Summary
Intracellulær kalsium resirkulering spiller en avgjørende rolle i regulering av systolisk og diastolisk funksjon i cardiomyocytes. Her beskriver vi en protokoll for å evaluere sarcoplasmic retikulum Ca2 + reserve og diastolisk kalsium fjerning funksjon i cardiomyocytes av en kalsium tenkelig system.
Abstract
Intracellulær kalsium resirkulering spiller en avgjørende rolle i regulering av systolisk og diastolisk funksjon i cardiomyocytes. CARDIAC sarcoplasmic retikulum (SR) fungerer som en Ca2 + reservoar for kontraksjon, som reuptakes intracellulær Ca2 + under avslapning. SR Ca2 + reserve tilgjengelig for beats er determinate for hjerte contractibility fjerning av intracellulær Ca2 + er avgjørende for diastolisk hjertefunksjon. Under noen patofysiologiske forhold som diabetes og hjertesvikt, kan svekket kalsium minerydding og SR Ca2 + butikken i cardiomyocytes være involvert i utviklingen av cardiac dysfunksjon. Her beskriver vi en protokoll for å evaluere SRCa2 + reserve og diastolisk Ca2 + fjerning. Kort, en enkelt cardiomyocyte ble enzymatisk isolert, og intracellulær Ca2 + fluorescens angitt av Fura-2 ble spilt av en kalsium tenkelig system. For å ansette koffein for å indusere totale SR Ca2 + utgivelsen, forhåndsinnstilt vi et automatisk perfusjon bytte program av lenker stimulering systemet og perfusjon systemet. Deretter ble mono-eksponentiell kurve montering brukt for å analysere forfall tid konstantene av kalsium transienter og koffein-indusert kalsium pulser. Følgelig bidrag av SR Ca2 +-ATPase (SERCA) og Na+-Ca2 + exchanger (NCX) til diastolisk kalsium fjerning ble evaluert.
Introduction
Intracellulær kalsium ([Ca2 +]jeg) resirkulering spiller en avgjørende rolle i regulering av systolisk og diastolisk funksjon i cardiomyocytes1. Som vi vet, starter kalsium-indusert Ca2 + utgivelsen eksitasjon-sammentrekning kopling, som oversetter elektrisk signal til sammentrekning. Membran depolarization aktiverer sarcolemmal L-type Ca2 + kanaler, som induserer Ca2 + slippe fra SR i cytoplasma via ryanodine reseptorer 2 (RyR2). Det forbigående opphøyet cytoplasmatiske Ca2 + starter sammentrekning av myofibrils. Under diastolen, cytoplasmatiske Ca2 + er reuptaken i SR med SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) og pumpet ut av cardiomyocyte via de Na+-Ca2 + exchanger (NCX)2. Denne prosessen fører til sammentrekning-avslapping resirkulering i cardiomyocyte.
Cardiac SR er en intracellulær membran nettverk som omgir kontraktile maskiner. Det fungerer som en Ca2 + reservoar for sammentrekning, og det reabsorbs intracellulær Ca2 + under avslapning. SR Ca2 + reserve tilgjengelig for beats er determinate for cardiac contractility. I mellomtiden, fjerning av intracellulær Ca2 + er avgjørende for cardiac diastolen. Under noen patofysiologiske forhold som diabetes og hjertesvikt, svekket Ca2 + klarering og deprimert SR Ca2 + kan butikken i cardiomyocytes være involvert i ferd med hjerte dysfunksjon2,3 ,4.
For å måle SR Ca2 + utgivelsen og diastolisk Ca2 + fjerning i cardiomyocytes, det er to brukte tilnærminger: integriteten til NCX gjeldende basert på patch-klemme5,6, og koffein-indusert Ca 2 + puls basert på Ca2 + fluorescens tenkelig7,8,9. Den tidligere tilnærmingen er avhengig av det faktum at den Ca2 + løslatt fra SR hovedsakelig pumpes ut av cellen ved NCX. Men er denne tilnærmingen begrenset av sitt krav av avansert utstyr og dyktigste drift. I studien beskriver vi en praktisk tilnærming for å vurdere SR Ca2 + reserve og Ca2 + fjerning i myocytter ved å måle en koffein-indusert Ca2 + puls basert på en Ca2 + fluorescens tenkelig system. Kort, intracellulær Ca2 + fluorescens angis av Fura-2. Av lenker stimulering systemene og perfusjonsmåling, presenterer vi et program for bytte av perfusjon og pacing systemet automatisk. 10 mM koffein var ansatt å indusere raskt totalt Ca2 + utgivelse i SR. Eksponensiell decay tid konstantene (Tau) i kalsium transienter og koffein-indusert kalsium pulser ble innhentet fra mono-eksponentiell kurve passende, som gjenspeiler bidrag av SERCA og NCX til diastolisk Ca2 + fjerning tilsvarende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle dyreforsøk ble utført i henhold til protokoller godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen på eksperimentell forskningssenter, Kina kinesisk medisinsk vitenskapsakademi og Zhejiang University.
1. løsning forberedelse
- forberede alle løsninger som beskrevet i tabell 1.
2. isolering av venstre ventrikkel (LV) Cardiomyocytes
Merk: LV cardiomyocytes er isolert enzymatisk bruker Langendroff perfusjon system som beskrevet tidligere 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
- Sett opp Langendroff perfusjon systemet. Fylle perfusjon systemet med Normal Tyrode (NT) løsning, angi temperaturen på 36,5 ° C og eliminere eventuelle luftbobler i røret.
- Veier og bedøve rotte Sprague-Dawley ved intraperitoneal injeksjon (ip) av chloral hydrat (400 mg/kg). Bekrefte bedøvende status ved å evaluere hale eller toe knipe svar etter 5 min.
- Åpne bukhulen under xiphoid prosessen med en kirurgisk saks, løft xiphoid prosessen, og åpne brystet med saks. Fjerne pericardium, litt løft hjertet med buet tang, identifisere aortabuen og avskåret hjertet av saks fra roten av aorta.
- Overføre hjertet til en 60 mm rett og vask det med NT løsning. Hold aorta med to mikro-dissekere tang, og montere den på Langendorff perfusjon kanyle, og deretter fast ligate aorta på kanyle med kirurgisk suturer.
Merk: En erfaren operatør kan fullføre denne prosessen innen 15 s. - Perfuse hjertet med 30 mL NT løsning for å gjenopprette sirkulasjon av koronar arteriene. Deretter bytter du til perfusate til 30 mL Ca 2 +-ledig Tyrode løsning (10 mM Taurine, 1 mg/mL BSA) for å stoppe hjerterytme. Bytt til perfusate til Collagenase A isolasjon løsning (0.6 mg/mL) for enzym fordøyelsen.
Merk: Bruk Collagenase A for eksperimenter med diabetiker rotter, eller Collagenase II for eksperimenter uten diabetiker rotter. - Etter fordøyelsen i 20-25 minutter, raskt endre perfusjon løsningen til Ca 2 +-ledig Tyrode løsning for å stoppe videre fordøyelsen. Deretter holder hjertet med tang, avskåret fra kanyle og plassere hjertet i en 35 mm rett som inneholder KB løsning (se tabell 1).
- Dissekere LV veggen med saks og tang. Avskåret atrium, høyre ventrikkel og atrioventrikulær krysset området. Gjenværende vevet er LV; overføre den til en ny 35 mm rett med KB løsning. Hakke LV vevet i små biter.
- Forsiktig Pipetter bitene med en filtrert plast dropper, og å suspendere i 10 mL KB løsning.
- Filtrerer cellene med 150 µm blenderåpning rustfritt stål filter og overføring til en 15 mL sentrifuge rør. Sentrifuge 150 x g for 30 s og Forkast nedbryting. Nytt suspendere myocytter i 10 mL KB løsning, gratis nøy 6 min, forkaste nedbryting, og å suspendere pellet i 10 mL KB løsning.
Merk: Alle skritt ble utført på 36 ° C i løsninger gasset med 100% O 2.
3. Kalsium gjeninnføring
- etter at etter 20 min i KB løsning, forkaste nedbryting, og å suspendere myocytter med kalsium gjeninnføring løsning A (0,3 mM Ca 2 +, 4,5 mL Ca 2 +-gratis Tyrode løsning, 1,5 mL NT løsning) for 10 min.
- Gjenta den ovenstående prosedyren med kalsium gjeninnføring løsning B (0,3 mM Ca 2 +, 3 mL Ca 2 +-gratis Tyrode løsning, 3 mL NT løsning).
- Gjenta den ovenstående prosedyren med NT løsning (1,2 mM Ca 2 +) å rense den tilgjengelige myocytter. Lagre den isolerte LV myocytter i denne løsningen og studere dem i 4-6 h.
4. Sette opp av perfusjon System
- Koble tilsig røret med NT løsning for kammer perfusjon ( figur 1A).
- Nål perfusjon av målet myocyte, koble flere fat manifold spissen (f.eks, perfusjon blyant, referert til som blyant heretter), fast i micromanipulator, til ventilen kontrollert perfusjon systemet. Legge til NT løsning og 10 mM koffein løsning i hver kolonne av blyanten ( figur 1A).
- Evakuere noen luftbobler i rør for å unngå luft blokkering.
- Antall dryppe fra mikron spissen blyanten for 10 s, og manuelt justere flyt regulator for å holde siden strømmen fart på en omtrentlig hastighet av 3 drypp/10 s.
5. Målinger av intracellulær Ca 2 + forbigående og Sarcomere forkorte 7 , 8 , 9
- Pipette 10 µL celle suspensjon på lysbildet teller cellen tallene av en celle teller under mikroskopet, og beregne tettheten. Fortynn myocytter til en omtrentlig konsentrasjonen av 50.000 cellen/mL.
- Legg til Fura-2 acetoxymethyl (AM) lager (en kalsium følsom fargestoff) til en 1 mL suspensjon av myocytter å ta den endelige konsentrasjonen 2 µM. holde i mørket 20 min ved romtemperatur.
- Sentrifuge 150 g for 30 s, og å suspendere cardiomyocytes NT løsning 2 ganger.
- Slå av lyset og holde cellene i mørket. Plasser myocytter i perfusjon kammeret i 15 min. Start kammer perfusjon (1,5 mL/min) med NT løsning. Farten på myocytter med 1 Hz feltet stimulering bruke en stimulator (bølge varighet 4.0 ms, puls amplitude 8.0 V) i 5 min.
- Velg en myocyte med god form (rod form, skarp kant og fjerne kors-striations) og stabil stimulert twitch (ingen spontan sammentrekning) under 10 x mikroskopiske linsen. Deretter endre mikroskopiske forstørrelsen til 40 x og rotere CCD kameraet retning for å holde myocyte i vannrett stilling.
- Ramme de eneste myocyte ved å justere celle innramming kortet. Kontroller at bakgrunnen er klart.
- Avsløre myocytter lys fra en Xenon-lampe, med 340 eller 380 nm wavelength eksitasjon filtre, og image myocytter gjennom en 40 x målsetting. Gjenkjenne fluorescens på 510 nm. I mellomtiden oppmerksom sarcomere lengde endringene av myocytter og spille bruke modulen bløt-kant samtidig.
- Post fluorescens av dual-eksitasjon fluorescens photomultiplier. Kjøre opptak kalsium tenkelig system, klikker du "/ny fil " opprette en ny opptaksfil, og klikk den " start " knappen synkront posten fluorescens og sarcomere lengde.
6. Vurdering av SR Ca 2 + Reserve og diastolisk Ca 2 + fjerning funksjon 7 , 8 , 9
- Interlink den " Aux ut " port i stimulator med den " Analog i " porten på ventilen kontrollsystemet (f.eks ventil kommandant, se Tabellen for materiale) med BNC kabel (for å synkronisere TTL signalet).
- Allerede et program for å bytte perfusjon ventilene automatisk som beskrevet tidligere 8 , 9; Detaljert fremgangsmåte for operasjonen er oppført som følgende.
- Forhåndsinnstilte parameterne i ventilen styre programvare som tabell 2, og klikk på " nedlasting " knapp å dataoverføre sekvensen lastet i programmet. Klikk på " Triggeh " knappen for å aktivere funksjonen utløser.
Merk: Ventil kontrollsystemet kan kjøre sekvensen etter mottar TTL signal. - Stimulator sekvens modus og angir parameterne som tabell 3.
- Forhåndsinnstilte parameterne i ventilen styre programvare som tabell 2, og klikk på " nedlasting " knapp å dataoverføre sekvensen lastet i programmet. Klikk på " Triggeh " knappen for å aktivere funksjonen utløser.
- Satt stimulator på " S1 trinn " tempo LV myocytter ved 1 Hz. Start nål perfusjon hastighet på 1,5 mL/min NT løsning.
Merk: Fordi hastigheten av nålen er raskere enn kammer perfusjon, lys refraksjonen som oppstår av nålen er forskjellig fra lyset refraksjonen som oppstår kammer perfusjon. Forskjellen lett begravet angir utvalget effektiv nål perfusjon, som omgir målet myocyte. - Velg en målet myocyte under visningen strømsparingsmodus mikroskopiske (i rekkefølgen av nedstrøms til oppstrøms), og sørg for at det kan nås av mikro spissen av blyanten. Endre mikroskop forstørrelse til 400 x. Rotere CCD kameraet retning for å holde myocyte i horisontal posisjon. Justere den rektangulære åpningen under cellen innramming kortet til et egnet som fyller med myocytter. Kontroller at det er minimal bakgrunn; ikke Tillat andre myocytter eller død celle rusk i dette vinduet.
- Juster plasseringen av blyanten fast på micromanipulator og forsiktig plassere mikro på avstand av radius visjon feltet målet myocyte under 400 x mikroskop forstørrelse.
- Justere nål strømmen hovedsakelig dekker målet myocyte og sørge for at myocyte ikke bli blåst bort av nålen flyten.
- Etter 60 s grunnleggende pacing, rulle stimulator markøren til den " D2 trinn ".
Merk: Resten av protokollen kjøres automatisk av stimulator og ventil kontrollsystem. Basert på innstillingen ovenfor, protokollen kan utføres automatisk som i figur 2A, 1 Hz grunnleggende pacing NT løsning for 60 s. Stans pacing og forsinkelsen for 2 s, raskt bytte til 10 mM koffein perfusjon 15 s (å funksjonelt løslate Ca 2 + lagring i SR), og deretter gå tilbake til NT løsning. - På slutten av innspillingen, oppdage bakgrunn fluorescens for individuelle myocytter. Klikk på " pause " knappen pause filen opptak, flytte visningen mikroskopiske til et nærliggende tomt område. Klikk i " posten " knappen for å starte innspillingen i sekunder, og spille inn numeriske 340 og 380 nm intensitetsverdiene for bakgrunnen korreksjon.
- Åpen det " operasjon/konstant " dialogboksen og fylle verdiene i den " bakgrunn " form, henholdsvis; programvaren kan rette Fura 2 forholdet verdier ved å trekke bakgrunnen.
7. Data analyse 9
- For målinger av kalsium transienter og sarcomere forkortelsen på grunnleggende pacing scenen, gjennomsnittlig twitch pulser, og deretter analysere dynamiske parametre, som kalsium transienter, tiden konstant av kalsium forbigående forfall (Tau-1 Hz), bruke programvaren automatisk.
Merk: Hvis programvaren ikke passer forfall segmentet Vel, eksportere nedgang spor for manuell mono-eksponentiell kurve montering. - For koffein-indusert kalsium pulser, velger du bare pulsen med en bratt bølge for analyse av kalsium fjerning funksjon. Utelater celler med signal forstyrrelser, unormal puls, eller de ledet bort midway.
- Mål for amplituden i byens koffein-indusert kalsium (Ca-koffein, en indeks av SRCa 2 + reserve).
- Få nedbrytning tiden konstant av koffein-indusert kalsium puls (Tau-koffein) av mono-eksponentiell kurve utrustning (varighet 10 s) manuelt fra programvare ( figur 2C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her vi illustrerer streptozotocin (STZ) - indusert diabetiker rotter (DM) og alder-matchet Sprague - Dawley (SD) rotter for eksempel. 8-uke-gamle SD hannrotter (200 ± 20 g) fikk en enkelt intraperitoneal injeksjon av STZ (70 mg/kg, ip) for DM gruppe eller citrate bufferen for kontrollgruppen. En uke etter administrasjon av STZ rotter med blodsukker > 16,7 mmol/L ble betraktet som diabetiker. Etter 8 uker var LV myocytter enzymatisk isolert. Etter kalsium gjeninnføring er ca 70-80% av myocytter som forblir i den overlevelse tilstanden. Bare myocytter med en stang-form, klart striations og stabil sammentrekninger ble valgt for opptak (figur 1B). Som vist i figur 1A, satt vi opp kammer perfusjon og nål perfusjon for myocytter. Perfusjon ventiler og pacing systemet ble automatisk slått av et forhåndsinnstilt program som beskrevet i figur 2A. Intracellulær kalsium fluorescens ble spilt av en kalsium tenkelig system. Verdiene ble rapportert som gjennomsnittlig ± SEM.
Sammenlignet med gruppen SD, DM gruppen viste signifikant lavere amplituden av koffein-indusert kalsium pulsen (Ca-koffein) (0.332 ± 0.008 vs. 0.276 ± 0.008, t-test: p < 0,05) og en lavere brøk kalsium utgivelse SR (Ca-1 Hz / Ca-Caffeine) (78,5 ± 1,5% vs 72.1 ± 1,0%, t-test: p < 0,05) (figur 2B). Tau-1 Hz og Tau-koffein var oppnådd fra mono-eksponentiell kurve passer; DM gruppen viste bemerkelsesverdig lengre forfall tid konstantene av koffein-indusert kalsium puls (Tau-koffein) (1.822 ± 0,07 ms vs. 2.896 ± 0.088 ms, t-test, p < 0,05), og et høyere nivå i Tau-1 Hz/Tau-koffein forholdet (0.076 ± 0.003 vs. 0.086 ± 0.003, t-test, p < 0,05) enn gruppen SD (figur 2D). Disse resultatene indikerer deprimert SR Ca2 + reserve og svekket Ca2 + klarering i diabetiker cardiomyocytes.
Figur 1. Illustrasjon av perfusjon system og isolert LV myocytter. (A) illustrasjon av kammeret perfusjon og blyant perfusjon. Pilene angir flytretningen for NT løsningen i perfusjon kammeret. Blyanten gir perfusjon rundt målet myocyte NT eller koffein løsning. Micron spissen kan manipuleres fritt over kammeret. (B) Microscopic utsikt av isolert LV myocytter med en stang-form og Fjern krysset striations. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Vurdering av SR kalsium reserve og kalsium fjerning funksjon. (A) illustrasjon av protokollen for bytte perfusjon ventiler og pacing systemet automatisk. (B) flygninger verdiene for SR Ca2 + reserve og SR brøk Ca2 + utgivelsen for 1 Hz stimulert rykninger i DM og SD grupper. DM gruppen viste signifikant redusert SR Ca2 + reserve og SR brøk Ca2 + versjon enn gruppen SD. (C) programvare-panelet viser et manuelt mono-eksponentiell kurve passer for nedbrytning tiden konstant av koffein-indusert kalsium puls (Tau-koffein). (D) søylediagrammer sammenligne Tau-koffein og Tau-1 Hz/Tau-koffein mellom DM og SD. DM gruppen viste betydelig økt verdier av Tau-koffein og Tau-1 Hz/Tau-koffein enn gruppen SD. Verdi = gjennomsnittlig ± SEM, t-test ble utført, *p < 0,05 sammenlignet med gruppen SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Løsninger | Innholdet (i mM) |
| Normal Tyrode (NT) løsning | 135 NaCl, 5.4 KCl, 1,2 MgCl2, 10 glukose, 10 HEPES, 1,2 Na2HPO4, 1,2 CaCl2, justere pH med NaOH til 7.35 |
| Ca2 + ledig Tyrode løsning | 135 NaCl, 5.4 KCl, 1,2 MgCl2, 10 glukose, 10 HEPES, 1,2 Na2HPO4, 10 taurine, justere pH med NaOH til 7.35 |
| Collagenase isolasjon løsning | Collagenase A eller Collagenase II + Ca2 + ledig Tyrode løsning |
| KB løsning | 120 KOH, 120 L-Glutamic, 5 MgCl2, 10 HEPEs, 1 EGTA, 10 glukose, 20 Taurine, justere pH til 7.35 med KOH |
| Koffein perfusjon løsning | 10 koffein i NT løsning |
Tabell 1. Løsninger for LV myocytter isolasjon og cellular perfusjon.
| Ventil | Tid (andre) |
| 2 | 15 |
| 1 | 60 |
Tabell 2. Forhåndsinnstilling av parametere i ventil control system (valve commander).
| Skjermen | kommentar |
| 4.0 ms varighet | elektrisk stimulering feltet tid |
| 8.0 V | elektrisk spenning |
| S1 1.0 HZ 999S | Finn mål myocyte på pacing status |
| D2 001S | Velg dette trinnet til pause pacing og forsinke 1s etter basale twitch opptak |
| D3 015S * | "*" angir at stimulator kan generere en 5V TTL signal |
| D4 060S | Fullfør koffein perfusjon og myocyte gjenopprette til normal tilstand |
| SLUTTEN | tilbakeføring til S1 trinn |
Tabell 3. Forhåndsinnstilling av parametere i stimulator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalsium er fra SR store Ca2 + kilden for Systolen i hjertet. Til en viss grad, amplituden til SR Ca2 + innhold og brøk Ca gjenspeiler2 + løslatt fra SR SR Ca2 + reserve tilgjengelig for cardiac sammentrekning. På den annen side, avhengig Ca2 + reserve av SR av evnen til SR Ca2 + reopptak, Ca2 + lekkasje av SR og deres balanse over SR under diastolen12,13,14. I vårt eksperiment, er hurtige anvendelse av 10 mM koffein rettet å indusere totalt Ca2 + slipp og hindre Ca2 + reopptak i SR ved å åpne RyR kanalen. Dermed kan amplituden til koffein-indusert Ca2 + pulsen brukes som en indeks av SR Ca2 + reserve. I tillegg med grunnleggende pacing i 1 Hz og 3 Hz, kan vi undersøke nærmere frekvens-avhengigheten av SR belastning og dens underliggende mekanismen6.
Fjerning av Ca2 + i cytoplasma er avgjørende for diastolisk hjertefunksjon. Som vist i figur 2A, på scenen i 1 Hz feltet stimulering, var nedgangen av kalsium transienter knyttet til SERCA i SR, NCX i cytomembrane og langsom transportsystemer (mitokondrie Ca2 + uniporter og sarcolemmal Ca2 + -ATPase). Bidrag av langsom mekanismer er ubetydelig, gjenspeiler nedbrytning tiden konstant av Ca2 + forbigående (Tau-1 Hz) kombinert aktiviteten til SERCA og NCX7,8,9. På scenen av koffein perfusjon kunne SERCA bygge SR kalsium reservatet. Dermed var nedgangen av koffein-indusert kalsium puls (Tau-koffein) hovedsakelig knyttet til NCX. Tilsvarende er NCX funksjonen negativ som gjelder for Tau-koffein. NCX bidrag til diastolisk Ca2 + fjerning er positivt som er relevant for forholdet mellom Tau-1 Hz/Tau-koffein. SERCA bidrag er positivt som er relevant for forskjellen Tau-koffein og Tau-1 Hz7,8,9.
Fullført prosedyren (figur 2), det er noen tekniske viktige punkter som bør bemerkes. Først å etablere et automatisert system er avgjørende å bytte pacing og perfusjon systemet nøyaktig. Forhåndsinnstilte programmet kan kontrollere tidsforsinkelsen nøyaktig og bruke koffein perfusjon raskt. Dernest under prosessen er myocytter risikoen for å bli vasket bort av perfusjon løsningen. For å holde myocytter stabilt overholdt kammer fatet, skal cellene plasseres i retten i mer enn 15 minutter før opptak.
Videre, konfigurere en stabil nål perfusjon systemet for anvendelse av koffein er et kritisk steg. Det er tre viktige punkter for dette trinnet: (1) rask channel-svitsjen og glatt nål perfusjon, (2) godt kontrollerte perfusjon flyten hastighet, og (3) riktig avstand mellom pinne-spissen og målrette myocyte. Upassende innstillingen flyten hastighet, tips avstand eller forstyrrelser i løsningen channel-bryter kan resultere i feil anskaffe en akseptabel koffein-indusert kalsium puls. Koffein-indusert kalsium pulser, kan bare pulsen med en bratt bølgetopp velges for analyse av kalsium fjerning funksjon.
Den alternative metoden basert på patch-klemme system kan gi sikre data. Men kan noen faktorer, for eksempel rette opp innover K+ gjeldende, påvirke nøyaktigheten. I tillegg kan et høyere krav for avansert utstyr, dyktig tekniker og tidsforbruk også begrense bruken av oppdateringen-klemme. I noen grad har vår protokollen begrensning at den ikke gi direkte verdier SR belastning eller SERCA og NCX. Parametere (f.eksCa-koffein, Tau-koffein) bare gjenspeiler skiftende SR innhold og bidrag til diastolisk Ca2 + fjerning indirekte. Men har denne protokollen fordelen av bekvemmelighet, mindre begrensning av teknikk og utstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation av Kina (nr. 81100159, Dongwu Lai, 81401147, Juhong Zhang), medisinske og helse vitenskap Program av Zhejiang-provinsen (nr. 201646246, Dongwu Lai) og helse vitenskap og Teknologiplan Hangzhou City (nr. 2013A28, Ding Lin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Alfa Aesar | 012314 | |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 012315 | |
| KCl | Alfa Aesar | 11595 | |
| HEPEs | Sigma | H3375 | |
| D-Glucose | Alfa Aesar | A16828 | |
| NaOH | Alfa Aesar | A18395 | |
| KOH | Alfa Aesar | A18854 | |
| KH2PO4 | Alfa Aesar | 011594 | |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 3337 | |
| L-Glutamic | Alfa Aesar | A15031 | |
| Taurine | Alfa Aesar | A12403 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
| BSA | Roche | 735094 | |
| caffeine | Sigma | C0750 | |
| Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
| Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
| Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
| Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
| Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
| valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
| Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
| Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
| Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
| Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
| Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |
References
- Capel, R. A., Terrar, D. A. The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat. Front Physiol. 6, 80 (2015).
- Bers, D. M. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).
- Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy. Cardiovasc Diabetol. 13, 75 (2014).
- Pereira, L., et al. Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes. Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).
- Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).
- Ferrantini, C., et al. R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility. J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).
- Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects. Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).
- Cheng, J., et al. CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).
- Lai, D., et al. The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling. J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).
- Lai, D., et al. Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKIIδ Knockout Mouse Ventricular Myocytes. J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).
- Xu, L., et al. Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice. Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).
- Roussel, J., et al. Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase. Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).
- Yaras, N., et al. Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart. Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).
- Hu, Y., et al. Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart. Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).
