Summary
Este protocolo descreve uma técnica não-invasiva para a amostragem de líquido imperturbado mucosa das vias aéreas superiores. Ele pode ser usado para realizar a quantificação dos níveis na vivo de mediadores de proteína, tais como citocinas e quimiocinas, em indivíduos de todas as idades.
Abstract
Este protocolo descreve a amostragem não-invasiva de fluido de mucosa das vias aéreas superiores não perturbadas. Ele também detalha o procedimento de extracção utilizado antes da análise dos mediadores imunes em eluídos fluidos para o estudo da via aérea tópica imune assinatura, sem a necessidade de procedimentos de estimulação (frequentemente usados por outras técnicas). O fluido de mucosa é amostrado em uma tira de papel de filtro colocado na parte anterior do corneto e esquerdo por 2 min de absorção inferior. Analitos são eluídos dos papéis de filtro, e os eluídos extraídos à base de proteínas são analisados por um imunoensaio baseado em eletroquimioluminescência, permitindo a quantificação de alta sensibilidade de analitos de baixo e de alto nível na mesma amostra. Medimos os níveis na vivo de 20 mediadores imunes pré-selecionadas relacionados com imunológico específico sinalização de caminhos na mucosa das vias aéreas superiores, mas a técnica não está limitada a esse painel específico ou local de amostragem. A técnica foi primeiramente implementada em crianças de 7 anos desde os estudos prospectivos de Copenhaga sobre asma em coorte de2000 (COPSAC2000) de infância com rinite alérgica. Posteriormente foi usado no COPSAC2010 nascimento coorte longitudinal, amostrada em 1 mês, 2 anos e 6 anos de idade e em instâncias de sintomas respiratórios agudos. Estamos com sucesso obtidas e analisadas amostras de 620 (89%) de 700 crianças de 1 mês de idade; algumas amostras estavam abaixo do limite de detecção do ensaio (relatado como a mediana (intervalo inter-quartil (IQR)). O número de amostras abaixo do limite de detecção (ou seja, de 0 até o ponto de ajuste para o limite inferior de detecção) para cada mediador foi 29 (7.25-119,5). Esta técnica permite a quantificação do vivo em vias aéreas da mucosa imune perfil desde o nascimento, pode ser aplicada no sentido longitudinal e pode ser aplicada a estudos sobre o efeito da genética e exposições ambientais iniciais de vida, fisiopatologia, endotyping e monitoramento de doenças respiratórias e desenvolvimento e avaliação de novas terapêuticas.
Introduction
O fluido da mucosa do nariz torna-se a parte líquida do sistema superior-das vias respiratórias. Consiste de uma matriz complexa de mediadores derivado a interação entre o epitélio e as células imunitárias que compõem a primeira linha de defesa contra a invasão de microorganismos. A mucosa nasal é facilmente acessível, e há uma forte relação funcional e imunológica entre o nariz e os brônquios1. Este compartimento é de especial interesse em relação às doenças das vias respiratórias que são comuns na infância, como asma e rinite alérgica, mas também a uma gama de outras doenças respiratórias mais prevalentes mais tarde na vida.
Aqui, descrevemos a implementação de um método para amostra intacta da mucosa revestimento fluido da cavidade nasal usando uma técnica não-invasiva, baseada em papel de filtro, bem como um procedimento de extração subsequente, usada para eluir analitos baseados em proteína dos papéis de filtro antes da sua quantificação. Esta técnica por exemplo, pode ser usada para obter na vivo assinaturas imunes de indivíduos saudáveis e indivíduos com várias doenças respiratórias. Além disso, é possível examinar as exposições de importância para uma assinatura específica imune e avaliar se é um preditor ou mediador do desenvolvimento posterior da doença.
Fluido de mucosa anteriormente tiver sido obtido por lavagem nasal2, que muitas vezes é precedida por um teste de desafio nasal, onde um alérgeno é introduzido em níveis elevados para estimular uma resposta inflamatória3,4. No entanto, a técnica de lavagem nasal não é viável em crianças pequenas e introduz um factor de diluição desconhecido, que confunde os resultados, como o mediador diluído níveis podem cair abaixo do limite de detecção do ensaio5. Além disso, devido ao fator de diluição desconhecido, as analito medida respostas dos testes desafio nasal não são comparáveis entre indivíduos, limitando assim a utilidade da técnica de lavagem nasal em uma coorte de configuração. Finalmente, desafio de alérgeno só é aplicável em indivíduos sensibilizados e outros desafios, como o desafio de histamina, não são fisiologicamente relevantes, potencialmente causando um efeito de teto na liberação de mediador. Estes problemas são contornados na técnica apresentada em papel de filtro para recolha de fluidos de mucosa, onde a individual secreção de fluidos e níveis de analito são apenas fatores que influenciam a variação inter-individual.
Durante o procedimento de extração, analitos são eluídos dos papéis de filtro após a adição de volumes idênticos de buffer para todas as amostras. Isso favorece semelhante ex vivo diluição das amostras. Uma solução tampão de solução salina isotônica baseada em albumina é usado para a etapa de extração; permite a extração de mediadores à base de proteínas e estabiliza as proteínas para limitar a desnaturação durante o congelamento subsequente de proteínas eluted antes da quantificação. Para evitar a degradação proteica durante a fase de extração, um coquetel de inibidores de protease é adicionado para o buffer de extração.
A implementação de técnicas que permitem a quantificação do intacta, na vivo-mediadores imunes gerados em locais da mucosa é de extrema importância. Primeiro, o site da mucosa torna-se o maior órgão imunológico no corpo. Em segundo lugar, a localização nasal é o principal local de exposição no ar e está firmemente conectada ao compartimento imunológicas respiratórias dos pulmões1. Em terceiro lugar, a possibilidade de levantamento deste órgão importante com uma técnica não-invasiva abre a possibilidade de fornecer uma infinidade de informações sobre o eixo importante interação micróbio imune em relação à saúde e doença nas vias aéreas. Em quarto lugar, existem muitas outras possíveis aplicações desta técnica, tais como estudar alterações imunológicas locais em experimentações randomized, controladas de drogas e micronutrientes.
Inicialmente implementamos a técnica nos estudos prospectivos Copenhague sobre asma em coorte de2000 (COPSAC2000) de infância, onde determinamos o perfil imunológico do fluido em crianças de 7 anos de idade com rinite alérgica versus controles saudáveis13mucosa. Posteriormente, com êxito aplicamos esta técnica à coorte longitudinal de2010 COPSAC e imune perfis das vias respiratórias avaliados em 1 mês, 2 anos e 6 anos de idade e em instâncias de sintomas respiratórios agudos. Resultados de neonatos a 1 mês de idade demonstraram importantes associações entre a assinatura imune e a exposição ambiental do início da vida7,8,9,10,11,12.
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Protocol
Os estudos foram conduzidos em conformidade com os princípios orientadores da declaração de Helsinque. Aprovação do Comitê de ética para Copenhaga (KF 01-289/96 para COPSAC2000 ) e H-B-2008-093 para COPSAC2010e Agência Dinamarquesa de proteção de dados foram obtidas, e foi obtido consentimento escrito de ambos os pais de cada assunto antes de inscrição.
1. experimental Setup
- Use folhas de papel de filtro (folhas de poliéster-hidroxilados fibrosas, consulte a Tabela de materiais)6,7.
- Corte em tiras de 3 x 15 mm em tamanho para uma criança de 1 mês de idade e em forma de L para crianças mais velhas e adultos (5 x 20 x 10 mm (braço curto da L)).
- Inserir um pedaço de papel de filtro em cada narina da criança usando fórceps. Coloque o papel de filtro na parte anterior do corneto inferior (aproximadamente 1 cm dentro da narina para neonatos e 1,5 cm para todas as outras idades).
- Coloque recém-nascidos em uma cama e dar-lhes água com açúcar para o conforto.
Nota: Para crianças de todas as outras idades, a amostragem é realizada mais facilmente com o sujeito sentado em uma cadeira. - Para crianças mais velhas, inserir o longo braço do papel de filtro em forma de L em cada narina.
- Coloque recém-nascidos em uma cama e dar-lhes água com açúcar para o conforto.
- Aplica um grampo do nariz ao redor das narinas para minimizar o desconforto e evitar a perda acidental do papel filtro.
- Remova os papéis de filtro depois de 2 min de absorção.
- Coloque os papéis de filtro em tubos etiquetados e congelá-los imediatamente a-80 ° C.
- Tome nota de quaisquer sintomas de infecção das vias respiratórias, mostrado pela criança no dia de amostragem.
- Grave qualquer espirro, choro persistente ou epistaxe que ocorre durante a 2 min da amostragem.
2. quantificação das vias aéreas imune-mediadores
- Tome até 10 amostras aleatórias do freezer. Os números de identificação de registro. Mantenha as amostras no gelo durante todo o processo de trabalho.
- Após o descongelamento no gelo, mergulhe os papéis de filtro (por assunto) de ambas as narinas em 300 µ l de preparada na hora do buffer (veja a Tabela de materiais) contendo um tablet completo protease inibidor (consulte a Tabela de materiais) por 25 mL de tampão.
- Ajuste o volume da reserva conforme o tamanho do papel filtro.
- Use 300 µ l de tampão para papéis de filtro 3 x 15 mm de tamanho.
- Se apenas um papel de filtro está disponível, use metade do volume de reserva (150 µ l).
- Ajuste o volume da reserva conforme o tamanho do papel filtro.
- Transferi as amostras para um agitador de placa (400 rpm) 5 min. Use um timer.
- Transferir os papéis de filtro húmidos e buffer de ensaio para a Copa de um filtro de tubo de acetato de celulose (tamanho de poros de 0,22 µm) colocado dentro microcentrifuga tubo (ver a Tabela de materiais).
- Centrifugar a 16.000 x g por 5 min em uma centrífuga de refrigeração (a 4 ° C) para obter o extrato nasal filtrado dentro do tubo.
- Retire a taça e manter os tubos em gelo enquanto alíquotas do extrato nasal nos poços das placas de armazenamento de baixa proteína de ligação (consulte a Tabela de materiais).
- Loja a-80 ° C até análise.
- Determinar as concentrações de citocinas e quimiocinas nos extratos nasais usando um sistema de alta sensibilidade, com base em electrochemiluminesce matriz multiplexado (consulte a Tabela de materiais).
Nota: Um ensaio de 2 citocina humana 10-plex TH1/TH, 9-plex chemokine ensaio e single-plex IL-17A, TGF-β1 e TSLP foram realizados aqui.- Para os ensaios, incubar os extratos nasais durante a noite a 4 ° C. Realizar as medições pelo fabricante padrão protocolo (consulte a Tabela de materiais).
Nota: Os imunoensaios (consulte a Tabela de materiais) geralmente têm uma alta gama dinâmica de medição que varia entre 1 & 10.000 pg/mL, mas pode ser para alguns ensaios, 100.000 pg/mL. Isto significa que todas as amostras podem ser executadas na mesma diluição, limitando assim a influência de diferentes diluições em indivíduos saudáveis e doentes, como é o caso em outros imunoensaios semelhantes. O limite inferior de detecção para todas as citocinas foi 1 pg/mL ou menos e para quimiocinas, variou entre 1 & 50 pg/mL. TSLP não era detectável em 98% das amostras em 1 mês de idade.
- Para os ensaios, incubar os extratos nasais durante a noite a 4 ° C. Realizar as medições pelo fabricante padrão protocolo (consulte a Tabela de materiais).
3. estatísticas
- Log-transformar os dados antes da análise para obter resíduos normalmente distribuídos dos níveis de citocinas e chemokine.
- Se as amostras são analisadas em mais de um lote, corrigi os dados de citocinas e chemokine para centrar batch-wise sobre os dados de log-transformadas.
- Incorpore a média global e o antitransformação log de para obter dados em unidades de medida do original.
Nota: Para cada conjunto de análises feito, considere ajustar as variáveis que afetam o nível de citocinas e quimiocinas. Isto poderia ser influências maternas (por exemplo, o consumo de álcool e fumar durante a gravidez), aleitamento materno, eventos adversos durante a amostragem, irmãos, animais de estimação no lar, etc.
- Incorpore a média global e o antitransformação log de para obter dados em unidades de medida do original.
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Discussion
Com a técnica apresentada aqui, éramos capazes de determinar na vivo superior-via aérea da mucosa imune perfil em crianças desde o início como 1 mês de idade, que não foi feito anteriormente. Observamos que a presença de bactérias específicas das vias respiratórias e picornaviruses7,11, bem como outros pré e perinatais exposições, foram espelhadas no perfil imune dos recém-nascidos das vias respiratórias. Além disso, usamos esses dados de perfil imune das vias aéreas para estudar o mecanismo de ação de um ensaio randomizado de micronutrientes de altas doses de vitamina d. Estes resultados sublinham a validade e a utilidade da mucosa fluido técnica como uma técnica de amostragem não-invasiva para a quantificação de subsequentes na vivo de mediadores imunes das vias respiratórias.
Os seguintes pontos são vale a pena considerar antes da implementação do método: para medir citocinas na matriz fluida da mucosa, é importante o uso de metodologias de imunoensaio de alta sensibilidade-baseados, como o fornecido pelos protocolos de eletroquimioluminescência. O uso de imunoensaios enzima-lig pode levar a inferência na leitura de absorvância. Além disso, embora haja uma forte relação entre o nariz e os brônquios, a medição do perfil imune em vias aéreas superiores é ainda uma limitação. Amostragem foi realizada na parte superior da camada da mucosa; assim, esperamos que o fluido principalmente representa a composição da camada de gel, não a camada do sol. Não medimos marcadores de mucosa para confirmar isto, que é uma limitação. Em teoria, variações individuais na secreção de fluidos nasal influenciaria os níveis detectados de citocinas e quimiocinas. No entanto, fomos capazes de identificar claros e diferentes fenótipos imunológicos em resposta a diferentes exposições7,8,9,10,11,12, indicando que variações inter individuais na dinâmica de secreção nasal podem não ser um grande obstáculo para esta técnica. Ao executar a técnica, é importante executar todos os procedimentos em baixas temperaturas (resfriado) para evitar a degradação de proteínas durante o processamento. Degradação proteica pode ser reduzida ainda mais, adicionando os inibidores de protease de proteína recomendada para o buffer de extração de proteínas.
No entanto, a força desta técnica é que é não-invasivo e fácil de executar, permitindo avaliações longitudinais da assinatura imunes da mucosa das vias respiratórias do período neonatal e em diante. Tais informações potencialmente poderiam fornecer conhecimento sobre como o sistema imunitário local das vias respiratórias amadurece e se desenvolve durante a infância e na idade adulta. Além disso, é realizada a técnica de amostragem não perturbadas e forma in vivo -relevante, não diluído, que permitiu a detecção de mediadores imunes que seria indetectável com a técnica de lavagem nasal, onde um fator desconhecido diluição reduz a validade das conclusões13. Usamos um meio sintético, fibroso, hidroxiladas-poliéster que é comercialmente disponível (veja a Tabela de materiais) e é projetado para coleta, armazenamento e liberação de conjugado. O material é hidrofílico, com ligação de baixa biomolecular, e amostras proteicos são estáveis durante o armazenamento a-80 ° C. O material é altamente absorvente, e as superfícies de fibra foram modificadas para melhorar a molhabilidade da água.
No estudo COPSAC2010 , selecionamos um painel de 21 citocinas e quimiocinas que foram escolhidas um priori para representar grandes vias fenotípica do sistema imunológico agindo localmente nas vias aéreas. Apenas um desses mediadores, TSLP, não era detectável em um mês de idade.
Uma aplicação importante do futura seria para recolher amostras de fluido mucosa das vias aéreas inferiores (por exemplo, usando a técnica de microsampling bronchoscopic) para avaliar Imunologia inferior-das vias respiratórias. Bronchoscopic microsampling é um novo procedimento para diagnóstico bronchoscopic, capaz de coletar o fluido local forro epithelial brônquica; Ele utiliza uma sonda de fibra de poliéster embainhados14. Quando as vias aéreas distais são alcançadas, a sonda é empurrada para fora a ponta da bainha para absorver o fluido epitelial brônquico presente no lúmen brônquico. Microsampling bronchoscopic tem sido usado na síndrome respiratória aguda14,15,16 e doença pulmonar obstrutiva crônica17. No entanto, na asma, um problema existente é que a sonda pode causar sangramento devido à fragilidade epitelial induzida por doença e aumento da vascularização. Aplicando a técnica de fluido de mucosa ao procedimento microsampling bronchoscopic pode ter implicações clínicas importantes em relação ao nosso entendimento da fisiopatologia, bem como a monitorização, tratamento e prever o resultado de diversas doenças pulmonares agudas e crônicas em crianças e adultos.
Todos os tipos de mediadores teoricamente podem ser medidos usando a plataforma de imunoensaio multiplex do sistema comercial utilizado aqui (veja a Tabela de materiais). A plataforma permite a quantificação de alta sensibilidade e precisa de qualquer mediador para o qual pode ser obtido um par de anticorpos monoclonais aplicáveis ao desenvolvimento de um imunoensaio. Esta plataforma também traz alta precisão e menor sensibilidade às variações de pH, temperatura e viscosidade de líquidos a serem analisados.
No futuro, estudos, seria de grande valia para expandir o painel atual de mediadores imunes à medição de, por exemplo: peptídeos antimicrobianos; IgA total e específica; reagentes de fase aguda, como proteína C - reativa; mediadores lipídicos, tais como prostaglandinas; e mediadores neurológicos, tais como fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). Isto poderia fornecer uma visão mais detalhada da natureza do sistema em um local do corpo de resposta da mucosa com extensa exposição no ar. Os mediadores sugeridos podem ser medidos por meio de imunoensaios de alta sensibilidade alvo quantitativos, tais como na configuração atual, ou por não segmentados ou alvo da ressonância magnética Nuclear (RMN) espectroscopia - ou espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS)-com base em técnicas da metabolómica. A última abordagem já foi implementada em certa medida com o método de condensado do ar exalado, que tem alguns inconvenientes metodológicas com relação a amostragem do biofluid18 que não são aparentes para a técnica de fluido de mucosa.
Amostragem longitudinal do período neonatal até a idade adulta, como é realizada a coorte de COPSAC2010 , permitirá aumentar significativamente nossa compreensão dos fatores imunológicos subjacentes anteriores ou agindo concomitantemente com doenças das vias respiratórias como a asma e as alergias. Tais achados podem ser importantes para o desenvolvimento da novela terapêutica visando endotypes doença específica e à investigação de micronutrientes e mecanismos de drogas de ação no estudo randomizado de ensaios clínicos.
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Disclosures
Todos os autores não declaram nenhum conflito de interesses potencial, percebido ou real em relação ao conteúdo deste manuscrito. Agências de fomento não tinha qualquer papel na concepção e execução do estudo; a recolha, gestão e interpretação dos dados; ou a preparação, revisão e aprovação do manuscrito. Nenhuma empresa farmacêutica estava envolvida no estudo.
Acknowledgments
Expressamos a nossa gratidão para as crianças e famílias do estudo coorte COPSAC2010 por todo seu apoio e compromisso. Reconhecemos e apreciamos os esforços exclusivos da equipa de investigação de COPSAC e a ajuda técnica do técnico Lisbeth Buus Rosholm, da Universidade Técnica da Dinamarca, para a medição de citocinas e quimiocinas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| Low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
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