seguida analisar parâmetros dinâmicos, tais como transientes de cálcio, a constante de tempo decaimento de transiente de cálcio (Tau-1 Hz), usando o software automaticamente.
Nota: Se o software não encaixava bem no segmento de decadência, o rastreamento de declínio para o encaixe de curva mono-exponencial manual de exportação. - Para pulsos de cálcio induzida por cafeína, selecione apenas o pulso com uma onda íngreme para análise da função de remoção de cálcio. Excluir células com perturbação do sinal, pulso anormal ou aqueles que fluiu fora midway.
- Medir a amplitude do pulso induzida por cafeína cálcio (Ca-cafeína, um índice da SRCa 2 + reserva).
- Obter a constante de tempo de queda do pulso de cálcio induzida por cafeína (Tau-cafeína) por mono-exponencial curva encaixe (duração de 10 s) manualmente do software ( Figura 2).
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Representative Results
Aqui, ilustramos estreptozotocina (STZ) - induzida ratos diabéticos (DM) e idade-combinadas Sprague - Dawley (SD) ratos por exemplo. ratos machos de SD 8 semanas (200 ± 20 g) receberam uma única injeção intraperitoneal de STZ (70 mg/kg, ip) para o buffer de grupo ou citrato de DM para o grupo de controle. Uma semana após a administração de STZ, ratos com glicemia > 16.7 mmol/L foram considerados diabéticos. Depois de 8 semanas, os miócitos de LV foram enzimaticamente isolados. Após a reintrodução do cálcio, há cerca de 70-80% dos miócitos que permanecem no estado de sobrevivência. Miócitos único com uma haste em forma de estrias claras e estáveis contrações foram selecionados para gravar (figura 1B). Como mostrado na figura 1A, montamos a câmara perfusão e perfusão de agulha para myocytes. Válvulas de perfusão e sistema de estimulação foram trocados automaticamente por um programa predefinido, conforme descrito na Figura 2A. A fluorescência do cálcio intracelular foi gravada por um sistema de imagem de cálcio. Valores foram relatadas como média ± SEM.
Comparado com o grupo de SD, o grupo DM mostrou significativa menor amplitude do pulso induzida por cafeína cálcio (Ca-cafeína) (0,332 ± 0,008 vs. 0,276 ± 0,008, teste-t: p < 0,05) e uma baixa liberação de cálcio fracionário SR (Ca-1 Hz / CA-Caffeine) (78.5 ± 1,5% vs 72,1 ± 1,0%, t-teste: p < 0,05) (Figura 2B). O Tau-1 Hz e Tau-cafeína foram obtidos de mono-exponencial curva encaixe; o grupo DM mostrou notável decadência mais constantes de tempo de pulso de cálcio induzida por cafeína (Tau-cafeína) (1,822 ± 0,07 ms vs. 2.896 ± 0,088 ms, teste t, p < 0.05) e um nível mais elevado rácio de Tau-1 Hz/Tau-cafeína (0,076 ± 0,003 vs. 0,086 ± 0,003, teste t, p < 0,05) do que o grupo SD (Figura 2D). Estes resultados indicaram a deprimido SR Ca2 + reserva e debilitada Ca2 + folga em diabéticos cardiomyocytes.
Figura 1. Ilustração do sistema de perfusão e miócitos isolados de LV. (A) ilustração da perfusão de câmara e perfusão de lápis. As setas indicam a direção do fluxo da solução NT na câmara de perfusão. O lápis fornece perfusão cercam o miócito alvo com solução NT ou cafeína. A ponta do mícron pode ser manipulada livremente acima da câmara. (B) Visão microscópica de isolado LV miócitos com uma haste em forma e limpar as estrias transversais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Avaliação da função de remoção SR cálcio reserva e cálcio. (A) ilustração do protocolo para o switching válvulas de perfusão e automaticamente o sistema de estimulação. Estatística (B) valores de SR Ca2 + reserva e SR fracionário Ca2 + liberar para 1 Hz estimulada se mexer nos grupos DM e SD. O grupo DM mostrou diminuição significativa SR Ca2 + reserva e SR fracionário Ca2 + lançamento do que o grupo de SD. (C) painel de Software mostrando um encaixe para o tempo de decaimento de curva manualmente mono-exponencial constante de pulso de cálcio induzida por cafeína (Tau-cafeína). (D) barra de gráficos comparando a cafeína-Tau e Tau-1 Hz/Tau-cafeína entre os grupos DM e SD. O grupo DM apresentaram valores de aumento significativos de cafeína-Tau e Tau-1 Hz/Tau-cafeína do que o grupo de SD. Valor = média ± SEM, realizaram-se o teste t, *p < 0.05 comparado com o grupo de SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Soluções | Conteúdo (em mM) |
| Solução de Tyrode normal (NT) | NaCl 135, 5.4 KCl, 1.2 MgCl2, glicose 10, 10 HEPES, 1.2 Na2HPO4, 1.2 CaCl2, ajustar o pH com NaOH a 7,35 |
| CA2 + livre solução de Tyrode | NaCl 135, 5.4 KCl, 1.2 MgCl2, glicose 10, 10 HEPES, 1.2 Na2HPO4, 10, taurina, ajustar o pH com NaOH a 7,35 |
| Solução de isolamento de colagenase | Colagenase A ou colagenase II + Ca2 + livre solução de Tyrode |
| Solução KB | KOH 120 120 L-glutâmico, MgCl2 5, 10 HEPEs, 1 EGTA, glicose 10, 20, taurina, ajustar o pH a 7,35 com KOH |
| Solução de perfusão de cafeína | 10 cafeína em solução NT |
Tabela 1. Soluções para perfusão de isolamento e celular de miócitos LV.
| Válvula | Tempo (segundo) |
| 2 | 15 |
| 1 | 60 |
Tabela 2. Pré-ajuste de parâmetros no sistema de controle de válvula (comandante da válvula).
| Visor do painel | Comentário |
| Duração 4,0 ms | tempo de estimulação elétrica campo |
| 8.0 V | tensão elétrica |
| S1 1,0 HZ 999S | encontrar o miócito alvo no estatuto de estimulação |
| D2 001S | Selecione este passo ao ritmo de pausa e demora 1s após gravação de contração basal |
| D3 015S * | "*" indicam que o estimulador pode output um sinal TTL 5V |
| D4 060S | perfusão de cafeína de acabamento e o miócito voltar ao estado normal |
| FINAL | reversão para a etapa de S1 |
Tabela 3. Preset de parâmetros no estimulador.
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Discussion
Fluxo de cálcio libertado o SR é a principal fonte de Ca2 + para sístole no coração. Em certa medida, a amplitude do SR Ca2 + conteúdo e o fracionário Ca2 + libertado o SR refletir SR Ca2 + reserva disponível para a contração cardíaca. Por outro lado, a Ca2 + reserva de SR depende da capacidade de recaptação de SR Ca2 + , Ca2 + vazamento de SR e seu equilíbrio através do SR durante a diástole12,13,14. Na nossa experiência, destina-se a aplicação rápida de cafeína de 10 mM para induzir total Ca2 + lançamento e prevenir Ca2 + recaptação no SR, abrindo o canal RyR. Assim, a amplitude do induzida por cafeína Ca2 + pulso pode ser usada como um índice da reserva de SR Ca2 + . Além disso, com base andava em 1 Hz e 3 Hz, nós poderia investigar a frequência-dependência da carga de SR e seu subjacente mecanismo6.
Remoção de Ca2 + no citoplasma é crítica para a função cardíaca diastólica. Como mostrado na Figura 2A, a fase de estimulação de campo de 1 Hz, o declínio dos transientes de cálcio foi atribuído a SERCA no SR, NCX no cytomembrane e sistemas de transporte lento (Ca2 + uniporter mitocondrial e mecanismos Ca2 + -ATPase). Como a contribuição dos mecanismos lentos é negligenciável, a constante de tempo de queda de Ca2 + transitório (Tau-1 Hz) reflete a atividade combinada de SERCA e NCX7,8,9. Na fase de perfusão de cafeína, SERCA falha ao construir a reserva de cálcio do SR. Assim, o declínio do pulso de cálcio induzida por cafeína (Tau-cafeína) foi principalmente atribuído a NCX. Correspondentemente, a função NCX é negativa como relevante para Tau-cafeína. A contribuição de NCX para remoção de Ca2 + diastólica é positiva como relevante para a relação de Tau-1 Hz/Tau-cafeína. A contribuição de SERCA é positiva como relevante para a diferença entre cafeína-Tau e Tau-1 Hz7,8,9.
Para concluir o procedimento com sucesso (Figura 2), existem alguns pontos-chave técnicos que devem ser observados. Em primeiro lugar, estabelecer um sistema automatizado é crítico para o sistema de estimulação e perfusão de comutação precisamente. O programa predefinido pode controlar o tempo de atraso com precisão e aplicar a perfusão de cafeína rapidamente. Em segundo lugar, durante o processo, os miócitos estão correndo o risco de ser lavada pela solução de perfusão. Para manter que os miócitos estàvel aderiram ao prato de câmara, as células devem ser colocadas no prato por mais de 15 minutos antes da gravação.
Além disso, criar um sistema de perfusão estáveis de agulha para aplicação de cafeína é mais um passo crítico. Existem três pontos-chave para esta etapa: interruptor de canal (1) rápida e suave agulha perfusão, velocidade do fluxo de perfusão (2) bem controlados e adequada (3) a distância entre a ponta da agulha e alvo miócito. Configuração inadequada da velocidade de fluxo, distância de ponta ou interferência no interruptor de canal de solução pode resultar em falha de adquirir um pulso aceitável de cálcio induzida por cafeína. Para pulsos de cálcio induzida por cafeína, apenas o pulso com uma crista de onda íngreme poderia ser selecionado para análise da função de remoção de cálcio.
O método alternativo baseado no sistema da remendo-braçadeira pode fornecer dados relativamente precisos. No entanto, alguns fatores, tais como aperfeiçoamento activo-retificando corrente K+ , podem influenciar a precisão. Além disso, uma exigência maior de equipamento avançado, técnico especializado e consumo de tempo também pode limitar a aplicação de patch-clamp. Em certa medida, o nosso protocolo tem a limitação de que não poderia fornecer valores diretos da carga SR ou atividade de SERCA e NCX. Os parâmetros (por exemplo, Ca-cafeína, Tau-cafeína) apenas refletem mudança SR conteúdo e contribuição para a remoção de Ca2 + diastólica indiretamente. No entanto, este protocolo tem a vantagem da conveniência, menos limitação da técnica e equipamento.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), a medicina e saúde ciência programa da província de Zhejiang (n. º 201646246, Dongwu Lai) e a ciência de saúde e Plano de tecnologia da cidade de Hangzhou (n. º 2013A28, Ding Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Alfa Aesar | 012314 | |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 012315 | |
| KCl | Alfa Aesar | 11595 | |
| HEPEs | Sigma | H3375 | |
| D-Glucose | Alfa Aesar | A16828 | |
| NaOH | Alfa Aesar | A18395 | |
| KOH | Alfa Aesar | A18854 | |
| KH2PO4 | Alfa Aesar | 011594 | |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 3337 | |
| L-Glutamic | Alfa Aesar | A15031 | |
| Taurine | Alfa Aesar | A12403 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
| BSA | Roche | 735094 | |
| caffeine | Sigma | C0750 | |
| Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
| Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
| Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
| Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
| Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
| valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
| Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
| Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
| Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
| Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
| Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |
References
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