Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Technik für die Entnahme von ungestörten Schleimhaut Flüssigkeit aus den oberen Atemwegen. Es kann verwendet werden, die Quantifizierung der in Vivo -Level von Protein Mediatoren wie Zytokine und Chemokine, bei Patienten aller Altersgruppen durchführen.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt nicht-invasive Probenahme ungestört oberen Atemwegen Schleimhaut Flüssigkeit. Es beschreibt auch die Extraktionsverfahren vor der Analyse von immun Mediatoren in Fluid Eluate für die Untersuchung der Atemwege topische immun Signatur, ohne die Notwendigkeit einer Stimulation-Verfahren (oft durch andere Techniken verwendet). Die Schleimhaut-Flüssigkeit wird auf einem Streifen Filterpapier aufgenommen am vorderen Teil der unteren Nasenmuschel und Links für 2 min der Absorption. Analyten aus der Filterpapiere eluiert werden, und die extrahierten Protein-basierten Eluate werden durch eine Electrochemiluminescence-basierte Immunoassay, zulassend die hochempfindlichen Quantifizierung von Low und high - level Analyten in der gleichen Probe analysiert. Wir maßen die in Vivo -Level 20 vorausgewählten immun Mediatoren, die im Zusammenhang mit spezifischen immunen Signalwege in der Schleimhaut der oberen Atemwege, aber die Technik ist nicht beschränkt auf, dass bestimmte Panel oder Sampling-Website. Die Technik wurde zuerst in 7-Year-Old Kinder aus dem Kopenhagen Prospektivstudien über Asthma im Kindesalter2000 (COPSAC2000) Kohorte mit allergischer Rhinitis umgesetzt. Er diente danach in der Längsrichtung COPSAC2010 Geburt Kohorte, abgetastet, 1 Monat, 2 Jahre und 6 Jahre alt und in Fällen von akuten respiratorischen Symptomen. Erhielten wir erfolgreich und analysierten Proben von 620 (89 %) von 700 1-Monat-alten Kindern, ein paar Proben waren unterhalb der Assay-Nachweisgrenze (als der Median (Inter Quartil Range (IQR)) berichtet. Die Anzahl der Proben unter der Nachweisgrenze (d.h. von 0 auf den Sollwert für die untere Grenze der Erkennung) für jeden Vermittler war 29 (7,25-119,5). Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung der in Vivo Atemwege Schleimhaut immun Profil von Geburt, längs aufgebracht werden und auf Studien über die Wirkung von Genetik und frühes Leben Umwelteinflüsse, Pathophysiologie, Endotyping und Überwachung von Erkrankungen der Atemwege, Entwicklung und Evaluierung neuer Therapeutika angewendet werden kann.
Introduction
Die Flüssigkeit der Schleimhaut der Nase macht sich der flüssige Teil des Systems der oberen Atemwege. Es besteht aus einer komplexen Matrix von Mediatoren aus dem Wechselspiel zwischen dem Epithel und der immunen Zellen, aus denen sich die erste Linie der Verteidigung gegen eindringende Mikroorganismen abgeleitet. Die Nasenschleimhaut ist leicht zugänglich, und es gibt eine starke funktionale und immunologische Beziehung zwischen der Nase und Bronchien1. Dieses Fach ist von besonderem Interesse in Bezug auf Krankheiten der Atemwege, die häufig in der Kindheit, wie Asthma und allergische Rhinitis, sondern auch zu einer Reihe von anderen Erkrankungen der Atemwege häufiger später im Leben.
Hier beschreiben wir die Durchführung eines Verfahrens zur Probe ungestört Schleimhaut Futter Flüssigkeit aus der Nasenhöhle ein Filterpapier-basierte, nicht-invasive Technik, sowie eine anschließende Extraktionsverfahren, verwendet, um Protein-basierten Analyten aus der Filterpapiere vor deren Quantifizierung eluieren. Diese Technik kann, z. B. zur in Vivo immun Unterschriften von gesunden Probanden und Patienten mit verschiedenen Erkrankungen der Atemwege zu erhalten. Darüber hinaus ist es möglich, Aufnahmen von Bedeutung für eine bestimmte immun Signatur zu prüfen und zu bewerten, ob es ein Prädiktor oder Vermittler der späteren Entwicklung der Krankheit ist.
Schleimhaut Flüssigkeit wurde zuvor durch nasale Lavage2, erteilt, die oft durch eine nasale Challenge-Test wo ein Allergen in hohe vorausgegangen ist Förderung eine entzündliche Reaktion3,4eingeführt. Jedoch die nasale Lavage-Technik ist nicht möglich bei Kleinkindern und stellt eine unbekannte Verdünnungsfaktor, die die Ergebnisse als der verdünnte Mediator verwirrt, die Ebenen unterhalb der Nachweisgrenze der Assay5fallen können. Aufgrund der unbekannten Verdünnungsfaktor sind die gemessenen Analyten Antworten aus der nasale Provokationstests nicht vergleichbar zwischen den Individuen, wodurch die Nützlichkeit der nasale Lavage Technik in einer Kohorte Einstellung begrenzt. Schließlich Allergen Herausforderung ist nur anwendbar bei sensibilisierten Personen und andere Herausforderungen, wie die Histamin-Herausforderung sind nicht physiologisch relevanten, verursachen eine Decke Wirkung auf Mittler-Version. Diese Probleme werden in der vorgestellten Filterpapier-basierte Technik für Schleimhaut Flüssigkeitsansammlung, wo die einzelnen Sekretion von Flüssigkeiten und Analyten Ebenen sind die einzigen Faktoren, die Einfluss auf interindividuelle Varianz, umgangen.
Während der Extraktionsverfahren sind Analyten aus der Filterpapiere nach Zugabe von identischen Volumen des Puffers auf alle Proben eluiert. Dies begünstigt ähnliche ex Vivo Verdünnung aller Proben. Ein Extraktionspuffer Albumin-basierte isotonische Salzlösung dient dem Extraktionsschritt; Es ermöglicht die Gewinnung von Protein-basierten Mediatoren und stabilisiert Proteine um Denaturierung während der nachfolgenden Einfrieren der eluierten Proteine vor der Quantifizierung zu begrenzen. Zur Vermeidung von Proteinabbau während der Extraktion-Phase wird ein Cocktail von Protease-Inhibitoren die Extraktionspuffer hinzugefügt.
Die Umsetzung der Techniken, mit denen für die Quantifizierung von ungestört, in-Vivo-generierten immun Mediatoren an Schleimhaut Standorten ist von größter Bedeutung. Erstens macht die Schleimhaut Website das größte immunologische Organ im Körper. Zweitens ist die nasale Lage am Hauptstandort in der Luft ausgesetzt und in die Atemwege immunologische Abteil der Lunge1eng verbunden ist. Drittens, eröffnet die Möglichkeit der Vermessung dieses wichtigen Organs mit einer nicht-invasive Technik die Möglichkeit bieten eine Fülle von Informationen auf der Achse wichtig Mikrobe-immun-Interaktion in Bezug auf Gesundheit und Krankheit in den Atemwegen. Viertens gibt es viele weitere Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik, wie z. B. lokale immunologische Veränderungen in randomisierten, kontrollierten Studien von Medikamenten und Mikronährstoffen zu studieren.
Wir umgesetzt zunächst die Technik in der Kopenhagener Prospektivstudien zu Asthma Kindheit2000 (COPSAC2000) Kohorte, wo wir das immun Profil der Schleimhaut Flüssigkeit bei 7 Jahre alten Kindern mit allergischer Rhinitis im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen13bestimmt. Anschließend bewarb sich wir erfolgreich diese Technik längs-COPSAC2010 Kohorte und bewerteten Atemwege immun Profile 1 Monat, 2 Jahre und 6 Jahre alt und in Fällen von akuten respiratorischen Symptomen. Ergebnisse von 1-Monat-alten Neugeborenen haben gezeigt, dass wichtige Zusammenhänge zwischen immun Signatur und frühes Leben Umweltexposition7,8,9,10,11,12.
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Protocol
Die Studien wurden im Einklang mit den Leitprinzipien der Deklaration von Helsinki. Genehmigungen von der Ethik-Kommission für Kopenhagen (KF 01-289/96 für COPSAC2000 ) und H-B-2008-093 COPSAC2010und der dänischen Datenschutzbehörde stammen, und schriftliche Einwilligung wurde von beiden Elternteilen jedes Fach vor der Einschreibung.
1. Versuchsaufbau
- Verwenden Sie Filter Papierbögen (faserige hydroxylierten Polyester Bettwäsche, siehe die Tabelle der Materialien)6,7.
- Schneiden Sie Streifen 3 x 15 mm in der Größe für ein 1 Monat altes Kind und in einer L-Form für ältere Kinder und Erwachsene (5 x 20 x 10 mm (kurzen Arm des L)).
- Legen Sie ein Stück Filtrierpapier in jedes Nasenloch eines Säuglings mit Pinzette. Platzieren Sie das Filterpapier auf den vorderen Teil der unteren Nasenmuschel (ca. 1 cm in das Nasenloch für Neugeborene und 1,5 cm für alle anderen Altersgruppen).
- Legen Sie Neugeborenen auf ein Bett und Ihnen Sie Zuckerwasser für Komfort.
Hinweis: Für Kinder anderer Altersgruppen, wird die Probenahme am leichtesten mit dem Thema auf einem Stuhl sitzend durchgeführt. - Einsetzen Sie für ältere Kinder den langen Arm des L-förmigen Filterpapiers in jedes Nasenloch.
- Legen Sie Neugeborenen auf ein Bett und Ihnen Sie Zuckerwasser für Komfort.
- Wenden Sie eine Nasenklammer um die Nasenlöcher, die Beschwerden zu minimieren und den versehentlichen Verlust des Filterpapiers zu vermeiden.
- Entfernen Sie nach 2 min der Absorption der Filterpapiere.
- Legen Sie die Filterpapiere in beschrifteten Rohre und friere sie sofort bei-80 ° C.
- Notieren Sie sich irgendwelche Anzeichen einer Infektion der Atemwege des Kindes am Tag der Probenahme gezeigt.
- Zeichnen Sie alle Niesen, anhaltende schreien oder Nasenbluten, die auftritt, während die 2 min der Probenahme.
2. Quantifizierung der Atemwege immun-Mediatoren
- Nehmen Sie bis zu 10 Stichproben aus der Tiefkühltruhe. Notieren Sie die ID-Nummern. Halten Sie die Proben auf Eis während des gesamten Arbeitsprozesses.
- Nach dem Auftauen auf Eis tauchen die Filterpapiere (pro Fach) aus beiden Nasenlöchern in 300 µL der frisch zubereiteten Puffern (siehe die Tabelle der Materialien) enthält eine komplette Protease Inhibitor Tablette (siehe die Tabelle der Materialien) pro 25 mL des Puffers.
- Stellen Sie die Lautstärke des Puffers entsprechend der Größe des Filterpapiers.
- Verwenden Sie 300 µL Puffer für Filtertüten 3 x 15 mm groß.
- Wenn nur ein Filterpapier verfügbar ist, verwenden Sie die Hälfte das Puffervolumen (150 µL).
- Stellen Sie die Lautstärke des Puffers entsprechend der Größe des Filterpapiers.
- Übertragen Sie den Proben auf eine Platte Shaker (400 u/min) für 5 min. Einsatz einen Timer.
- Übertragen der feucht Filterpapiere und Testpuffer in der Tasse eine Cellulose-Acetat-Kerzenfilter (0,22 µm Porengröße) platziert in einem Microcentrifuge Schlauch (siehe die Tabelle der Materialien).
- Zentrifugieren Sie bei 16.000 x g für 5 min in einer gekühlten Zentrifuge (bei 4 ° C), um gefilterte nasale Extrakt in das Rohr zu erhalten.
- Entfernen Sie die Tasse und halten Sie die Rohre auf dem Eis während Aliquotierung des nasalen Extraktes in die Vertiefungen der niedrig-Proteinbindung Speicherfolien (siehe die Tabelle der Materialien).
- Bis zur Analyse bei-80 ° C lagern.
- Die Konzentrationen der Zytokine und Chemokine in den nasalen Auszügen mit Hilfe eines hochempfindlichen, Electrochemiluminesce-basierte gemultiplexten Array Systems zu bestimmen (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Eine menschliche 10-Plex TH1/TH2 Zytokin-Assay, 9-Plex-Chemokin-Assay, und Einzel-Plex IL-17A, TGF-β1 und TSLP wurden hier durchgeführt.- Inkubieren Sie für die Assays die nasale Extrakte über Nacht bei 4 ° c Führen Sie die Messungen wie pro die standard Hersteller Protokoll (siehe die Tabelle der Materialien).
Hinweis: Die Immunoassays haben (siehe die Tabelle der Materialien) in der Regel einen hohen Dynamikbereich für Messung zwischen 1 & 10.000 Pg/mL, aber für einige Tests kann es 100.000 Pg/mL. Dies bedeutet, dass alle Proben bei der gleichen Verdünnung, wodurch des Einfluss der unterschiedlichen Verdünnungen in gesunden und kranken Personen, wie der Fall in anderen ähnlichen Immunoassays ist ausgeführt werden können. Die untere Grenze der Erkennung für alle Zytokine wurde 1 Pg/mL oder weniger, und für Chemokine, es lag zwischen 1 & 50 Pg/mL. TSLP war nicht nachweisbar in 98 % der Proben 1 Monat alt.
- Inkubieren Sie für die Assays die nasale Extrakte über Nacht bei 4 ° c Führen Sie die Messungen wie pro die standard Hersteller Protokoll (siehe die Tabelle der Materialien).
(3) Statistiken
- Log-Transformation der Daten vor der Analyse, normalverteilte Residuen der Cytokine und Chemokin Ebene zu erhalten.
- Wenn die Proben in mehr als einer Charge analysiert werden, korrigieren Sie die Cytokine und Chemokin Daten für chargenweise Zentrierung auf die Log-transformierten Daten.
- Der Gesamtmittelwert und Anti-logarithmische Transformation zum Abrufen von Daten in der ursprünglichen Maßeinheiten zu integrieren.
Hinweis: Für jeden Satz von Analysen durchgeführt, betrachten Sie Anpassung der Variablen, die das Niveau der Zytokine und Chemokine beeinflussen. Dies könnte mütterlichen Einflüssen (z. B. Alkoholkonsum und Rauchen während der Schwangerschaft), stillen, unerwünschte Ereignisse während der Probenahme, Geschwister, Haustiere im Haus, etc.
- Der Gesamtmittelwert und Anti-logarithmische Transformation zum Abrufen von Daten in der ursprünglichen Maßeinheiten zu integrieren.
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Discussion
Mit der hier vorgestellten Technik konnten wir das in Vivo obere Atemwege Schleimhaut immun Profil bei Kindern bereits ab 1 Monat alt, zu bestimmen, die nicht zuvor getan wurde. Wir haben beobachtet, dass das Vorhandensein von spezifischen Atemwege Bakterien und Picornaviren7,11, sowie andere Pre und perinatale Expositionen im Atemweg immun Profil von den Neugeborenen gespiegelt wurden. Darüber hinaus haben wir diese Atemwege immun Profildaten studieren den Wirkmechanismus einer randomisierten Mikronährstoff-Studie von hoch dosierten Vitamin d. Diese Ergebnisse unterstreichen die Gültigkeit und den Nutzen der Darmschleimhaut Fluid Technik als eine nicht-invasive Probenahme-Technik für die anschließende in Vivo Quantifizierung der Atemwege immun Mediatoren.
Folgende Punkte sind vor der Methodenimplementierung eine Überlegung: um Zytokine in der Darmschleimhaut flüssigen Matrix zu messen, ist es wichtig, hohe Empfindlichkeit-basierende Immunoassay Methoden, wie die Electrochemiluminescence Protokolle zu verwenden. Die Verwendung von Enzym-linked Immunoassays führen zu Inferenz in der Extinktion auslesen. Darüber hinaus gibt es zwar eine starke Beziehung zwischen der Nase und Bronchien, ist die Messung des immun-Profils in den oberen Atemwegen noch eine Einschränkung. Probenahme erfolgte auf dem oberen Teil von der Darmschleimhaut; Daher erwarten wir, dass die Flüssigkeit vor allem die Zusammensetzung der Gelschicht, nicht die Sol-Schicht darstellt. Wir haben nicht messen Schleimschicht Markierungen, um dies zu bestätigen, das ist eine Einschränkung. Individuelle Variationen in nasale Sekretion Fluid können theoretisch die erkannten Ebenen der Zytokine und Chemokine beeinflussen. Jedoch konnten wir identifizieren klare und unterschiedlichen immunologische Phänotypen in Reaktion auf unterschiedlichen Belichtungen7,8,9,10,11,12, darauf hinweist, dass die interindividuelle Unterschiede in der Dynamik der nasale Sekretion möglicherweise kein großes Hindernis für diese Technik. Während der Durchführung der Technik, ist es wichtig, alle Eingriffe bei niedrigen Temperaturen (Eis gekühlt) Proteinabbau während der Verarbeitung zu vermeiden. Proteinabbau kann weiter reduziert werden, indem die empfohlenen Protein Proteaseinhibitoren zu dem Protein Extraktionspuffer.
Die Stärke dieser Technik ist allerdings, dass ist einfach durchzuführen, und nicht-invasive, longitudinale Bewertungen der Schleimhaut der Atemwege immun Signatur aus der Neugeborenenperiode und ab damit. Solche Informationen könnten potenziell wissen auf wie die lokalen Atemwege Immunsystem reift und entwickelt sich während der gesamten Kindheit und bis ins Erwachsenenalter. Darüber hinaus die Entnahmetechnik erfolgt ungestört und in einer in Vivo -unverdünnt, relevante Art und Weise, die die Erkennung von immun Mediatoren, die hätte nicht nachweisbar mit der nasale Lavage-Technik, wo ein unbekannter Faktor reduziert die Gültigkeit der Ergebnisse13ermöglichte. Wir haben eine synthetische, faserige, hydroxylierten Polyester Medium, das ist im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien) und dient für Sample-Sammlung, Speicherung und konjugierte Freisetzung. Das Material ist hydrophil, mit niedrigen biomolekularen Bindung und Protein-haltigen Proben sind stabil während der Lagerung bei-80 ° C. Das Material ist sehr saugfähig und die Faseroberflächen wurden geändert, um Wasser Benetzbarkeit verbessern.
In der COPSAC-Studie2010 wählten wir eine Gruppe von 21 Zytokine und Chemokine, die a priori darzustellende große phänotypische Wege des Immunsystems handeln lokal in den Atemwegen ausgewählt wurden. Einen Monat alt war nicht nur eines dieser Mediatoren, TSLP, nachweisbar.
Eine wichtige zukünftige Anwendung wäre, Schleimhaut Flüssigkeit aus den unteren Atemwegen (z. B. durch die Verwendung der bronchoskopischen Microsampling Technik) zu sammeln, zu beurteilen, untere Atemwege Immunologie. Bronchoskopische Microsampling ist ein neues Verfahren zur bronchoskopischen Diagnostik, sammeln von lokalen bronchiale epithelialen Auskleidung Flüssigkeit; Es nutzt einen ummantelten Polyester-Faser-Sonde-14. Wenn die distalen Atemwege erreicht sind, wird die Sonde aus der Scheide Spitze geschoben, absorbieren die bronchiale epitheliale Flüssigkeit in das bronchiale Lumen vorhanden. Bronchoskopische Microsampling wurde in akute Atemnotsyndrom14,15,16 und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung17verwendet. Allerdings bei Asthma ist ein bestehendes Problem, dass die Sonde wegen Krankheit-induzierte epithelialen Zerbrechlichkeit und erhöhte Vaskularisierung Blutungen verursachen kann. Anwendung der Darmschleimhaut Fluid Technik der bronchoskopischen Microsampling Verfahren hätten wichtige klinische Implikationen in Bezug auf unser Verständnis der Pathophysiologie sowie zur Überwachung und Behandlung von Vorhersage der Ergebnisse von mehreren akuten und chronischen Lungenerkrankungen bei Kindern und Erwachsenen.
Alle Arten von Mediatoren können theoretisch mit dem Multiplex-Immunoassay-Plattform des hier verwendeten kommerziellen Systems gemessen werden (siehe die Tabelle der Materialien). Die Plattform ermöglicht die hohe Empfindlichkeit und genaue Quantifizierung der, die Vermittler für die ein paar von monoklonalen Antikörpern für die Entwicklung von einem Immunoassay erreicht werden kann. Diese Plattform auch mit sich bringt hohe Präzision und weniger empfindlich auf pH-Wert, Temperatur und Viskosität Variationen in den Fluiden analysiert werden.
In Zukunft Studien, wäre es von großem Wert für die aktuelle Panel immun Mediatoren zur Messung, z. B. zu erweitern: antimikrobielle Peptide; Gesamt- und spezifische IgA; akute-Phase-Reaktionspartner, wie C - reaktives Protein; Lipid-Mediatoren, wie Prostaglandine; und neurologische Mediatoren, wie Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF). Dies könnte eine detailliertere Ansicht der Natur des Systems der Schleimhaut Antwort auf einer Körperstelle mit umfangreichen Luft bieten. Die vorgeschlagenen Mediatoren können entweder gemessen werden durch gezielte quantitative hochempfindlichen Immunoassays, wie z. B. in das aktuelle Setup oder durch gezielte oder ungezielte Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie- oder flüssigen Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-Metabolomik Techniken basiert. Letzteres wurde bereits in gewissem Maße mit der Ausatmungsluft Kondensat-Methode implementiert hat einige methodische Nachteile in Bezug auf die Probenahme der Biofluid18 , die nicht offensichtlich für die Schleimhaut-Fluid-Technik.
Longitudinal Probenentnahme aus der Neugeborenenperiode bis ins Erwachsenenalter, wird wie in der COPSAC-2010 -Kohorte, deutlich erhöhen unser Verständnis der zugrunde liegenden immunologische Faktoren vor oder begleitend mit Erkrankungen der Atemwege wie Asthma und Allergien zu handeln. Solche Erkenntnisse möglicherweise wichtig, die Entwicklung neuer Therapeutika, die gezielt bestimmte Krankheit Endotypes und der Untersuchung von Mikronährstoffen und Droge Wirkmechanismen in randomisierten klinische Studien.
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Disclosures
Alle Autoren erklären potenziellen, vermeintlichen oder tatsächlichen Interessenkonflikt bezüglich des Inhalts dieser Handschrift. Förderinstitutionen haben keine Rolle in der Konzeption und Durchführung der Studie; die Erhebung, Verwaltung und Interpretation der Daten; oder die Erstellung, Überprüfung und Genehmigung des Manuskripts. Kein Pharmaunternehmen wurde an der Studie beteiligt.
Acknowledgments
Wir bedanken uns für die Kinder und Familien von der COPSAC2010 -Kohortenstudie für all ihre Unterstützung und ihr Engagement. Wir anerkennen und schätzen die einzigartige Bemühungen der COPSAC-Research-Team und die technische Hilfe aus Techniker Lisbeth Buus Rosholm, Technical University of Denmark für die Messung der Zytokine und Chemokine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| Low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
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