Summary
Hücre içi kalsiyum geri dönüşüm cardiomyocytes sistolik ve diyastolik fonksiyon yönetmelikte kritik bir rol oynamaktadır. Burada, sarcoplasmic retikulum Ca2 + rezerv ve diyastolik kalsiyum kaldırma cardiomyocytes işlevinde bir kalsiyum görüntüleme sistemi tarafından değerlendirmek için bir protokol açıklayın.
Abstract
Hücre içi kalsiyum geri dönüşüm cardiomyocytes sistolik ve diyastolik fonksiyon yönetmelikte kritik bir rol oynamaktadır. Kardiyak sarcoplasmic retikulum (SR) kasılma, hangi reuptakes intrasellüler Ca2 + dinlenme sırasında için bir Ca2 + rezervuar olarak hizmet vermektedir. SR Ca2 + rezerv tempolar için kullanılabilir için kardiyak contractibility belirli ve intrasellüler Ca2 + kaldırılması kardiyak diyastolik fonksiyonları için önemlidir. Şeker hastalığı ve kalp yetmezliği gibi patofizyolojik bazı koşullar altında Engelli kalsiyum Gümrükleme ve SR Ca2 + cardiomyocytes deposunda kardiyak Disfonksiyonun sürüyor tutulabilir. Burada, SRCa2 + rezerv ve diyastolik Ca2 + kaldırma değerlendirmek için bir protokol açıklayın. Kısaca, bir tek cardiomyocyte enzimatik izole edildi ve Fura-2 tarafından belirtilen hücre içi Ca2 + floresan bir kalsiyum görüntüleme sistemi tarafından kaydedildi. Kafein toplam SR Ca2 + yayın inducing için istihdam için biz stimülasyon ve perfüzyon sistemleri bağlantı tarafından bir otomatik perfüzyon geçiş programı önceden. O zaman, mono-üstel eğri uydurma çürüme zamanı sabitleri kalsiyum geçişler ve kafein kaynaklı kalsiyum bakliyat analiz etmek için kullanıldı. Buna göre katkısını SR Ca2 +-ATPaz (SERCA) ve Na+-Ca2 + Eşanjör (NCX) diyastolik kalsiyum kaldırma için değerlendirilir.
Introduction
Hücre içi kalsiyum ([Ca2 +]ben) geri dönüşüm cardiomyocytes1sistolik ve diyastolik fonksiyon yönetmelikte kritik bir rol oynamaktadır. Bildiğimiz gibi kalsiyum kaynaklı Ca2 + yayın hangi kasılma için elektrik sinyali çevirmek kaplin, uyarma daralma başlatır. Membran depolarizasyon neden Ca2 + 2 + kanal SR ryanodine reseptörleri 2 (RyR2) yolu ile sitoplazma içine serbest bırakmak sarcolemmal L tipi Ca etkinleştirir. Geçici yükseltilmiş sitoplazmik Ca2 + myofibrils daralma başlatır. Diastole sırasında olduğunu sitoplazmik Ca2 + reuptaken içine aracılığıyla SR Ca2 +SR-ATPaz 2 (SERCA2) ve cardiomyocyteNa+-Ca 2 + Eşanjör (NCX)2üzerinden dışarı pompalanır. Bu işlem kasılma-gevşeme içinde cardiomyocyte geri dönüşüm yol açar.
Kardiyak SR contractile makine çevreleyen bir hücre içi membran ağıdır. Bu kasılma için bir Ca2 + rezervuar olarak hizmet vermektedir ve intrasellüler Ca2 + dinlenme sırasında reabsorbs. SR Ca2 + rezerv tempolar için kullanılabilir için kardiyak contractility belirli. Bu arada, intrasellüler Ca2 + kaldırılması için kardiyak diastole önemlidir. Patofizyolojik bazı koşullarda, şeker hastalığı ve kalp yetmezliği, Engelli Ca2 + izni ve depresif SR Ca2 + gibi cardiomyocytes deposunda kardiyak Disfonksiyonun2sürecinde,3 tutulabilir ,4.
SR Ca2 + yayın ve diyastolik Ca2 + kaldırılmasına cardiomyocytes ölçmek için yaygın olarak kullanılan iki yaklaşım vardır: NCX geçerli bütünlüğünü dayalı yama-kelepçe5,6ve kafein kaynaklı Ca CA2 + Floresans görüntüleme7,8,9tarihinde dayalı 2 + darbe. Eski yaklaşım SR yayımlanan Ca2 + büyük ölçüde hücreden NCX tarafından pompalanır ki aslında bağlıdır. Ancak, bu yaklaşım onun şartı gelişmiş ekipman ve usta işlemi tarafından sınırlıdır. Bu da çalışmanın, SR Ca2 + rezerv ve Ca2 + miyositler kaldırılmasına bir Ca2 + Floresans görüntüleme sistemine dayalı bir kafein kaynaklı Ca2 + darbe ölçerek değerlendirmek için uygun bir yaklaşım açıklar. Kısaca, intrasellüler Ca2 + Floresans Fura-2 tarafından belirtilir. Stimülasyon sistemi ve perfüzyon sistemi tarafından ilişkilendirerek, perfüzyon anahtarlama ve sistem otomatik olarak pacing için bir program mevcut. 10 mM kafein hızla toplam Ca2 + sürümde SR. ikna etmek için istihdam edildi Kalsiyum geçişler ve kafein kaynaklı kalsiyum bakliyat üstel çürüme zamanı sabitleri (Tau) mono üstel eğri uydurma, diyastolik Ca2 + kaldırma SERCA ve NCX katkısı uygun şekilde yansıtan elde edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
tüm hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve deneysel Araştırma Merkezi, Çin Çince tıbbi bilim ve Zhejiang Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. çözüm hazırlık
- tüm çözümler Tablo 1 ' de açıklandığı şekilde hazırlayın.
2. yalıtım, sol ventrikül (LV) Cardiomyocytes
Not: LV cardiomyocytes enzimatik Langendroff perfüzyon sistemi yukarıda açıklanan 7 olarak kullanarak izole , 8 , 9 , 10 , 11.
- Langendroff perfüzyon sistemi ayarlarsınız. Perfüzyon sistemi Normal Tyrode (NT) çözüm ile doldurmak, 36.5 ° C'de sıcaklığı ayarlamak ve tüp herhangi bir hava kabarcıkları ortadan kaldırmak.
- Tartmak ve Sprague-Dawley rat mayi enjeksiyonu (IP) kloral hidrat (400 mg/kg) ile anestezi. 5 dk. sonra kuyruk ya da ayak çimdik yanıt değerlendirerek anestezik durum teyit
- Xiphoid işleminin altında karın boşluğu ile Cerrahi makas açın, xiphoid işlemi kaldırın ve göğüs makas ile açın. Kalp zarını kaldırmak, biraz kalbi eğri Forseps ile kaldırın, aort tanımlamak ve makas aort kök kalp kekemelik.
- 60 mm çanak kalp transfer ve NT çözüm ile yıkayın. Aort iki mikro-anatomi Forseps ile tutun ve Langendorff perfüzyon kanül monte ve sıkıca cerrahi dikişler kullanarak kanül üstüne aort ligate.
Not: Bu işlem 15 içinde yetenekli bir operatör bitirebilir miyim s. - Kalp koroner arter dolaşımını kurtarmak için 30 mL NT solüsyonu ile sıvı. Sonra perfusate 30 mL için Ca 2 + geçiş-kalp atışı durdurmak için Tyrode çözüm (10 mM taurin, 1 mg/mL BSA) ücretsiz. Daha sonra perfusate Collagenase A yalıtım çözüm (0.6 mg/mL) enzim sindirim için geçiş.
Not: Kullanım Collagenase deneyler için diyabetik sıçan veya Collagenase II ile deneyler için diyabetik sıçan olmadan. - 20-25 dk sindirim sonra hızlı bir şekilde perfüzyon çözüm Ca 2 + için değiştirmek-Tyrode çözüm daha fazla sindirim durdurmak için ücretsiz. Sonra kalp Forseps ile tutun, kanül--dan kesmek ve kalp KB solüsyon içeren bir 35mm tabak yerleştirin (bkz. Tablo 1).
- Makas ve Forseps ile LV duvar incelemek. Atrium, sağ ventrikül ve Atriyoventriküler birleşim alanı kesti. LV kalan dokudur; KB çözüm ile yeni bir 35 mm çanak içine aktarın. LV doku küçük parçalar halinde kıyma.
- Yavaşça filtre uygulanmış bir plastik damlalık taşlarla pipette ve 10 mL KB çözümde yeniden askıya alma.
- 150 µm diyafram paslanmaz çelik filtre ve 15 mL santrifüj tüpü aktarmak hücrelerle filtre. 150 x g 30 s ve atma süpernatant için de santrifüj kapasitesi. 10 mL KB çözümünde, ücretsiz miyositler yerleşmek için 6 dk, yeniden askıya süpernatant atmak ve Pelet 10 mL KB çözümde yeniden askıya alma.
Not: %100 O 2 ile benzin çözümlerinde 36 ° C'de tüm adımları gerçekleştirilmiştir.
3. Kalsiyum tekrar rifampisin
- 20 dk KB çözüm için yerleşme sonra süpernatant atmak ve kalsiyum tekrar rifampisin çözüm A ile miyositler yeniden askıya alma (0.3 mM Ca 2 +, 4.5 mL Ca 2 +-ücretsiz Tyrode çözüm, 1,5 mL NT çözüm) 10 dakika süreyle
- Kalsiyum tekrar rifampisin çözüm B ile yukarıdaki yordamı yineleyin (0.3 mM Ca 2 +, 3 mL Ca 2 +-ücretsiz Tyrode çözümü, 3 mL NT solüsyon).
- Kullanılabilir miyositler arındırmak için NT solüsyonu (1,2 mM Ca 2 +) ile yukarıdaki yordamı yineleyin. Bu çözümde izole LV miyositler depolamak ve onları 4-6 h. içinde çalışma
4. Set Up perfüzyon sistemi
- odası perfüzyon ( şekil 1A) için NT çözüm ile giriş akımı tüp bağlamak.
- Çok namlu manifold ipucu (örneğin, perfüzyon kalem, bundan böyle kalem anılacaktır) için iğne perfüzyon hedef myocyte, bağlanmak, micromanipulator sabit, Vana perfüzyon sistemi kontrol. NT çözüm ve 10 mM kafein çözüm kalem ( şekil 1A) her sütun için eklemek.
- Hava engellenmesini önlemek için tüpler herhangi bir hava kabarcıkları tahliye.
- Kalem 10 mikron ucundan damla sayısını saymak s ve akış hızı 3 damla/10 s. yaklaşık bir hızda tutmak için akım regülatörü değerini el ile ayarlamak
5. İntrasellüler Ca 2 + Darbe Gerilimlerinden ve Sarcomere kısalma 7 , 8 , 9 ölçümleri
- pipet 10 µL hücre süspansiyon slayt mikroskop altında bir hücre sayaç tarafından hücre sayıları saymak ve yoğunluğu hesaplayın. 50. 000 hücre/mL yaklaşık bir konsantrasyon için miyositler sulandırmak.
- Ekle Fura-2 acetoxymethyl (AM) hisse senedi (bir kalsiyum hassas boya) miyositler için 2 µM. nihai toplama getirmek için 1 mL süspansiyon halinde tutmak içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 20 dk için.
- 30 s ve yeniden askıya NT çözüm ile cardiomyocytes 2 kez 150 g, santrifüj.
- Dönüş ışık kapalı ve hücreleri karanlıkta bırakın. Miyositler perfüzyon odası 15 dakika yerleştirin. O zaman odası perfüzyon (1,5 mL/dk) NT çözüm ile başlatın. Hızı miyositler için 5 dk. bir uyarıcı (dalga süre 4.0 ms, darbe genlik 8.0 V) kullanarak 1 Hz alan stimülasyon ile
- Bir myocyte iyi şeklinde seçin (çubuk şekli, keskin kenar ve çapraz yivler net) ve istikrarlı uyarılmış seğirme (hiçbir kendiliğinden kasılma) 10 x mikroskobik objektif mercek altında. Ardından, mikroskobik büyütme oranını değiştirmek için 40 x ve myocyte yatay bir konumda tutmak için CCD kamera yönünü döndürmek.
- Çerçeve hücre çerçeveleme bağdaştırıcısı ayarlayarak tek myocyte. Arka plan açık olduğundan emin olun.
- Miyositler 340 veya 380 nm dalga boyu uyarma filtreleriyle, ksenon lamba tarafından yayılan ışığa maruz ve 40 x objektif aracılığıyla miyositler görüntü. Floresans sinyali, 510 nm. Bu arada, sarcomere uzunluğu değişiklikler miyositler, Not ve yumuşak kenar modülü aynı anda kullanarak kayıt.
- Kayıt floresan bir çift-uyarma Floresans photomultiplier sistem tarafından. Görüntüleme sistemi kalsiyum için kayıt programını çalıştırın,'ı tıklatın " dosya/yeni dosya " yeni bir kayıt oluşturarak ve'ı tıklatın " başlangıç " düğmesini zaman uyumlu olarak kayıt Floresans ve sarcomere uzunluğu için.
6. Değerlendirilmesi SR Ca 2 + rezerv ve diyastolik Ca 2 + kaldırma işlev 7 , 8 , 9
- InterLink " Aux Out " içinde bağlantı noktası uyarıcı ile " Analog içinde " Vana kontrol sistemi üzerinde bağlantı noktası (örneğin, Vana Komutan, bkz: Malzemeler tablo) (TTL sinyal eşitlemek için) bir BNC kablo ile.
- Perfüzyon vanalar yukarıda açıklanan 8 , 9 olarak otomatik olarak geçiş yapmak için bir program hazır ayarı; İşlem için ayrıntılı adımlar olarak aşağıda listelenmiştir.
- Kapak parametrelerinde kontrol yazılım Tablo 2 başına ve tıklatın hazır ayar " Download " sırası karşıdan yüklemek için düğmesini program yüklü. ' I tıklatın " TriggEr " düğme-e doğru olanaklı kılmak tetikleyici görev.
Not: Sıra TTL sinyal aldıktan sonra supap kontrol sistemi yürütebilirsiniz. - Stimülatörü sıra moduna önceden ve küme parametreleri göre Tablo 3.
- Kapak parametrelerinde kontrol yazılım Tablo 2 başına ve tıklatın hazır ayar " Download " sırası karşıdan yüklemek için düğmesini program yüklü. ' I tıklatın " TriggEr " düğme-e doğru olanaklı kılmak tetikleyici görev.
- Uyarıcı, ayarla " S1 adım " miyositler 1 Hz., LV hızı ile NT çözüm 1.5 mL/dk hızında iğne perfüzyon başlatın.
Not: iğne akış hızını odası perfüzyon daha hızlı olduğundan, iğne Stream ışık kırılma odası perfüzyon ışık kırılma farklıdır. Işık kırılma fark hedef myocyte çevreleyen etkili iğne perfüzyon aralığını gösterir.
Bir hedef myocyte (dizisindeki için ters yönde aşağı akım) düşük güç mikroskobik görünümü altında - seçin ve emin olun bu mikro kalem ucunu tarafından ulaşılabilir. Mikroskop büyütme 400 x için değiştirin. CCD kamera yönlendirmeyi myocyte yatay konumda tutun olarak döndürün. Dikdörtgen diyafram altında hücre çerçeveleme bağdaştırıcı ile miyositler doldurur uygun bir pencere için ayarlayın. En az arka plan olduğundan emin olun; diğer miyositler veya ölü hücre artıkları bu pencerede izin vermemek.
- Micromanipulator üzerinde sabit kalem konumunu ayarlamak ve dikkatle mikro ipucu yer görme alanı hedef myocyte için yarıçap mesafeden altında 400 x mikroskop büyütme.
- Çoğunlukla hedef myocyte kapak ve myocyte uzak iğne akış tarafından süpürüldü değil emin olmak için iğne akış aralığı ayarlamak.
- Sonra 60 s temel Stimülatörü imlecine rulo pacing, " D2 adım ".
Not: Protokolü geri kalanı otomatik olarak uyarıcı ve supap kontrol sistemi tarafından yürütülür. Yukarıdaki ayarına göre iletişim kuralı otomatik olarak olduğu gibi şekil 2A, 1 Hz 60 için NT çözüm ile pacing temel yürütülebilir s. Pacing ve gecikme 2 için duraklatmak s, 10 mM kafein perfüzyon 15 hızla geçmek s (işlevsel olarak Ca 2 + SR depoda serbest bırakmak için) ve sonra geri NT çözüm anahtarı. - Kayıt sonunda bireysel miyositler için arka plan Floresans algılamak. ' I tıklatın " Duraklat " yakın boş alana taşımak mikroskobik görünümü düğmesini dosya kayıt, duraklatmak için. ' I tıklatın " Kayıt " Kayıt için birkaç saniye devam düğmesini tıklatın ve kayıt arka plan düzeltme için sayısal 340 ve 380 nm yoğunluk değerleri.
- Açık " işlemi ve sabitler " iletişim kutusunda ve içine değerleri doldurma " arka plan " form, sırasıyla; yazılım arka çıkararak Fura 2 oranı değerleri düzeltebilirsiniz.
7. Veri analizi 9
- kalsiyum geçişler ve hız ayarlama temel aşamada kısalma sarcomere ölçülerini, seğirme bakliyat ortalama ve kalsiyum geçişler, zaman sabiti gibi dinamik parametreleri analiz Kalsiyum geçici çürüme (Tau-1 Hz), belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanılarak otomatik olarak.
Not: yazılımın çürüme kesimi de uymazsa ihracat düşüş izleme için el ile mono üstel eğri uydurma. - Kafein kaynaklı kalsiyum atışlar için sadece nabız kalsiyum kaldırma işlevi çözümlenmesi için dik bir dalga ile seçin. Sinyal bozukluğu, anormal darbe ya da o uzakta midway akan içeren hücreleri dışlamak.
- Kafein kaynaklı kalsiyum darbe (Ca-kafein, SRCa 2 + rezerv dizini) genliği ölçmek.
- Mono üstel eğriyi (10 s süresi) el ile ( şekil 2C) bilgisayar yazılımı--dan yaklaştırarak çürümesine zaman sabit kafein kaynaklı kalsiyum darbe (Tau-kafein) elde edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, - diyabetik sıçan (DM) indüklenen ve yaş eşleşti Sprague'ı - streptozotocin (STZ) göstermek Dawley (SD) fareler gibi. 8-hafta-yaşlı erkek SD rats (200 ± 20 g) kontrol grubu için DM grup veya sitrat arabellek STZ (70 mg/kg, IP) tek bir mayi enjeksiyon aldı. Bir hafta sonra STZ yönetim, sıçanlar kan şekeri ile > 16,7 mmol/L diyabetik kabul. 8 hafta sonra LV miyositler enzimatik izole edildi. Kalsiyum tekrar rifampisin sonra hayatta kalma durumunda kalır miyositler yaklaşık % 70-80 var. Çubuk şekli, açık yiv ve istikrarlı kasılmalar tek miyositler (şekil 1B) kaydetmek için seçildi. Şekil 1Aile gösterildiği gibi biz odası perfüzyon ve iğne perfüzyon miyositler için ayarlayın. Perfüzyon vanalar ve sistem pacing otomatik olarak önceden belirlenmiş bir program tarafından şekil 2Aiçinde açıklandığı gibi açık. Hücre içi kalsiyum Floresans görüntüleme sistemi bir kalsiyum tarafından kaydedildi. Değerleri ortalama ± SEM bildirildi
SD grubuyla karşılaştırıldığında, DM grup gösterdi kafein kaynaklı kalsiyum darbe (Ca-kafein) önemli alt genliğini (0.332 ± 0.008 vs. 0.276 ± 0.008, t-Testi: p < 0,05) ve bir alt kesirli kalsiyum sürüm SR (Ca-1 Hz / CA-caffeine) (%1,5 78,5 ± 72.1 ± %1,0, t-test: p < 0,05) (şekil 2B). Tau-1 Hz ve Tau-kafein mono üstel eğri uydurma elde edilmiştir; DM grup olağanüstü uzun çürüme zamanı sabitleri kafein kaynaklı kalsiyum darbe (Tau-kafein) gösterdi (1.822 ± 0,07 ms vs. 2.896 ± 0,088 ms, t-Testi, p < 0,05) ve Tau-1 Hz/Tau-kafein oranı (0,076 ± 0,003 vs. bir üst düzeyine 0,086 ± 0,003, t-Testi, p < 0,05) daha SD grubu (şekil 2B). Bu sonuçlar depresif SR Ca2 + rezerv belirtilen ve Ca2 + izni diyabetik cardiomyocytes içinde bozulmuş.
Şekil 1. Perfüzyon sistemi ve izole LV miyositler çizimi. (A)odası perfüzyon ve kalem perfüzyon Illustration. Oklar perfüzyon odası NT çözümde akış yönünü gösterir. Kalem NT veya kafein çözüm ile hedef myocyte çevreleyen perfüzyon sağlar. Mikron ipucu özgürce odası manipüle edilebilir. (B) mikroskobik görünümünü LV miyositler çubuk şeklinde izole ve çapraz yiv izleri temizleyin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. SR kalsiyum rezerv ve kalsiyum kaldırma işlevi değerlendirilmesi. (A)iletişim kuralı perfüzyon vanalar anahtarlama ve sistem otomatik olarak pacing için Illustration. (B) istatistik değerleri SR Ca2 + rezerv ve SR kesirli Ca2 + 1 Hz teşvik için yayın DM ve SD gruplarında twitches. DM grup2 + rezerv ve SR kesirli Ca2 + SD grubu daha serbest önemli azalma SR Ca gösterdi. (C) yazılım paneli çürüme süre uygun bir el ile mono üstel eğriyi kafein kaynaklı kalsiyum darbe (Tau-kafein) sürekli gösterirken. (D) çubuk grafikler Tau-kafein ve Tau-1 Hz/Tau-kafein DM ve SD gruplar arasında karşılaştırma. DM grup Tau-kafein ve Tau-1 Hz/Tau-kafein SD grup daha önemli artış değerleri gösterdi. Değer = ortalama ± SEM, t-Testi gerçekleştirilen, *p < 0,05 SD grubuyla karşılaştırıldığında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Çözümleri | İçeriğinde (mM) |
| Normal Tyrode (NT) çözüm | 135 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 MgCl2, 10 glikoz, 10 HEPES, 1.2 Na2HPO4, 1.2 CaCl2, 7,35 için NaOH ile pH ayarlama |
| CA2 + ücretsiz Tyrode çözüm | 135 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 MgCl2, 10 glikoz, 10 HEPES, 1.2 Na2HPO4, 10 taurin, ayarlamak için 7,35 NaOH ile pH |
| Collagenase yalıtım çözüm | Collagenase A ya da Collagenase II + Ca2 + Tyrode çözümü ücretsiz |
| KB çözüm | 120 KOH, 120 L-glutamik, 5 MgCl2, 10 HEPEs, 1 EGTA, 10 glikoz, 20 taurin, 7,35 KOH ile pH ayarlama |
| Kafein perfüzyon çözüm | NT çözüm 10 kafein |
Tablo 1. LV miyositler yalıtım ve hücresel perfüzyon için çözümler.
| Vana | Zaman (saniye) |
| 2 | 15 |
| 1 | 60 |
Tablo 2. Parametreleri Vana kontrol sistemi (Vana Komutan) önceden.
| Panel ekran | yorum |
| 4.0 ms süresi | elektriksel stimülasyon alan zaman |
| 8.0 V | Elektrik voltajı |
| S1 1.0 HZ 999S | durum pacing, hedef myocyte bul |
| D2 001S | Duraklat pacing için bu adımı seçin ve 1s Bazal seğirme kaydettikten sonra gecikme |
| D3 015S * | "*" uyarıcı bir 5V TTL sinyal çıktısını alabilirsiniz gösterir |
| D4 060S | Bitiş kafein perfüzyon ve myocyte normal durumuna yeniden elde etmek |
| BİTİŞ | geri almak için S1 adım |
Tablo 3. İn Stimülatörü parametrelerinde hazır ayar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalsiyum akı SR yayımlanan başlıca Ca2 + Sistol kalbinde için kaynağıdır. Bir ölçüde, SR Ca2 + içerik genliği ve kesirli Ca SR yayımlanan2 + yansıtmak SR Ca2 + rezerv kardiyak kasılma için kullanılabilir. Öte yandan, Ca2 + rezerv SR sırasında diastole12,13,14arasında SR SR Ca2 + geri alım, Ca2 + sızıntı SR ve kendi dengesini yeteneği üzerinde bağlıdır. Deneyimimizi, 10 mM kafein hızlı uygulama2 + serbest bırakmak ve Ca2 + reuptake SR, RyR kanal açarak önlemek toplam Ca ikna etmek hedefleniyor. Böylece, kafein kaynaklı Ca2 + darbe genlik SR Ca2 + rezerv indeks olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, temel 1 Hz ve 3 Hz pacing ile biz daha fazla frekans-bağımlılık SR yük ve onun temel mekanizması6araştırma.
Kaldırma-in Ca2 + sitoplazmada kardiyak diyastolik fonksiyonları için önemlidir. 1 Hz alan stimülasyon, aşamada şekil 2Agösterildiği gibi kalsiyum geçişler düşüş SERCA SR, NCX cytomembrane ve yavaş taşıma sistemleri (mitokondrial Ca2 + uniporter ve sarcolemmal Ca2 + neden olduğu bildirildi -ATPaz). Yavaş mekanizmaları katkısını ihmal edilebilir olduğundan, Ca2 + geçici (Tau-1 Hz) çürümesine zaman sabit SERCA ve NCX7,8,9kombine etkinliğini yansıtır. Kafein perfüzyon aşamada SERCA SR kalsiyum yedek oluşturulamadı. Böylece, kafein kaynaklı kalsiyum darbe (Tau-kafein) düşüş özellikle NCX için neden olduğu bildirildi. Buna bağlı olarak, NCX işlevi Tau-kafein ilgili olarak negatif olur. Diyastolik Ca2 + kaldırma NCX katkısı Tau-1 Hz/Tau-kafein oranı ile ilgili olarak olumlu bir şey. Tau-kafein ve Tau-1 Hz7,8,9arasındaki fark ile ilgili olarak olumlu SERCA katkıdır.
Yordamı başarıyla tamamlamak için (Resim 2), belirtmek gerekir bazı teknik anahtar nokta vardır. İlk olarak, otomatik bir sistem kurulması için geçiş pacing ve perfüzyon sistemi tam olarak önemlidir. Önceden ayarlanmış program gecikme süresini doğru bir şekilde kontrol edebilecek ve kafein perfüzyon hızla uygulamak. İkinci olarak, işlemi sırasında miyositler perfüzyon çözüm tarafından yıkanıp riski vardır. Miyositler stabil odası yemek için yapıştırılır tutmak için hücreleri tabakta 15 dakikadan fazla kayıt önce yer almalıdır.
Ayrıca, kafein uygulanması için bir istikrarlı iğne perfüzyon sistemi kurma başka bir kritik bir adımdır. Bu adım için üç anahtar nokta vardır: (1) hızlı kanal anahtarı ve düz iğne perfüzyon, (2) iyi kontrollü perfüzyon akım hızları ve (3) uygun iğne ucu mesafe ve myocyte hedef. Akım hızı, ipucu mesafe veya çözüm kanal anahtarı girişim uygunsuz ayarı bir kabul edilebilir kafein kaynaklı kalsiyum darbe edinme başarısızlıkla sonuçlanabilir. Kafein kaynaklı kalsiyum atışlar için sadece bir dik dalga kret ile darbe kalsiyum kaldırma işlevi analizi için seçilmiş olabilir.
Yama-kelepçe sistemini temel alan alternatif yöntem nispeten doğru veri sağlayabilir. Ancak, içe-takviyeli-K+ akım gibi bazı faktörler doğruluğunu etkileyebilir. Ayrıca, Gelişmiş ekipman, kalifiye teknisyen ve zaman tüketimi daha yüksek bir gereklilik de yama-kelepçe uygulanması sınırlayabilir. Bir dereceye kadar bizim iletişim kuralı bu SR yükünün doğrudan değerleri veya etkinlik SERCA ve NCX sağlayabilir değil sınırlaması vardır. Parametreleri (örneğin, Ca-kafein, Tau-kafein) yalnızca değişen SR içerik ve diyastolik Ca2 + Temizleme katkısı dolaylı olarak yansıtır. Ancak, bu iletişim kuralını kolaylık, teknik ve ekipmanları daha az sınırlama avantaja sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser hibe Çin Ulusal doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (No 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), tıp ve Sağlık Bilimleri programı, Zhejiang eyaleti (No 201646246, Dongwu Lai) ve Sağlık Bilimleri ve Hangzhou City (No. 2013A28, Ding Lin) teknoloji planı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Alfa Aesar | 012314 | |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 012315 | |
| KCl | Alfa Aesar | 11595 | |
| HEPEs | Sigma | H3375 | |
| D-Glucose | Alfa Aesar | A16828 | |
| NaOH | Alfa Aesar | A18395 | |
| KOH | Alfa Aesar | A18854 | |
| KH2PO4 | Alfa Aesar | 011594 | |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 3337 | |
| L-Glutamic | Alfa Aesar | A15031 | |
| Taurine | Alfa Aesar | A12403 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
| BSA | Roche | 735094 | |
| caffeine | Sigma | C0750 | |
| Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
| Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
| Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
| Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
| Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
| valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
| Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
| Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
| Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
| Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
| Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |
References
- Capel, R. A., Terrar, D. A. The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat. Front Physiol. 6, 80 (2015).
- Bers, D. M. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).
- Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy. Cardiovasc Diabetol. 13, 75 (2014).
- Pereira, L., et al. Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes. Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).
- Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).
- Ferrantini, C., et al. R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility. J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).
- Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects. Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).
- Cheng, J., et al. CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).
- Lai, D., et al. The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling. J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).
- Lai, D., et al. Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKIIδ Knockout Mouse Ventricular Myocytes. J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).
- Xu, L., et al. Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice. Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).
- Roussel, J., et al. Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase. Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).
- Yaras, N., et al. Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart. Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).
- Hu, Y., et al. Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart. Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).
