Summary
このプロトコルでは、上気道から邪魔されず粘膜被覆液のサンプリングのための非侵襲的技術について説明します。それは、すべての年齢層の被験者でタンパク質メディエーター、サイトカイン、ケモカインなどの生体内レベルの定量化を実行する使用できます。
Abstract
このプロトコルでは、妨げられていない上部気道粘膜内層流体の非侵襲的サンプリングについて説明します。それはまた刺激プロシージャ (よく、他の技術によって使用される) を必要とせず、気道局所の免疫署名に関する流体波における免疫メディエーターの分析の前に使用される抽出手順の詳細します。フィルター ペーパーのストリップの粘膜内層液をサンプリング下鼻甲介と吸収の 2 分間左の前部で置かれました。検体用濾紙から溶出され、同じサンプルの低レベルと高レベル分析の高感度定量を可能にする、電気化学発光を用いたイムノアッセイ法によって抽出された蛋白質基づいた溶出を分析します。上部気道粘膜における情報伝達システム特定の免疫に関連する 20 あらかじめ免疫メディエーターの体内レベルを測定したが、技術はその特定のパネルまたはサンプリング サイトに制限されていません。技術は、アレルギー性鼻炎小児2000 (COPSAC2000) コホート研究における喘息のコペンハーゲンの前向き研究から 7 歳児に最初実装されました。それはその後 1 ヶ月、2 歳、6 歳、急性呼吸器症状のインスタンスをサンプリング、縦の COPSAC2010出生コホートで使用されました。いくつかのサンプル (中央 (四分範囲 (IQR)) として報告測定検出限界以下であった我々 は正常に取得し 700 1 か月児の 620 (89%) からサンプルを分析した; します。各調停の (すなわち0 から検出下限値の設定ポイント) の検出限界以下のサンプル数は、29 (7.25 119.5) だった。この技術は、誕生からin vivo気道粘膜免疫プロファイルの数量化できる、縦、適用することができます、遺伝学と初期の生活環境暴露、病態、endotyping、および呼吸器疾患と開発と新規治療薬の評価の監視の影響に関する研究に適用することができます。
Introduction
鼻の粘膜内層液上部気道系の液体の一部を占めています。調停に由来する上皮および侵入の微生物に対する防御の最初の行を構成する免疫細胞間の相互作用の複雑なマトリックスで構成されています。鼻の粘膜は簡単にアクセスできる、鼻と気管支1の免疫学的機能の強い関係があります。この区画は幼年期、生命に後でより普及しているその他の呼吸器系疾患の範囲にも喘息やアレルギー性鼻炎などでは一般的な気道疾患に関連して特別な関心。
ここでは、サンプル邪魔されず鼻腔から流体をライニング粘膜フィルター紙ベース、非侵襲的手法としてそれに続く抽出プロシージャを使用して、その定量化する前にフィルター ペーパーからの検体の蛋白質ベースの溶出に使用するメソッドの実装について述べる.この手法は、生体内で健康な個人と様々 な呼吸器疾患を持つ個人の免疫の署名を取得するたとえば、使用できます。さらに、特定免疫署名の重要性の露出を確認し、予測または発病後の調停の場合を評価することが可能です。
粘膜内層液は、鼻洗浄2がよく付いている鼻チャレンジ テスト、炎症性応答3,4を刺激するために高いレベルでのアレルゲンが導入される以前受けた。ただし、鼻洗浄技術は、幼児に適さないことがし、5アッセイの検出限界値以下のレベルが落ちることができる希薄化後の調停者として、結果を混同する不明な希釈率を紹介します。また、不明な希釈倍率により鼻チャレンジ テストから測定試料応答が設定コホートで鼻洗浄法の有用性を制限すること、個人間に匹敵します。最後に、アレルゲンの挑戦は、鋭敏化の分野で適用されるだけ、ヒスタミンの挑戦など、その他の課題は生理学的関連性の高い、メディエーター遊離の天井の効果を引き起こす可能性がありますありません。これらの問題は、流体と検体レベルの個々 の分泌が個体間の差異に影響を与える唯一の要因を粘膜内層流体コレクションの紹介したフィルター紙ベース テクニックで回避します。
抽出中に、検体は、すべてのサンプルに、バッファーの同じボリュームの付加の後でフィルター ペーパーから溶出されます。これは、すべてのサンプルの希釈前のヴィヴォ同様優先されます。抽出手順にアルブミン ベース等張食塩水の抽出バッファーを使用します。蛋白質ベースのメディエーターの抽出と定量化の前に溶出蛋白質の以降凍結変性を抑えるタンパク質を安定できます。抽出段階でのタンパク質分解を避けるためには、プロテアーゼ阻害剤のカクテルは抽出バッファーに追加されます。
邪魔されない生体内での定量化を可能にする技術の実装-粘膜のサイトで生成された免疫メディエーターが非常に重要です。最初に、粘膜のサイトは体内最大の免疫臓器をなります。第二に、鼻の位置の気中暴露のプライマリ サイトで、肺1呼吸器免疫学的区画にしっかりと接続されています。第三に、非侵襲的手法でこの重要な器官の調査の可能性は健康と気道の病気に関連して重要な微生物免疫の相互作用軸情報の茄多を提供する可能性を開きます。第四に、この技術は、医薬品と栄養素のランダム化された、制御された試験のローカル免疫学的変化などの他の多くの可能なアプリケーションがあります。
喘息のコペンハーゲンの前向き研究の手法を実装されて最初幼年期2000 (COPSAC2000) コホート研究において、7 歳児健常者13対アレルギー性鼻炎の粘膜内層液の免疫のプロフィールを調べた。その後、我々 は正常に縦 COPSAC2010コホートと評価気道免疫プロファイルにこの手法を適用 1 ヶ月、2 歳、6 歳の時、急性呼吸器症状のインスタンスで。1 歳 1 か月の新生児からの結果は、免疫の署名と初期の生活環境暴露7,8,9,10、11,12間の重要な関連を示しています。
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Protocol
ヘルシンキ宣言の基本理念に基づき、研究を行った。(KF 01-289/96 COPSAC2000 ) および H-B-2008-093 COPSAC2010のコペンハーゲン、デンマークのデータ保護局の倫理委員会から承認が得られたし、入学前に各教科の親の両方から書面によるインフォームド コンセントを得た。
1. 実験装置
- フィルターの紙のシートを使用して、(線維の水酸化ポリエステル シート材料の表を参照してください)6,7。
- お子様や大人 (5 × 20 × 10 mm (L の短い腕)) ためストリップ 3 × 15 mm 1 ヶ月歳の子供のための大きさで、L 字型にカットします。
- 鉗子を用いた幼児各鼻孔にフィルターの紙一枚を挿入します。下鼻甲介 (新生児の鼻と他のすべての年齢のため 1.5 cm 内側約 1 cm) の前方の部分にろ紙を置きなさい。
- ベッドの上に新生児を置くし、快適さのための砂糖水を与えます。
注: 他のすべての年齢の子供たち、サンプリングが実行されます最も簡単に件名が椅子に座っているの。 - お子様のためには、各鼻孔に L 形のフィルター紙の長い腕を挿入します。
- ベッドの上に新生児を置くし、快適さのための砂糖水を与えます。
- 不快感を最小限に抑えるため、フィルター ペーパーの偶然の損失を避けるために鼻孔の周りに鼻クリップを適用します。
- 吸収の 2 分後に、フィルター ペーパーを削除します。
- ラベルの付いたチューブでフィルター ペーパーを置き、-80 ° c. ですぐにそれらを凍結
- サンプリングの日に子どもに示す気道感染の症状のメモしておきます。
- どんなくしゃみ、持続的な泣き、またはサンプリングの 2 分の中に発生する鼻出血を記録します。
2. 気道免疫メディエーターの定量化
- 冷凍庫から 10 までのランダムなサンプルを取る。識別番号を記録します。全体の作業工程の中に氷のサンプルを保ちます。
- 氷の融解後没頭 (通院) フィルター ペーパー両方の鼻から 300 μ L 作りたてのバッファー (参照材料表) 含まれている 1 つ完全なプロテアーゼ阻害剤タブレット (材料の表を参照してください) 25 mL のバッファーあたり。
- フィルター ペーパーのサイズに従ってバッファーのボリュームを調整します。
- フィルター ペーパーのサイズ 3 × 15 mm のバッファーの 300 μ L を使用します。
- フィルター紙の 1 つだけの場合は、半分のバッファー量 (150 μ L) を使用します。
- フィルター ペーパーのサイズに従ってバッファーのボリュームを調整します。
- タイマー 5 分使用プレート シェーカー (400 回転) にサンプルを転送します。
- 遠心機内に配置、酢酸セルロース チューブ フィルター (0.22 μ m 孔サイズ) のカップに湿ったフィルター ペーパーおよびアッセイバッファーを転送管 (材料の表を参照してください)。
- (4 ° C) で冷却遠心機で 5 分間 16,000 x g で遠心分離機の管にフィルター処理された鼻エキスを入手します。
- カップを削除し、低蛋白結合記憶板 (材料の表を参照してください) の井戸に早かったしながら氷の上管鼻のエキスを維持します。
- 解析まで-80 ° C で保存します。
- 高感度、electrochemiluminesce ベースの多重配列を用いた鼻抽出におけるサイトカインとケモカイン濃度を把握 (材料の表を参照してください)。
注: 人間 10 プレックス TH1/TH2 サイトカインのアッセイ、9 プレックス ケモカイン アッセイとシングル プレックス IL 17A、TGF-β 1、TSLP を行ったここ。- 試金、4 ° C で一晩鼻のエキスを孵化させなさい。標準メーカーごとプロトコル (材料の表を参照してください) として測定を行います。
注: イムノアッセイ測定 1 までの高ダイナミック レンジがある (材料の表を参照してください) 通常 & 10,000 pg/mL である試金 100,000 pg/mL をすることができますが。これは、すべてのサンプルを他の同様のイムノアッセイにおける場合と同様、健康と病気における異種希釈の影響が少なくて、同じ希釈で実行できることを意味します。すべてのサイトカインの検出下限値 1 pg/mL であったまたはそれが 1 間遠隔以下、ケモカイン、& 50 pg/mL。1 カ月の年齢に TSLP がサンプルの 98% で検出可能でした。
- 試金、4 ° C で一晩鼻のエキスを孵化させなさい。標準メーカーごとプロトコル (材料の表を参照してください) として測定を行います。
3. 統計
- サイトカインおよびケモカイン レベルの正規分布の残差を取得する解析の前にデータを対数変換します。
- サンプルは 1 つ以上のバッチで分析し場合、は、対数変換データを中心に batch-wise のサイトカイン ・ ケモカインのデータを修正します。
- 全体的な平均と元の寸法の単位でデータを取得する逆対数変換を組み込みます。
注: 分析を行うのセットごとに、サイトカインやケモカインのレベルに影響を与える変数を調整することを検討してください。これはサンプリング、兄弟、ホームなどでペットに有害事象、母乳育児における母親の影響 (例えば、アルコール消費量と妊娠中の喫煙) ことがでした。
- 全体的な平均と元の寸法の単位でデータを取得する逆対数変換を組み込みます。
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Discussion
ここで示した手法、体内上部気道粘膜免疫プロファイル以前行われていない時代の 1 ヶ月という早い時期から子供を決定することができました。気道細菌がその存在や周産期曝露と同様、ピコルナ ウイルス7,11, pre が新生児の気道の免疫プロファイルにミラー化されたを見ました。さらに、我々 は高用量ビタミン d の微量栄養素の無作為化試験の作用機構の研究これらの気道の免疫プロファイル データを使用これらの結果とその気道免疫メディエーターの後体内の定量化のための非侵襲的サンプリング手法として粘膜内層の流体技術の有用性に下線を引きます。
次の点がメソッドの実装前に考慮に値する: 粘膜内層流体マトリクスにおけるサイトカインを測定するために電気化学発光のプロトコルによって提供されるようの高感度に基づく免疫測定法の方法論を使用することが重要です。酵素イムノアッセイの使用は吸光度読み出しの推論につながることができます。さらに、鼻と気管支の強い関係がある、上気道免疫プロファイルの測定はまだ制限。粘膜層の上部にサンプリングを行ったしたがって、我々 は流体が主にソル ・層にではなく、ゲルの構成を表すことを期待します。我々 は制限は、これを確認する粘膜レイヤー マーカーを測定しなかった。鼻液分泌に個人差が理論的には、サイトカインやケモカインの検出レベルが左右されます。しかし、できた異なる露出7,8,9,10、11,12, に応えて明確かつさまざまな免疫学的表現型を識別するために鼻汁分泌動態の個体間変動がこの技術のための主要な障害をできない場合があることを示します。テクニックを実行すると、処理中にタンパク質分解を避けるために低温 (氷冷) ですべての手順を実行することが重要です。タンパク質抽出バッファーに推奨される蛋白質のプロテアーゼ阻害薬を追加することによって、タンパク質分解をさらに短縮できます。
それにもかかわらず、この方法の長所だ、非侵襲的かつ簡単に実行、気道粘膜免疫の署名以降、新生児期からの縦断的評価を有効にします。このような情報可能性どのようにローカル気道の免疫システムが成熟すると小児期を通じて、開発大人になって知識を提供します。さらに、サンプリング手法が邪魔されず実行されであろう鼻洗浄を用いた検出不明な希釈率が結果13の有効性を減らす免疫メディエーターの検出が有効になるin vivo の関連、原液方法で。サンプル収集、保管、および共役リリースの市販 (材料の表を参照) で、設計は合成, 繊維, 水酸化ポリエステル メディアを使いました。材料は水性、低分子結合とタンパク質含有サンプルは-80 ° C で保管中に安定しています。材料は非常に吸収性、繊維表面の水濡れ性を高めるために変更されています。
COPSAC2010の研究, 21 のサイトカインとケモカイン先験的ローカル航空路で演技免疫システムの主要な表現型経路を表すために選択されたパネルを選択されています。生後 1 ヶ月でこれらの仲介、TSLP の 1 つだけが検出可能でした。
(例えば、気管支鏡の特定手法を用いた) 下気道から粘膜被覆液を収集する重要なアプリケーションが将来になる下気道の免疫学を評価します。特定の気管支鏡は気管支鏡診断、ローカルの気管支上皮被覆液を集めることができるための新しい手順です。それは被覆ポリエステル繊維プローブ14を利用しています。遠位気道に達すると、プローブは気管支内腔に存在の気管支上皮の水分を吸収する管の先端からプッシュされます。気管支鏡下の特定は、急性呼吸窮迫症候群14,,1516および慢性閉塞性肺疾患17で使用されています。しかし、喘息で既存の問題はプローブが病気による上皮の脆弱性と増加血管新生のために出血を引き起こす可能性があること。気管支特定手順に粘膜内層の流体技術を適用すると、重要な臨床含意の理解に関連して監視および治療、子供と大人の両方でいくつかの急性および慢性の肺疾患の結果を予測するだけでなく、病態の可能性があります。
調停のすべての種類はここで使用される商業システムの多重イムノアッセイ プラットフォームを使用して理論的に測定可能 (材料の表を参照してください)。プラットフォームは、モノクローナル抗体、免疫測定法の開発に適用のペアの任意の調停者の得ることができる高感度かつ正確な定量化のためことができます。このプラットフォームはまたそれをもたらす高精度・分析する流体の pH、温度および粘度の変化に対して感度が低く。
将来的に研究、それが大きな価値があるたとえば、測定する免疫メディエーターの現在のパネルを展開する: 抗菌ペプチド。合計と特定の伊賀。急性相反応物質、C-反応性タンパク質などプロスタグランジン; などの脂質メディエーター脳由来神経栄養因子 (BDNF) などの神経学的なメディエーターです。これは空気中の広汎な露出で体の部位で粘膜の応答システムの性質の詳細なビューを提供できます。提案された仲介人可能性がありますいずれかで測定対象の定量的高感度イムノアッセイによるなど、現在の設定で、ターゲットや不特定多数に向けた核磁気共鳴 (NMR) 分光学 - または液体クロマトグラフィー質量分析計 (LCMS)-ベースのメタボロミクス技術。後者のアプローチは、粘膜内層の流体技術のため明らかにされていない18流体のサンプリングに関していくつかの方法論の欠点、呼気凝縮液メソッドである程度既に実装されています。
新生児期から成人へのサンプリング縦 COPSAC2010コホートで実行がアレルギーや喘息などの気道疾患に付随して演技の直前または免疫学的要因の理解と上がります。このような所見は特定の疾患 endotypes をターゲットと新規治療法の開発と微量元素の調査に重要かもしれないし、薬剤の作用機序無作為化臨床試験。
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Disclosures
すべての著者には、この原稿の内容に関する潜在的な知覚、または実質利益相反の宣言しません。資金の機関設計と試験の実施で、役割はありませんでした。コレクション、管理、およびデータの解釈または、準備、レビュー、および原稿の承認。研究に関与する製薬会社がありませんでした。
Acknowledgments
子どもと家族の COPSAC2010のコホート研究にすべての彼らのサポートとコミットメントに感謝の意を申し上げます。認識し、COPSAC 研究チームとサイトカインとケモカインの測定技術者 Lisbeth Buus Rosholm、デンマーク工科大学から技術の助けのユニークな努力に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| Low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
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