Summary
Este protocolo describe una técnica no invasiva para la toma de muestras del líquido guarnición mucosa de las vías aéreas superiores. Puede ser utilizado para realizar la cuantificación de en vivo los niveles de mediadores de la proteína, tales como citoquinas y quimioquinas, en sujetos de todas las edades.
Abstract
Este protocolo describe el muestreo no invasivo del líquido de revestimiento mucosa vía aérea superior. También detalla el procedimiento de extracción utilizado antes el análisis de mediadores inmunes en eluídos de fluido para el estudio de la firma inmune tópica vía aérea, sin la necesidad de procedimientos de estimulación (de uso frecuente por otras técnicas). El líquido de revestimiento mucoso se muestrea en una tira de papel de filtro colocado en la parte anterior del cornete y a la izquierda por 2 min de absorción inferior. Los analitos se eluyen de los papeles de filtro, y el eluatos basados en proteínas extraídas son analizadas por un inmunoensayo basado en electrochemiluminescence, teniendo en cuenta la alta sensibilidad cuantificación de analitos de bajo y alto nivel en la misma muestra. Medimos los niveles de en vivo de 20 preseleccionados mediadores inmunes relacionadas con inmune específico señalización de vías en la mucosa de las vías respiratorias superiores, pero la técnica no se limita a ese grupo específico o sitio de muestreo. La técnica se implementó por primera vez en niños de 7 años de los estudios prospectivos de Copenhague sobre el asma en cohorte de2000 (COPSAC2000) infancia con rinitis alérgica. Después de eso fue utilizada en la longitudinal COPSAC2010 cohorte, muestreada en 1 mes, 2 años y 6 años de edad y en casos de síntomas respiratorios agudos. Con éxito obtuvieron y analizaron muestras de 620 (89%) de 700 niños de 1 mes de edad, algunas muestras fueron por debajo del límite de detección del ensayo (reportado como mediana (rango del intercuartil (IQR)). El número de muestras por debajo del límite de detección (es decir, desde 0 hasta el punto de set para el límite inferior de detección) para cada mediador fue 29 (7.25-119.5). Esta técnica permite la cuantificación de la vivo en perfil inmune mucosa de las vías respiratorias desde el nacimiento, puede ser aplicada longitudinalmente y puede ser aplicada a estudios sobre el efecto de la genética y vida temprana exposición a riesgos ambientales, Fisiopatología, endotyping y seguimiento de enfermedades respiratorias, desarrollo y evaluación de nuevos tratamientos.
Introduction
El líquido de revestimiento mucosa de la nariz es la parte líquida del sistema de vías respiratorias superiores. Consiste en una matriz compleja de mediadores derivados de la interacción entre el epitelio y las células inmunes que conforman la primera línea de defensa contra la invasión de microorganismos. La mucosa nasal es fácilmente accesible, y hay una fuerte relación funcional e inmunológica entre la nariz y los bronquios1. Este compartimiento es de especial interés en relación con enfermedades de las vías respiratorias que son comunes en la infancia, como el asma y la rinitis alérgica, pero también a una gama de otros desordenes respiratorios más frecuentes más tarde en la vida.
Aquí, describimos la aplicación de un método a la muestra mucosa de revestimiento líquido de la cavidad nasal mediante una técnica no invasiva basada en papel de filtro, así como un procedimiento posterior extracción, utilizados a fin de eluir analitos basados en proteína de los papeles de filtro antes de su cuantificación. Esta técnica puede, por ejemplo, se solía obtener en vivo firmas inmunes de individuos sanos e individuos con enfermedades respiratorias diversas. Además, es posible examinar la exposición de la importancia de una firma inmune específica y evaluar si es un predictor o mediador del desarrollo posterior de la enfermedad.
Mucosa revestimiento líquido previamente se ha obtenido por lavado nasal2, que a menudo es precedido por una prueba de reto nasal, donde se introduce un alérgeno en niveles altos para estimular una respuesta inflamatoria3,4. Sin embargo, la técnica de lavado nasal no es factible en niños y presenta un factor de dilución desconocido, que confunde los resultados, como el mediador diluido los niveles pueden caer por debajo del límite de detección del ensayo5. Por otra parte, debido al factor de dilución desconocido, las respuestas del analito medido de las pruebas de reto nasal no son comparables entre los individuos, limitando la utilidad de la técnica de lavado nasal en una cohorte de ajuste. Finalmente, reto alergénico es solamente aplicable en sujetos sensibilizados, y otros desafíos, como el desafío de histamina, no son fisiológicamente relevantes, potencialmente causando un efecto de techo en la liberación del mediador. Estos problemas son eludidos en la técnica presentada en papel de filtro para guarnición mucosa acumulación de líquido, donde la secreción individual de líquidos y niveles de analito son los únicos factores que influyen en la variación interindividual.
Durante el procedimiento de extracción, los analitos se eluyen de los papeles de filtro después de la adición de idénticos volúmenes de buffer para todas las muestras. Esto favorece la dilución similares ex vivo de todas las muestras. Un tampón de extracción de solución salina isotónica base de albúmina se utiliza para el paso de extracción; permite la extracción de mediadores proteínicos y estabiliza las proteínas para limitar desnaturalización durante el subsecuente congelamiento de proteínas eluídas antes de la cuantificación. Para evitar la degradación de las proteínas durante la fase de extracción, un cóctel de inhibidores de la proteasa se añade el tampón de extracción.
La aplicación de técnicas que permiten la cuantificación de no perturbados, en vivo-mediadores inmunes generados en sitios de la mucosa es de suma importancia. En primer lugar, el sitio de la mucosa constituye el órgano inmunológico más grande en el cuerpo. En segundo lugar, la ubicación nasal es el sitio primario de la exposición aerotransportada y está firmemente conectada al compartimiento inmunológico respiratorio de los pulmones1. En tercer lugar, la posibilidad de examinar este importante órgano con una técnica no invasiva abre la posibilidad para proporcionar una gran cantidad de información en el eje de interacción microbio-inmune importante en relación con la salud y la enfermedad de las vías respiratorias. En cuarto lugar, hay muchas otras posibles aplicaciones de esta técnica, como el estudio de alteraciones inmunológicas locales en ensayos controlados aleatorios de fármacos y micronutrientes.
Inicialmente hemos implementado la técnica en los estudios prospectivos de Copenhague sobre el asma en cohorte de2000 (COPSAC2000) de la infancia, donde se determinó el perfil inmune de mucosa revestimiento líquido en niños de 7 años de edad con rinitis alérgica versus controles sanos13. Posteriormente, hemos aplicado con éxito esta técnica longitudinal cohorte2010 de COPSAC y perfiles inmune vía aérea cuotas en 1 mes, 2 años y 6 años de edad y en casos de síntomas respiratorios agudos. Resultados de los neonatos de 1 mes de edad han demostrado asociaciones importantes entre la firma inmune y la exposición ambiental vida temprana7,8,9,10,11,12.
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Protocol
Los estudios se llevaron a cabo con arreglo a los principios rectores de la declaración de Helsinki. Se obtuvieron las aprobaciones del Comité de ética de Copenhague (KF 01-289/96 COPSAC2000 ) y H-B-2008-093 COPSAC2010y la Agencia de protección de datos de danés, y se obtuvo consentimiento informado de ambos padres de cada sujeto antes de la inscripción.
1. experimental configuración
- Utilizar hojas de papel de filtro (fibrosas hojas de poliéster hidroxilados, véase la Tabla de materiales)6,7.
- Corte tiras de 3 x 15 mm en tamaño para un niño de 1 mes y en forma de L para los niños mayores y adultos (5 x 20 x 10 mm (brazo corto de la L)).
- Inserte un pedazo de papel de filtro en cada fosa nasal de un niño con unas pinzas. Coloque el papel de filtro en la parte anterior del cornete inferior (aproximadamente 1 cm dentro de la fosa nasal en neonatos y 1,5 cm para todas las otras edades).
- Lugar de recién nacidos en una cama y darles agua con azúcar para mayor comodidad.
Nota: Para los niños de otras edades, el muestreo se realiza más fácilmente con el sujeto sentado en una silla. - Para niños mayores, inserte el brazo largo del papel de filtro en forma de L en cada fosa nasal.
- Lugar de recién nacidos en una cama y darles agua con azúcar para mayor comodidad.
- Aplicar un clip de la nariz alrededor de las fosas nasales para minimizar el malestar y evitar la pérdida accidental del papel de filtro.
- Retirar los papeles de filtro después de 2 minutos de la absorción.
- Coloque los papeles de filtro en tubos etiquetados y congelarlas inmediatamente a-80 ° C.
- Tome nota de cualquier síntoma de infección de la vía aérea, demostrado por el niño en el día de muestreo.
- Grabar cualquier estornudo, llanto persistente o epistaxis que ocurre durante los 2 minutos de muestreo.
2. cuantificación de las vías respiratorias inmune-mediadores
- Tomar hasta 10 muestras al azar del congelador. Registrar los números de identificación. Mantener las muestras en hielo durante todo el proceso de trabajo.
- Después de descongelar el hielo, sumergir los papeles de filtro (por tema) de ambos orificios nasales en 300 μL de recién preparado tampón (véase la Tabla de materiales) que contienen una completa proteasa inhibidor de la tableta (véase la Tabla de materiales) por cada 25 mL de tampón.
- Ajustar el volumen de tampón según el tamaño del papel de filtro.
- Utilizar 300 μL de tampón para papeles de filtro 3 x 15 mm de tamaño.
- Si sólo hay un papel de filtro, use la mitad del volumen de buffer (150 μL).
- Ajustar el volumen de tampón según el tamaño del papel de filtro.
- Transferir las muestras a un vibrador de placa (400 rpm) por 5 min uso un temporizador.
- Transferir el papel filtro húmedo y tampón de ensayo en la taza de un filtro de tubo de acetato de celulosa (tamaño de poro de 0,22 μm) en una microcentrífuga del tubo (véase la Tabla de materiales).
- Centrifugar a 16.000 x g por 5 min en una centrífuga refrigerada (a 4 ° C) para obtener el extracto filtrado nasal en el tubo.
- Retire la taza y mantener los tubos en hielo mientras tomar el extracto de la nasal en los pocillos de las placas de almacenamiento de unión a proteínas de baja (véase la Tabla de materiales).
- Almacenar a-80 ° C hasta su análisis.
- Determinar las concentraciones de citoquinas y quimioquinas en los extractos nasales usando un sistema de alta sensibilidad, basado en electrochemiluminesce arreglo multiplexados (véase la Tabla de materiales).
Nota: Un humano 10-plex TH1/TH2 cytokine ensayo, ensayo de chemokine 9-plex y plex solo IL-17A, TGF-β1 y TSLP se realizaron aquí.- Para los ensayos, incubar los extractos nasal durante la noche a 4 ° C. Realizar las medidas por el fabricante estándar protocolo (véase la Tabla de materiales).
Nota: Los inmunoensayos (véase la Tabla de materiales) tienen un alto rango dinámico de medición entre 1 & 10.000 pg/mL, pero para algunos ensayos, puede ser 100 000 pg/mL. Esto significa que todas las muestras se pueden ejecutar en la misma dilución, limitando la influencia de las diferentes diluciones en sujetos sanos y enfermos, como es el caso en otros inmunoensayos similares. El límite inferior de detección para todas las citocinas era 1 pg/mL o menos y de quimiocinas, osciló entre 1 & 50 pg/mL. TSLP no era perceptible en el 98% de las muestras en 1 mes de edad.
- Para los ensayos, incubar los extractos nasal durante la noche a 4 ° C. Realizar las medidas por el fabricante estándar protocolo (véase la Tabla de materiales).
3. estadísticas
- Transformación de registro de los datos antes del análisis para obtener residuos distribuidos normalmente de los niveles de citoquinas y quimioquinas.
- Si las muestras son analizadas en más de un lote, corregir los datos de citoquinas y quimioquinas para batch-wise que se centra en los datos de registro-transformada.
- Incorporar la media general y registro de la transformación para obtener datos en las unidades originales de medición.
Nota: Para cada conjunto de análisis realizados, Plantéese ajustar las variables que afectan el nivel de citoquinas y quimioquinas. Esto podría ser influencias maternas (p. ej., consumo de alcohol y fumar durante el embarazo), lactancia materna, los eventos adversos durante el muestreo, hermanos, mascotas en el hogar, etc.
- Incorporar la media general y registro de la transformación para obtener datos en las unidades originales de medición.
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Discussion
Con la técnica presentada aquí, hemos sido capaces de determinar el en vivo vías respiratorias superiores mucosa inmune perfil en niños desde 1 mes de edad, que no se ha hecho previamente. Observamos que esa presencia de bacterias de las vías respiratorias específicas picornavirus7,11, así como pre y otras exposiciones perinatales, se reflejaron en el perfil inmune de las vías respiratorias de los recién nacidos. Además, utilizamos estos datos de perfil inmune de las vías respiratorias para estudiar el mecanismo de acción de un ensayo seleccionado al azar de micronutrientes de altas dosis de vitamina D. Estos resultados subrayan la validez y utilidad de la técnica de líquido de revestimiento mucoso como una técnica de muestreo no invasivo para la cuantificación posterior en vivo de mediadores inmunes de las vías respiratorias.
Los siguientes puntos son merece la pena considerar antes de implementación del método: para medir citoquinas en la mucosa revestimiento líquido matriz, es importante utilizar metodologías de inmunoensayo basado en la sensibilidad alta, como la establecida por electrochemiluminescence protocolos. El uso de inmunoanálisis ligado a enzimas puede conducir a la inferencia en la lectura de absorbancia. Además, aunque existe una fuerte relación entre la nariz y los bronquios, la medición del perfil inmune de las vías aéreas superiores sigue siendo una limitación. Muestreo se realizó en la parte superior de la capa mucosa; por lo tanto, esperamos que el líquido representa principalmente la composición de la capa de gel, no en el de sol. No medimos los marcadores de capa mucosa para confirmar esto, que es una limitación. Las variaciones individuales en la secreción de fluido nasal pueden en teoría influyen en los niveles detectados de citoquinas y quimioquinas. Sin embargo, nosotros hemos sido capaces de identificar claros y distintos fenotipos inmunológicos en respuesta a diferentes exposiciones7,8,9,10,11,12, indicando que las variaciones interindividuales en la dinámica de la secreción nasal pueden no ser un obstáculo importante para esta técnica. Al realizar la técnica, es importante realizar todos los procedimientos a bajas temperaturas (enfriado con hielo) para evitar la degradación de las proteínas durante el proceso. Degradación de las proteínas se puede reducir mediante la adición de inhibidores de la proteasa de la proteína recomendada para el tampón de extracción de proteína.
Sin embargo, la fuerza de esta técnica es que es no invasivo y fácil de realizar, lo que permite evaluaciones longitudinales de la firma inmune de la mucosa de las vías respiratorias desde el período neonatal y más adelante. Dicha información podría potencialmente proporcionar conocimiento sobre cómo local en las vías respiratorias sistema inmunitario madura y se desarrolla a lo largo de la infancia y en la edad adulta. Además, la técnica de muestreo se realiza sin perturbaciones y en vivo -una manera relevante, sin diluir, que permitió la detección de mediadores inmunes que habrían sido indetectables con la técnica de lavado nasal, donde un factor de dilución desconocido reduce la validez de resultados13. Se utilizó un medio sintético, fibroso, poliester hidroxilados que es comercialmente disponible (véase la Tabla de materiales) y está diseñado para la recogida de muestras, almacenamiento y liberación conjugado. El material es hidrofílico, con el atascamiento bajo biomolecular, y muestras que contienen proteínas son estables durante el almacenamiento a-80 ° C. El material es muy absorbente, y las superficies de fibra han sido modificadas para mejorar la mojabilidad de agua.
En el estudio de2010 COPSAC, hemos seleccionado un panel de 21 citoquinas y quimiocinas que fueron elegidos a priori para representar vías fenotípicas importantes del sistema inmune, actuando localmente en las vías respiratorias. Sólo uno de estos mediadores, TSLP, no era perceptible en un mes de edad.
Una aplicación importante en el futuro sería recoger líquido de revestimiento mucosa de las vías aéreas inferiores (por ejemplo, mediante la técnica broncoscópica microsampling) para evaluar la inmunología de las vías respiratorias inferiores. Microsampling broncoscópico es un nuevo procedimiento para el diagnóstico broncoscópico, capaz de recoger el líquido de revestimiento epitelial bronquial local; utiliza una fibra de poliester forrado sonda14. Cuando se alcanzan las vías aéreas distales, la sonda es empujada fuera de la punta de la vaina para absorber el líquido epitelial bronquial presente en el lumen bronquial. Microsampling broncoscópica se ha utilizado en el síndrome de dificultad respiratoria aguda14,15,16 y17de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Sin embargo, en el asma, un problema existente es que la sonda puede provocar hemorragias debido a la fragilidad epitelial inducida por la enfermedad y mayor vascularización. Aplicación de la técnica fluido de revestimiento mucosa el procedimiento broncoscópico microsampling podría tener importantes implicaciones clínicas en relación a nuestra comprensión de la Fisiopatología, así como seguimiento, tratamiento y predecir el resultado de varias enfermedades pulmonares agudas y crónicas en niños y adultos.
Todos los tipos de mediadores teóricamente pueden ser medidos utilizando la plataforma de inmunoensayo múltiple del sistema comercial utilizado aquí (véase la Tabla de materiales). La plataforma permite la cuantificación de alta sensibilidad y precisión de cualquier mediador para el cual se puede obtener un par de anticuerpos monoclonales aplicables al desarrollo de un inmunoensayo. Esta plataforma también trae consigo la alta precisión y menos sensibilidad a las variaciones de pH, temperatura y viscosidad en los fluidos a ser analizados.
En el futuro los estudios, sería de gran valor para expandir el panel actual de mediadores inmunes a la medida de, por ejemplo: péptidos antimicrobianos; IgA total y específica; reactantes de fase aguda, como la proteína C reactiva; mediadores lípidos, tales como las prostaglandinas; y mediadores neurológicos, como el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Esto podría proporcionar una vista más detallada de la naturaleza del sistema de respuesta mucosa en un sitio del cuerpo con amplia exposición aerotransportada. Los mediadores sugeridos pueden o bien medirse mediante inmunoensayos cuantitativos dirigidos de alta sensibilidad, como en la configuración actual, o dirigidas o no focalizados resonancia magnética Nuclear (NMR) espectroscopia o líquido cromatografía-espectrometría de masas (LC-MS)-basado en técnicas de metabolómica. Este último enfoque ha sido implementado ya en cierta medida con el método de condensado de aire espirado, que tiene algunos inconvenientes metodológicos con respecto a la toma de muestras del biofluid18 que no son aparentes para la técnica de fluido de revestimiento de mucosa.
Muestreo longitudinal desde el período neonatal hasta la edad adulta, ya que se realiza en la cohorte de2010 COPSAC, aumentarán en gran medida nuestra comprensión de los factores inmunológicos subyacentes anteriores o actuar concomitante con enfermedades de las vías respiratorias como el asma y las alergias. Tales resultados pueden ser importantes para el desarrollo de la novela terapéutica dirigida a endotypes de la enfermedad específica y a la investigación de micronutrientes y mecanismos de fármaco de acción en ensayos clínicos aleatorizaron.
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Disclosures
Todos los autores no declaran potencial, percibida o real conflicto de intereses en relación con el contenido de este manuscrito. Las agencias de financiamientos no tuvo ningún papel en el diseño y realización del estudio; la recopilación, gestión e interpretación de los datos; o la preparación, revisión y aprobación del manuscrito. Ninguna empresa farmacéutica ha participado en el estudio.
Acknowledgments
Expresamos nuestro agradecimiento a los niños y las familias del estudio de cohorte de2010 COPSAC por todo su apoyo y compromiso. Reconocemos y apreciamos los esfuerzos únicos del equipo de investigación COPSAC y la ayuda técnica de técnico Lisbeth Buus Rosholm, Universidad técnica de Dinamarca, para la medición de citoquinas y quimioquinas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| Low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
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