Summary
Dit protocol beschrijft een noninvasive techniek voor de bemonstering van ongestoord mucosal voering vloeistof uit de bovenste luchtwegen. Het kan worden gebruikt voor het uitvoeren van de kwantificering van in vivo niveaus van proteïne bemiddelaars, zoals cytokines en chemokines, bij patiënten van alle leeftijden.
Abstract
Dit protocol beschrijft noninvasive bemonstering van ongestoord bovenste luchtwegen mucosal voering vloeistof. Het geeft ook de extractie procedure gebruikt voorafgaand aan de analyse van immuun bemiddelaars in vloeibare eluaten voor de studie van de actuele immuun handtekening airway, zonder de behoefte aan stimulatie-procedures (vaak gebruikt door andere technieken). De mucosal voering vloeistof wordt bemonsterd op een strook van filtreerpapier geplaatst op het voorste deel van het inferieur turbinate en links voor 2 min van absorptie. Analyten worden geëlueerd van de papieren filters, en de uitgepakte eiwit gebaseerde eluaten worden geanalyseerd door een electrochemiluminescence gebaseerde immunoassay, waardoor voor de kwantificering van de hoge gevoeligheid van laag - en hoog - niveau analyten in hetzelfde monster. Wij de niveaus in vivo 20 voorgeselecteerde immuun bemiddelaars aan specifieke immuun signalering trajecten in de mucosa van de bovenste luchtwegen gerelateerde gemeten, maar de techniek is niet beperkt tot die specifieke deelvenster of bemonstering site. De techniek werd voor het eerst geïmplementeerd in de 7-jarige kinderen van de prospectieve Studies van Kopenhagen op astma in jeugd2000 (COPSAC2000) cohort met allergische rhinitis. Daarna werd het gebruikt in de lengterichting COPSAC2010 geboortecohort, bemonsterd op 1 maand, 2 jaar en 6 jaar oud en in gevallen van acute respiratoire symptomen. Wij met succes verkregen en monsters van 620 (89%) van 700 kinderen van 1-maand-oude geanalyseerd; een paar monsters waren onder de detectiegrens van de assay (gerapporteerd als de mediaan (inter kwartiel bereik (IQR)). Het aantal monsters onder de detectiegrens (d.w.z. van 0 tot het punt van de reeks voor de ondergrens voor detectie) voor elke bemiddelaar was 29 (7.25-119,5). Deze techniek mogelijk maakt van de kwantificering van de in vivo airway mucosal immune profiel vanaf de geboorte, overlangs kan worden toegepast, en kan worden toegepast op studies over het effect van genetica en milieu posities van jeugd, pathofysiologie, endotyping, en monitoring van aandoeningen van de luchtwegen, en ontwikkeling en evaluatie van nieuwe therapieën.
Introduction
De vloeistof van de mucosal voering van de neus maakt het vloeibare deel van het systeem van de bovenste luchtwegen. Het bestaat uit een complexe matrix van bemiddelaars/mediators afgeleid van het samenspel tussen het epithelium en de immuuncellen die deel van de eerste lijn van verdediging uitmaken tegen invasie van micro-organismen. De nasale mucosa is gemakkelijk bereikbaar en er is een sterke functionele en immunologische relatie tussen de neus en de bronchiën1. Dit compartiment is van bijzonder belang met betrekking tot ziekten van de luchtwegen die in de kindertijd, zoals astma en allergische rhinitis, maar ook aan een aantal andere respiratoire aandoeningen vaker later in het leven gelden.
Hier beschrijven we de uitvoering van een methode om te monster ongestoord mucosal voering van de vloeistof uit de neusholte met behulp van een techniek filter papier gebaseerde, noninvasive, alsmede een daaropvolgende extractiemethode, gewend Elueer analyten uit het filtreerpapier voorafgaand aan hun kwantificering op basis van eiwitten. Deze techniek kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te verkrijgen in vivo immuun handtekeningen van zowel gezonde personen en personen met verschillende aandoeningen van de luchtwegen. Bovendien is het mogelijk om posities van belang is voor een specifieke immuun handtekening onderzoeken en te beoordelen of het is een voorspeller of bemiddelaar van latere ontwikkeling van de ziekte.
Mucosal voering vloeistof is eerder verkregen door nasale lavage2, die wordt vaak voorafgegaan door een test op neus uitdaging, waar een allergeen is geïntroduceerd in hoge mate ter stimulering van een ontstekingsreactie3,4. Echter, de techniek van de nasale lavage is niet haalbaar bij jonge kinderen en introduceert een onbekende verdunningsfactor, die de resultaten, als de verdunde bemiddelaar niveaus onder de detectiegrens van de bepaling5 vallen kunnenkunstdiscours. Bovendien, als gevolg van de onbekende verdunningsfactor, de gemeten analyt reacties van de nasale uitdaging-tests zijn niet vergelijkbaar tussen individuen, waardoor het beperken van het nut van de techniek van de nasale lavage in een cohort instellen. Tenslotte allergeen uitdaging is alleen van toepassing bij gesensibiliseerde personen, en andere uitdagingen, zoals de histamine-uitdaging, zijn niet fysiologisch relevant, mogelijk veroorzaakt een plafond effect op vrijlating van de bemiddelaar. Deze problemen worden omzeild in de gepresenteerde filtreerpapier gebaseerde techniek voor mucosal voering vloeistof collectie, waar de individuele secretie van vloeistoffen en niveaus van het analyt zijn de enige factoren die van invloed zijn Inter-individuele variatie.
Tijdens de extractie procedure, worden analyten geëlueerd uit het filtreerpapier na toevoeging van identieke volumes van buffer aan alle samples. Dit gunsten soortgelijke ex vivo verdunning van alle monsters. De buffer van een extractie van albumine gebaseerde isotone zoutoplossing wordt gebruikt voor de extractie stap; het maakt de winning van bemiddelaars op basis van eiwitten en eiwitten om te beperken denaturatie tijdens de daaropvolgende bevriezing van geëlueerd eiwitten vóór kwantificering stabiliseert. Om te voorkomen dat de aantasting van het eiwit tijdens de winning fase, wordt een cocktail van proteaseinhibitors toegevoegd aan de extractie-buffer.
De toepassing van technieken die het mogelijk voor de kwantificering van ongestoord, in vivo maken-gegenereerde immuun bemiddelaars op mucosal sites is van het allergrootste belang. Ten eerste, de mucosal site maakt het grootste immunologisch orgaan in het lichaam. Ten tweede, de nasale locatie is van de primaire site van airborne blootstelling en is nauw verbonden met de respiratoire immunologische compartiment van de longen1. Ten derde, de mogelijkheid van de landmeetkunde dit belangrijke orgaan met een noninvasive techniek opent de mogelijkheid om een overvloed aan informatie op de as van de belangrijke microbe-immuun interactie met betrekking tot gezondheid en ziekte in de luchtwegen. Ten vierde, er zijn vele andere mogelijke toepassingen van deze techniek, zoals het bestuderen van lokale immunologische veranderingen in gerandomiseerde, gecontroleerde proeven van drugs en micronutriënten.
Aanvankelijk wij de techniek in de prospectieve Studies van Kopenhagen op astma in jeugd2000 (COPSAC2000) cohort, waar wij het immuun Profiel van de mucosal voering vloeistof in de 7-jarige kinderen met allergische rhinitis versus gezonde controles13 vastbesloten. Vervolgens, we met succes toegepast deze techniek op de longitudinale COPSAC2010 cohort en beoordeelde airway immuun profielen op 1 maand, 2 jaar en 6 jaar oud en in gevallen van acute respiratoire symptomen. Resultaten van het 1-maand-oude pasgeborenen hebben aangetoond dat belangrijke associaties tussen de immuun handtekening en de milieublootstelling jeugd7,8,9,10,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studies werden uitgevoerd overeenkomstig de leidende beginselen van de verklaring van Helsinki. Goedkeuringen van de ethische commissie voor Kopenhagen (KF 01-289/96 COPSAC2000 ) en H-B-2008-093 voor COPSAC2010en het Deense Agentschap voor de bescherming van de gegevens werden verkregen en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van beide ouders van elk onderwerp vóór inschrijving.
1. experimentele opstelling
- Gebruik van vellen filtreerpapier (vezelig gehydroxyleerde-polyester vellen, zie de Tabel van materialen)6,7.
- Knip stroken 3 x 15 mm in grootte voor een kind 1-maand-oude en in een L-vorm voor oudere kinderen en volwassenen (5 x 20 x 10 mm (korte arm van de L)).
- Plaats een stuk filtreerpapier in elk neusgat van een zuigeling met pincet. Breng het filter op het voorste deel van de turbinate inferior (ongeveer 1 cm in het neusgat voor pasgeborenen en 1,5 cm voor alle andere leeftijden).
- Pasgeborenen plaats op een bed en geef ze suiker water voor comfort.
Opmerking: Voor kinderen van alle andere leeftijden, de bemonstering wordt uitgevoerd gemakkelijkst met het onderwerp gezeten op een stoel. - Voor oudere kinderen, plaatst u de lange arm van de L-vormige filtreerpapier in elk neusgat.
- Pasgeborenen plaats op een bed en geef ze suiker water voor comfort.
- Toepassing van een clip van de neus om de neusgaten ongemak te minimaliseren en te voorkomen dat het verlies van het koffiefilter.
- Verwijder de papieren filters na 2 min van absorptie.
- Plaats het filtreerpapier in gelabelde buizen en bevriezen ze onmiddellijk bij-80 ° C.
- Maak een notitie van geen symptomen van infectie van de luchtwegen komt te staan door het kind op de dag van de bemonstering.
- Eventuele opnemen niezen, persistente huilen, of bloedneus dat tijdens de 2 min van de bemonstering optreedt.
2. kwantificering van Airway immuun-bemiddelaars
- Maximaal 10 willekeurige monsters nemen uit de diepvries. Record de identificatienummers. Houd de monsters op ijs tijdens het hele werkproces.
- Na het ontdooien op ijs, dompel het filtreerpapier (per onderwerp) van beide neusgaten in 300 µL van vers bereide buffer (Zie de Tabel van materialen) met een volledige protease inhibitor tablet (Zie de Tabel van materialen) per 25 mL buffer.
- Regel het volume van de buffer volgens de grootte van het koffiefilter.
- Gebruik 300 µL van buffer voorpapieren filters 3 x 15 mm groot.
- Als slechts één filtreerpapier beschikbaar is, gebruik de helft de buffervolume (150 µL).
- Regel het volume van de buffer volgens de grootte van het koffiefilter.
- Overbrengen van de monsters naar een plaat shaker (400 rpm) voor 5 min. gebruik een timer.
- Overdracht van de vochtige filtreerpapier en assay buffer in de Beker van een celluloseacetaat buis filter (0,22 µm poriegrootte) geplaatst binnen een microcentrifuge buis (Zie de Tabel van de materialen).
- Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 5 min. in een gekoelde centrifuge (bij 4 ° C) te verkrijgen van de gefiltreerde nasale extract in de buis.
- Verwijder de cup en houd de buizen op ijs terwijl aliquoting de nasale extract in de putten van binding aan laag-eiwitten opslag platen (Zie de Tabel van de materialen).
- Bewaren bij-80 ° C tot analyse.
- Bepalen van de concentraties van cytokines en chemokines in de nasale extracten met een hoge gevoeligheid, electrochemiluminesce gebaseerde multiplexed matrix-systeem (Zie de Tabel van de materialen).
Opmerking: Een menselijke 10-plex TH1/TH2 cytokine assay, 9-plex chemokine assay, single-plex IL-17A, TGF-β1 en TSLP werden uitgevoerd hier.- Voor het testen, Incubeer de nasale extracten 's nachts bij 4 ° C. Het gedrag van de meetwaarden verhoudingsgewijs per defabrikant standaard protocol (Zie de Tabel van de materialen).
Opmerking: De immunoassay (Zie de Tabel van materialen) hebben meestal een hoog dynamisch bereik voor meting variërend tussen 1 & 10.000 pg/mL, maar voor sommige testen, het kan 100.000 pg/mL. Dit betekent dat alle monsters kunnen worden uitgevoerd bij de dezelfde verdunning, dus het beperken van de invloed van ongelijke verdunningen in gezonde en zieke onderwerpen, zoals het geval is in andere soortgelijke immunoassay. De ondergrens voor detectie voor alle cytokines was 1 pg/mL of minder, en chemokines, het varieerde van 1 & 50 pg/mL. TSLP was niet aantoonbaar in 98% van de monsters bij 1 maand oud.
- Voor het testen, Incubeer de nasale extracten 's nachts bij 4 ° C. Het gedrag van de meetwaarden verhoudingsgewijs per defabrikant standaard protocol (Zie de Tabel van de materialen).
3. statistieken
- Log-transformatie de gegevens vóór de analyse te verkrijgen normaal verdeelde storingswaarden van de cytokine en chemokinereceptoren niveaus.
- Als de monsters worden geanalyseerd in meer dan één partij, de cytokine en chemokinereceptoren gegevens voor het batchgewijs centreren op de log-getransformeerd gegevens corrigeert.
- Het opnemen van het algemene gemiddelde en de transformatie van de anti-logboek om gegevens in de oorspronkelijke maateenheden te verkrijgen.
Opmerking: Voor elke verzameling van analyses gedaan, kunt u overwegen variabelen die invloed hebben op het niveau van cytokines en chemokines aan te passen. Dit zou moeders invloeden (bijvoorbeeld, de consumptie van alcohol en roken tijdens de zwangerschap), borstvoeding, ongewenste voorvallen tijdens bemonstering, broers en zussen, huisdieren in het huis, enz
- Het opnemen van het algemene gemiddelde en de transformatie van de anti-logboek om gegevens in de oorspronkelijke maateenheden te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met de techniek die hier gepresenteerd, konden we om te bepalen van het in vivo Opper-airway mucosal immune profiel bij kinderen vanaf zo spoedig 1 maand oud, die niet eerder is gebeurd. We hebben vastgesteld dat aanwezigheid van specifieke airway bacteriën en picornaviruses7,11, evenals andere pre en perinatale posities, werden weerspiegeld in de luchtweg immuun Profiel van de pasgeborenen. Bovendien, we deze airway immuun profielgegevens gebruikt bij het bestuderen van het werkingsmechanisme van een gerandomiseerde micronutriënt proces van hoge dosis vitamine D. Deze resultaten wijzen op de geldigheid en het nut van de mucosal voering vloeibare techniek als een noninvasive bemonstering techniek voor de latere in vivo kwantificering van airway immuun bemiddelaars/mediators.
De volgende punten overwegen voorafgaand aan de implementatie van de methode waard zijn: om te meten de cytokines in de mucosal voering vloeistof matrix, is het belangrijk om te gebruiken op basis van hoog-gevoeligheid immunoassay methodologieën, zoals dat verstrekt door electrochemiluminescence protocollen. Het gebruik van enzyme-linked immunoassay kan leiden tot de gevolgtrekking in de extinctie uitlezing. Bovendien, hoewel er een sterke relatie tussen de neus en de bronchiën, de meting van het immuun profiel in de bovenste luchtwegen is nog steeds een beperking. Monstername werd uitgevoerd op het bovenste gedeelte van de mucosal laag; Dus, verwachten we dat de vloeistof vooral de samenstelling van de gel laag, niet de sol laag vormt. We hebben niet meten slijmvliezen laag markeringen om dit te controleren, dat is een beperking. Individuele variaties in nasale vloeistof secretie kunnen in theorie het gedetecteerde niveau van cytokines en chemokines beïnvloeden. Echter heeft men kunnen vaststellen van duidelijke en uiteenlopende immunologische fenotypen in reactie op verschillende belichtingen7,8,9,10,11,12, waaruit blijkt dat tussen individuele variaties in de dynamiek van de nasale afscheiding een groot obstakel voor deze techniek niet mogelijk. Tijdens het uitvoeren van de techniek, is het belangrijk voor het uitvoeren van alle procedures bij lage temperaturen (ijs-gekoeld) om te voorkomen dat de aantasting van het eiwit tijdens de verwerking. Eiwit-afbraak kan verder worden teruggedrongen door de proteaseinhibitors aanbevolen eiwitten toe te voegen aan de eiwit extractie buffer.
Niettemin, de kracht van deze techniek is dat het noninvasive en gemakkelijk uit te voeren, waardoor longitudinale evaluaties van de mucosal airway immuun handtekening uit de neonatale periode en daarna. Dergelijke informatie zou potentieel kennis geven over hoe het lokale airway immuunsysteem rijpt en ontwikkelt tijdens de kindertijd en in volwassenheid. Bovendien, de techniek van de bemonstering wordt uitgevoerd ongestoord en in een in vivo -relevante, onverdund wijze, waardoor de detectie van immuun bemiddelaars die zou zijn geweest niet aantoonbaar met de techniek van de nasale lavage, waar een onbekende verdunningsfactor vermindert de geldigheid van de bevindingen13. We gebruikten een synthetische, vezelig, gehydroxyleerde-polyester medium dat is commercieel beschikbaar (Zie de Tabel van materialen) en is ontworpen voor sample collectie, opslag en geconjugeerde release. Het materiaal is hydrofiele, met lage biomoleculaire binding en eiwithoudende monsters zijn stabiel tijdens de opslag bij-80 ° C. Het materiaal is zeer absorberend, en de vezel oppervlakken zijn gewijzigd ter verbetering van water bevochtigbaarheid.
Wij hebben in de COPSAC2010 -studie, een panel van 21 cytokines en chemokines dat a priori te vertegenwoordigen belangrijke phenotypical trajecten van het immuunsysteem die lokaal in de luchtwegen werden gekozen gekozen. Slechts één van deze bemiddelaars, TSLP, was niet aantoonbaar op een maand oud.
Een belangrijke toekomstige toepassing zou voor het verzamelen van mucosal voering vloeistof van de lagere luchtwegen klem zitten (bijvoorbeeld met behulp van de bronchoscopische microsampling techniek) om te beoordelen van de lagere-airway immunologie. Bronchoscopische microsampling is een nieuwe procedure voor bronchoscopische diagnose, geschikt voor het verzamelen van de lokale bronchiale epitheliale voering vloeistof; het maakt gebruik van een omhulde polyester vezel sonde14. Wanneer de distale luchtwegen zijn bereikt, wordt de sonde uit de schede tip geduwd om te absorberen de bronchiale epitheliale vloeistof aanwezig in de bronchiale lumen. Bronchoscopische microsampling is gebruikt in de acute respiratory distress syndrome14,15,16 en17van de chronische obstructieve longziekte. Bij astma is een bestaande probleem echter dat de sonde kan veroorzaken als gevolg van ziekte-geïnduceerde epitheliale kwetsbaarheid en toegenomen vascularisatie bloeden. De mucosal voering vloeibare techniek toe te passen op de bronchoscopische microsampling procedure zou kunnen hebben belangrijke klinische implicaties in verband met onze kennis van de pathofysiologie, alsmede monitoring, behandelen en het voorspellen van de uitkomst van diverse acute en chronische longziekten in zowel kinderen als volwassenen.
Alle soorten bemiddelaars kunnen theoretisch worden gemeten met behulp van de multiplex immunoassay platform van het handelsstelsel hier gebruikt (Zie de Tabel van de materialen). Het platform zorgt voor de hoge gevoeligheid en nauwkeurige kwantificering van een bemiddelaar waarvoor een paar van monoclonal antilichamen die van toepassing zijn voor de ontwikkeling van een immunoassay kan worden verkregen. Dit platform gaat ook gepaard met hoge precisie en minder gevoeligheid voor variaties van de pH, temperatuur en viscositeit in de vloeistoffen te analyseren.
In de toekomst studies, het zou van grote waarde voor het uitbreiden van het huidige venster van immuun bemiddelaars op de meting van, bijvoorbeeld: antimicrobiële peptiden; totale en specifieke IgA; acute-fase reactanten, zoals C - reactief proteïne; lipide bemiddelaars, zoals prostaglandines; en neurologische bemiddelaars, zoals hersenen-afgeleide neurotrophic factor (BDNF). Dit kan een meer gedetailleerd overzicht van de aard van het reactiesysteem van de cutane op de site van een lichaam voorzien van uitgebreide airborne blootstelling. Ofwel de voorgestelde bemiddelaars kunnen worden gemeten door middel van gerichte kwantitatieve ultragevoelige immunoassay, zoals de in de huidige setup, of door gerichte of irrelevante nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie- of vloeibare chromatografie-Mass Spectrometry (LC-MS)-gebaseerd metabolomica technieken. De laatste benadering is al tot op zekere hoogte al geïmplementeerd met de uitgeademde adem condensaat methode, die heeft enkele methodologische nadelen met betrekking tot de bemonstering van de biofluid18 die niet herkenbaar voor de mucosal voering vloeibare techniek.
Longitudinale bemonstering uit de neonatale periode in de volwassenheid, zal zoals uitgevoerd in de COPSAC2010 cohort, sterk verhogen ons begrip van de onderliggende immunologische factoren voorafgaand aan of gelijktijdig optreden met ziekten van de luchtwegen zoals astma en allergieën. Dergelijke bevindingen kunnen belangrijk zijn voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën gericht op specifieke ziekte endotypes en het onderzoek naar micronutriënt en drug mechanismen van actie in gerandomiseerde klinische proeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen potentiële, echte of waargenomen belangenconflict met betrekking tot de inhoud van dit manuscript. De financieringsinstanties hadden geen enkele rol in het ontwerp en de uitvoering van de studie; de verzameling, het beheer en de interpretatie van de gegevens; of de voorbereiding, beoordeling, en goedkeuring van het manuscript. Geen farmaceutisch bedrijf was betrokken bij de studie.
Acknowledgments
We onze dankbaarheid uiten aan de kinderen en de gezinnen van de COPSAC2010 cohortstudie voor al hun steun en inzet. We erkennen en waarderen van de unieke inspanningen van het onderzoeksteam van COPSAC en de technische hulp van technicus Lisbeth Buus Rosholm, Technische Universiteit van Denemarken, voor het meten van cytokines en chemokines.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| Low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
References
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), Supplement 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), Supplement 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
