Summary
Ce protocole décrit une technique non invasive pour l’échantillonnage des liquides de muqueuse intacte les voies aériennes supérieures. Il peut être utilisé pour effectuer la quantification des niveaux de in vivo des médiateurs de protéines, tels que les cytokines et chimiokines, chez les sujets de tous âges.
Abstract
Ce protocole décrit non invasive d’échantillonnage du fluide de muqueuse des voies respiratoires supérieures non perturbée. Il détaille également la procédure d’extraction utilisée avant l’analyse des médiateurs immunitaires dans les éluats fluides pour l’étude de la signature immunitaire topique des voies aériennes, sans le besoin de procédures de stimulation (souvent utilisé par d’autres techniques). Le fluide de la muqueuse est échantillonné sur une bande de papier filtre placé à la partie antérieure de l’inférieure cornet et est parti pour 2 min de l’absorption. Analytes sont élués des papiers filtre, et les éluats basées sur les protéines extraites sont analysées par un test immunologique electrochemiluminescence-basé, permettant la quantification ultrasensible d’analytes faible - et de haut niveau dans le même échantillon. Nous avons mesuré les concentrations en vivo de 20 présélectionnés médiateurs immunitaires associés à immunitaire spécifique dans la muqueuse des voies respiratoires supérieures, les voies de signalisation, mais la technique n’est pas limitée à ce panneau spécifique ou un site d’échantillonnage. La technique a été tout d’abord mis en œuvre chez les enfants de 7 ans depuis les études prospectives de Copenhague sur l’asthme dans la cohorte2000 (COPSAC2000) l’enfance avec la rhinite allergique. Par la suite, il a été utilisé dans la cohorte naissance de2010 COPSAC longitudinale, échantillonnée à 1 mois, 2 ans et 6 ans et en cas de symptômes respiratoires aigus. Avec succès, nous avons obtenu et analysé des échantillons de 620 (89 %) de 700 enfants de 1 mois ; quelques échantillons étaient inférieures au seuil de détection du test (signalé comme la médiane (interquartile Range (IQR)). Le nombre d’échantillons inférieures à la limite de détection (c'est-à-dire de 0 à la valeur de consigne pour la limite inférieure de détection) pour chaque médiateur avait 29 (7.25-119,5). Cette technique permet la quantification du profil immunitaire muqueux in vivo des voies respiratoires dès la naissance, peut être appliquée longitudinalement et peut être appliquée à des études sur l’effet de la génétique et début de la vie expositions environnementales, physiopathologie, endotyping et surveillance des maladies respiratoires, de développement et évaluation de nouvelles thérapeutiques.
Introduction
Le fluide de la muqueuse du nez constitue la partie liquide du système supérieur-des voies respiratoires. Il se compose d’une matrice complexe de médiateurs dérivés de l’interaction entre l’épithélium et les cellules immunitaires qui constituent la première ligne de défense contre l’invasion des micro-organismes. La muqueuse nasale est facilement accessible, et il y a une forte relation fonctionnelle et immunologique entre le nez et les bronches1. Ce compartiment est d’un intérêt particulier en ce qui concerne les maladies des voies respiratoires qui sont fréquentes dans l’enfance, comme l’asthme et la rhinite allergique, mais aussi à un éventail d’autres troubles respiratoires plus fréquents plus tard dans la vie.
Nous décrivons ici la mise en œuvre d’une méthode pour échantillons non remaniés muqueuse tapissant le fluide de la cavité nasale à l’aide d’une technique non invasive, axée sur le papier filtre, mais aussi une procédure d’extraction ultérieure, utilisé pour éluer les analytes basées sur les protéines des papiers filtre avant leur quantification. Cette technique, par exemple, permet d’obtenir en vivo signatures immunitaires des individus sains et des individus souffrant de diverses maladies respiratoires. En outre, il est possible d’examiner les expositions d’importance pour une signature immunitaire spécifique et d’évaluer si c’est un facteur prédictif ou le médiateur du développement ultérieur de la maladie.
Muqueuse liquide a déjà été obtenu par lavage nasal2, qui est souvent précédée d’un test de provocation nasale, où un allergène est introduit dans des niveaux élevés pour stimuler une réponse inflammatoire3,4. Cependant, la technique de lavage nasal n’est pas réalisable chez le jeune enfant et introduit un facteur de dilution inconnu, qui confond les résultats, comme le médiateur dilué niveaux peuvent tomber au-dessous de la limite de détection du test5. En outre, à cause du facteur de dilution inconnu, les réponses de l’analyte mesurée depuis les tests de provocation nasale ne sont pas comparables entre les individus, ce qui limite l’utilité de la technique de lavage nasal dans une cohorte de réglage. Enfin, défi de l’allergène n’est applicable chez les sujets sensibilisés et autres défis, comme le défi de l’histamine, ne sont pas physiologiquement pertinents pouvant causer un effet de plafond sur la libération de médiateurs. Ces problèmes sont contournés dans la technique de sur filtre papier présentée d’accumulation de liquide muqueuse, où la sécrétion individuelle des fluides et des niveaux de l’analyte sont les seuls facteurs qui influencent la variation inter-individuelle.
Au cours de la procédure d’extraction, analytes sont éluées des papiers filtre après l’ajout des volumes identiques du tampon vers tous les exemples. Cela favorise similaires ex vivo la dilution des échantillons. Un tampon d’extraction de solution saline isotonique axée sur l’albumine est utilisée pour l’étape d’extraction ; Il permet l’extraction des médiateurs à base de protéines et stabilise les protéines afin de limiter la dénaturation pendant au gel des protéines éluées avant quantification. Pour éviter la dégradation des protéines pendant la phase d’extraction, un cocktail d’antiprotéases est ajouté dans le tampon d’extraction.
La mise en œuvre des techniques qui permettent la quantification des non perturbés, en vivo-générés médiateurs immunitaires muqueux sites est de la plus haute importance. Tout d’abord, le site muqueux constitue le plus grand organe immunitaire du corps. En second lieu, la localisation nasale est le principal site d’exposition et est étroitement reliée au compartiment immunologique respiratoire des poumons1. En troisième lieu, la possibilité de cet organe important avec une technique non invasive d’arpentage ouvre la possibilité de fournir une multitude d’informations sur l’axe de l’interaction de microbe-immunitaire importante en ce qui concerne la santé et la maladie des voies respiratoires. Quatrièmement, il existe de nombreuses autres applications possibles de cette technique, tels que les études locales altérations immunologiques dans les essais contrôlés randomisés des médicaments et des micronutriments.
Au départ, nous avons implémenté la technique dans les études prospectives de Copenhague sur l’asthme cohorte de2000 (COPSAC2000) de l’enfance, où nous avons déterminé le profil immunitaire du fluide muqueuse chez les enfants de 7 ans souffrant de rhinite allergique par rapport aux témoins sains,13. Par la suite, nous avons appliqué avec succès cette technique à la cohorte longitudinale de2010 COPSAC et profils immunitaire des voies aériennes mises en recouvrement à 1 mois, 2 ans et 6 ans et en cas de symptômes respiratoires aigus. Résultats des nouveau-nés âgés de 1 mois ont démontré des associations importantes entre la signature immunitaire et de la jeunesse exposition environnementale7,8,9,10,11,12.
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Protocol
Les études ont été menées conformément aux principes directeurs de la déclaration d’Helsinki. Approbation par le Comité d’éthique pour Copenhague (KF 01-289/96 pour COPSAC2000 ) et H-B-2008-093 COPSAC2010et de l’Agence danoise de Protection des données ont été obtenues, et consentement éclairé a été obtenu des deux parents de chaque sujet avant l’inscription.
1. expérimental
- Utiliser des feuilles de papier filtre (fibreux hydroxylés-polyester feuilles, voir la Table des matières)6,7.
- Découpez la bande 3 x 15 mm en taille pour un enfant de 1 mois et en forme de L pour les enfants plus âgés et les adultes (5 x 20 x 10 mm (bras court de la L)).
- Insérez un morceau de papier filtre dans chaque narine d’un nourrisson avec une pincette. Placer le papier filtre à la partie antérieure de l’inférieure cornet (environ 1 cm à l’intérieur de la narine pour les nouveau-nés et 1,5 cm pour tous les autres âges).
- Placer les nouveau-nés sur un lit et leur donner de l’eau sucrée pour le confort.
Remarque : Pour les enfants de tous les autres âges, l’échantillonnage est effectué plus facilement avec le sujet assis sur une chaise. - Pour les enfants plus âgés, insérer le bras long du papier filtre en forme de L dans chaque narine.
- Placer les nouveau-nés sur un lit et leur donner de l’eau sucrée pour le confort.
- Appliquer un pince-nez autour des narines pour minimiser l’inconfort et éviter la perte accidentelle du papier-filtre.
- Retirez le papier-filtre après 2 min d’absorption.
- Placez le papier-filtre à tubes étiquetés et congeler immédiatement à-80 ° C.
- Prenez note de tout symptôme d’infection des voies aériennes, témoigne de l’enfant le jour du prélèvement.
- Enregistrer tout éternuements, pleurs persistants ou épistaxis survenant pendant les 2 min de l’échantillonnage.
2. quantification des médiateurs immunitaires-des voies respiratoires
- Prendre jusqu'à 10 échantillons aléatoires du congélateur. Enregistrer les numéros d’identification. Conserver les échantillons sur la glace pendant tout le processus de travail.
- Après décongélation sur la glace, immerger le papier-filtre (par sujet) dans les deux narines à 300 µL de fraîchement préparée tampon (voir la Table des matières) contenant un tablette d’inhibiteur de la protéase complet (voir la Table des matières) pour 25 mL de tampon.
- Ajuster le volume de tampon selon la taille du papier filtre.
- Utiliser 300 µL de tampon pour papiers filtres 3 x 15 mm de taille.
- Si seulement un papier filtre n’est disponible, utilisez la moitié du volume de tampon (150 µL).
- Ajuster le volume de tampon selon la taille du papier filtre.
- Transférer les échantillons à un agitateur de plaque (400 tr/min) pendant 5 min. utiliser une minuterie.
- Transférer le papier-filtre humide et le tampon dans la coupe d’un filtre de tube d’acétate de cellulose (0,22 µm taille de pore) placé à l’intérieur une micro-centrifugeuse tube (voir la Table des matières).
- Centrifuger à 16 000 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse refroidie (à 4 ° C) pour obtenir l’extrait filtré de nasale dans le tube.
- Retirez la coupelle et garder les tubes sur la glace tout en aliquotage l’extrait nasale dans les puits des plaques de stockage pauvre en protéines de liaison (voir la Table des matières).
- Conserver à-80 ° C jusqu'à l’analyse.
- Déterminer les concentrations de cytokines et de chimiokines dans les extraits nasales à l’aide d’un système à haute sensibilité, axée sur l’electrochemiluminesce réseau multiplexé (voir la Table des matières).
Remarque : Un dosage de 2 cytokines humaines 10-plex TH1/TH9-plex chemokine dosage et single-plex IL-17 a, TGF-β1 et TSLP effectuées ici.- Pour les dosages, incuber les extraits nasales pendant une nuit à 4 ° C. Effectuer les mesures brutes par le fabricant standard du protocole (voir la Table des matières).
Remarque : Les tests immunologiques (voir la Table des matières) ont généralement une plage dynamique élevée de mesure comprise entre 1 & 10 000 pg/mL, mais pour certains tests, il peut être 100 000 pg/mL. Cela signifie que tous les échantillons peuvent être exécutés à la même dilution, ce qui limite l’influence des dilutions dissemblables chez des sujets sains et malades, comme c’est le cas dans les autres immunoessais similaires. La limite inférieure de détection pour tous les cytokines était de 1 pg/mL ou moins et des chimiokines, s’échelonnait de 1 & 50 pg/mL. TSLP n’était pas détectable dans 98 % des échantillons à 1 mois d’âge.
- Pour les dosages, incuber les extraits nasales pendant une nuit à 4 ° C. Effectuer les mesures brutes par le fabricant standard du protocole (voir la Table des matières).
3. les statistiques
- Journal-transformer les données avant l’analyse d’obtenir normalement distribuées de résidus des niveaux de cytokines et chimiokines.
- Si les échantillons sont analysés en plusieurs lots, corriger les données de cytokines et de chimiokines pour batch-wise de centrage sur les données log-transformées.
- Incorporer la moyenne globale et la transformation de anti-journal d’obtenir des données dans les unités de mesure original.
Remarque : Pour chaque série d’analyses faites, pensez ajuster les variables qui influent sur le niveau des cytokines et chimiokines. Cela pourrait être des maternelles (p. ex., la consommation d’alcool et le tabagisme pendant la grossesse), l’allaitement, les effets indésirables lors d’échantillonnage, les frères et sœurs, les animaux domestiques dans maison, etc.
- Incorporer la moyenne globale et la transformation de anti-journal d’obtenir des données dans les unités de mesure original.
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Discussion
Avec la technique présentée ici, nous avons pu déterminer le in vivo haute-voies respiratoires muqueux immunitaire profil chez les enfants dès 1 mois d’âge, qui n’a pas déjà été fait. Nous avons observé que la présence des bactéries des voies spécifiques et picornavirus7,11, ainsi qu’autres pré et périnatales expositions, ont été mis en miroir dans le profil immunitaire des voies aériennes des nouveaux-nés. En outre, nous avons utilisé ces données de profil immunitaire des voies aériennes pour étudier le mécanisme d’action d’un essai randomisé en micronutriments de fortes doses vitamine d. Ces résultats soulignent la validité et l’utilité de la technique de fluide de muqueuse comme une technique non invasive d’échantillonnage pour la quantification subséquent in vivo des médiateurs immunitaires des voies respiratoires.
Les points suivants sont à considérer avant l’implémentation de la méthode : pour mesurer les cytokines dans la matrice liquide de la muqueuse, il est important d’utiliser des méthodologies de base haute-sensibilité immunologique, telles que celles fournies par les protocoles par électrochimiluminescence. L’utilisation de l’enzyme-linked immuno-essais peut conduire à l’inférence dans la lecture de l’absorbance. En outre, bien qu’il existe un lien étroit entre le nez et les bronches, la mesure du profil immunitaire dans les voies aériennes supérieures est toujours une limitation. Prélèvement a été effectué sur la partie supérieure de la couche muqueuse ; ainsi, nous attendons que le fluide représente principalement la composition de la couche de gel, pas le sol. Nous n’avons pas mesuré marqueurs de la couche muqueuse pour confirmer ceci, qui est une limitation. En théorie, les variations individuelles dans les sécrétions nasales peuvent influencer les concentrations détectées de cytokines et de chimiokines. Cependant, nous avons pu identifier claires et divers phénotypes immunologiques en réponse à différentes expositions7,8,9,10,11,12, indiquant que les variations entre individus dans la dynamique de la sécrétion nasale ne peuvent pas être un obstacle majeur pour cette technique. Lors de l’exécution de la technique, il est important d’effectuer toutes les procédures à basse température (refroidissement glace) pour éviter la dégradation des protéines au cours du traitement. La dégradation des protéines peut être réduite davantage en ajoutant des inhibiteurs de la protéase de protéines recommandée dans le tampon d’extraction de protéine.
Néanmoins, la force de cette technique est qu’il est non invasive et facile à exécuter, ce qui permet des évaluations longitudinales de la signature immunitaire muqueuse bronchique à compter de la période néonatale. Ces informations pourraient potentiellement offrait des renseignements sur comment le système immunitaire des voies aériennes locales mûrit et se développe tout au long de l’enfance et à l’âge adulte. En outre, la technique d’échantillonnage est effectuée non perturbés et de manière in vivo -pertinent, non dilué, qui a permis la détection de médiateurs immunitaires qui aurait été indétectable avec la technique de lavage nasal, où un facteur de dilution inconnu réduit la validité des conclusions13. Nous avons utilisé un milieu synthétique, fibreux, hydroxylés-polyester qui est disponible dans le commerce (voir la Table des matières) et est conçu pour le prélèvement, le stockage et libération conjuguée. Le matériel est hydrophile, avec liaison biomoléculaire faible, et les échantillons contenant des protéines sont stables au stockage à-80 ° C. Le matériel est très absorbant, et les surfaces de fibre ont été modifiés pour améliorer la mouillabilité de l’eau.
Dans l’étude de2010 de COPSAC, nous avons sélectionné un panel de 21 de cytokines et de chimiokines qui ont été choisis à priori pour représenter les principaux sentiers phénotypiques du système immunitaire agissant localement dans les voies respiratoires. Seul de ces médiateurs, TSLP, n’était pas décelable à l’âge d’un mois.
Une application future importante serait de recueillir fluide de la muqueuse des voies aériennes inférieures (par exemple, en utilisant la technique de Microprélèvement bronchoscopique) pour évaluer l’immunologie bas-des voies respiratoires. Microprélèvement bronchoscopique est une nouvelle procédure de diagnostic bronchoscopique, capable de recueillir le liquide local doublure épithéliale bronchique ; Il utilise une sonde de gaine en fibre polyester14. Lorsque les voies aériennes distales sont atteints, la sonde est Poussée hors de l’extrémité de la gaine pour absorber le liquide épithélial bronchique présent dans la lumière bronchique. Microprélèvement bronchoscopique a été utilisé dans le syndrome de détresse respiratoire aiguë14,15,16 et17de la bronchopneumopathie chronique obstructive. Toutefois, dans l’asthme, un problème est que la sonde peut provoquer des saignements en raison de la fragilité épithéliale induite par la maladie et de la vascularisation accrue. Appliquant la technique de fluide de muqueuse à la procédure Microprélèvement bronchoscopique pourrait avoir des implications cliniques importantes par rapport à notre compréhension de la physiopathologie, ainsi qu’à la surveillance, le traitement et prédire le résultat de plusieurs maladies pulmonaires aiguës et chroniques chez les enfants et les adultes.
Tous les types de médiateurs peuvent théoriquement être mesurées à l’aide de la plateforme multiplexe immuno-essai du système commercial utilisé ici (voir la Table des matières). La plate-forme permet la quantification ultrasensible et précise de tout médiateur pour lesquels une paire d’anticorps monoclonaux applicables à l’élaboration d’un test immunologique peut être obtenue. Cette plate-forme apporte aussi haute précision et moins sensibles aux variations de pH, la température et la viscosité des fluides à analyser.
À l’avenir des études, il serait très utile pour développer le panneau actuel des médiateurs immunitaires pour mesurer, par exemple : les peptides antimicrobiens ; IgA totale et spécifique ; réactifs de phase aiguë, comme la protéine C - réactive ; médiateurs lipidiques, comme les prostaglandines ; et médiateurs neurologiques, tels que le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF). Cela pourrait fournir une vue plus détaillée de la nature du système de réponse mucosale dans un site de corps avec une vaste exposition. Les médiateurs suggérées peuvent soit calculées au moyen de cibles quantitatives ultrasensible immunoessais, comme dans la configuration actuelle, ou par ciblés ou non ciblés par résonance magnétique nucléaire (RMN) spectroscopie - ou Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS)-métabolomique techniques basées sur. Cette dernière approche a déjà été mis en place dans une certaine mesure avec la méthode de condensats air expiré, qui a quelques inconvénients méthodologiques en ce qui concerne l’échantillonnage des biofluid18 qui ne sont pas évidents pour la technique de fluide de muqueuse.
L’échantillonnage longitudinale de la période néonatale jusqu'à l’âge adulte, interprété dans la cohorte de2010 COPSAC, permettra d’accroître considérablement notre compréhension des facteurs immunologiques sous-jacents qui précède ou agir concomitamment avec les maladies des voies respiratoires comme l’asthme et les allergies. Ces conclusions peuvent être importantes pour le développement de nouvelles thérapeutiques ciblant les maladies spécifiques endotypes et à l’enquête d’oligo-éléments et de mécanismes de médicaments d’action dans les essais cliniques randomisés.
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Disclosures
Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts potentiel, réelles ou imaginaires, au sujet du contenu de ce manuscrit. Les bailleurs de fonds n’avait aucun rôle dans la conception et la réalisation de l’étude ; la collecte, la gestion et l’interprétation des données ; ou la préparation, révision et approbation du manuscrit. Aucune compagnie pharmaceutique n’a participé à l’étude.
Acknowledgments
Nous exprimons notre gratitude aux enfants et aux familles de l’étude de cohorte2010 COPSAC pour tout leur soutien et leur engagement. Nous reconnaissons et apprécions les efforts uniques de l’équipe de recherche COPSAC et l’aide technique de technicien Lisbeth Buus Rosholm, Université technique du Danemark, pour la mesure des cytokines et chimiokines.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| Low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
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