Summary
Denne protokollen beskriver en noninvasive metode for prøvetaking uforstyrret slimhinnene slimhinnen væske fra øvre luftveiene. Den kan brukes til å utføre kvantifiseringen i vivo nivåer av protein meglere, som cytokiner og chemokines, i fag i alle aldre.
Abstract
Denne protokollen beskriver noninvasive prøvetaking uforstyrret øvre luftveier slimhinnene slimhinnen væske. Det har også detaljer utvinning prosedyren brukes før analysen av immun meklarar i flytende eluates for studier av luftveiene aktuell immun signaturen, uten behov for stimulering prosedyrer (ofte brukt av andre teknikker). Slimhinnene slimhinnen væsken samples på en papirstrimmel filter plassert i den fremre delen av dårlig Concha og venstre i 2 minutter absorpsjon. Analytter er elut fra filter-papirer, og de utpakkede protein-basert eluates analyseres av en electrochemiluminescence-baserte immunanalyse, tillater for høy følsomhet kvantifisering av lav - og høy - nivå analytter i samme utvalget. Vi målt i vivo nivåer av 20 forhåndsvalgt immun meglere knyttet til bestemte immun signalnettverk trasé i øvre luftveier mucosa, men teknikken er ikke begrenset til spesifikke panel eller prøvetaking området. Teknikken ble først implementert i 7 år gamle barn fra København prospektive studier på astma i barndommen2000 (COPSAC2000) kohort med allergisk rhinitt. Det ble deretter brukt i langsgående COPSAC2010 fødselskohort, samplet på 1 måned, 2 år og 6 år og forekomster av akutte åndedretts symptomer. Vi har innhentet og analysert prøver fra 620 (89%) av 700 1-måned gamle barn, noen smakebiter var under analysen oppdagelsen grensen (rapportert som median (inter-kvartil rekkevidde (IQR)). Antall prøver nedenfor oppdagelsen grensen (dvs. fra 0 til settpunkt for nedre grense for påvisning) for hver megler var 29 (7.25-119.5). Denne teknikken gjør kvantifiseringen i vivo airway mucosal immun profilen fra fødselen, kan brukes langs og kan brukes til studier av effekten av genetikk og tidlig i livet miljømessige eksponeringer, patofysiologi, endotyping og overvåking av luftveissykdommer, og utvikling og evaluering av romanen therapeutics.
Introduction
Slimhinnene slimhinnen væske av nesen gjør den likvide delen av øvre luftveier. Det består av en kompleks matrise av meglere fra samspillet mellom epitel og immunceller som utgjør det første forsvarslinje mot invaderende mikroorganismer. Nasal mucosa er lett tilgjengelig, og det er en sterk funksjonelle og immunologiske forholdet mellom nesen og bronchi1. Dette rommet er av spesiell interesse i forhold til airway sykdommer som er vanlige i barndommen, som astma og allergisk rhinitt, men også en rekke andre respirasjonsproblemer mer utbredt senere i livet.
Her beskriver vi gjennomføring av en metode for å prøve uforstyrret slimhinnene slimhinnen væske fra nesehulen bruker en filter papir-basert, noninvasive teknikk, samt en påfølgende utvinning prosedyre, brukes til å elute protein-basert analytter fra filter-papirer før kvantifisering. Denne teknikken kan for eksempel brukes til å få i vivo immun signaturer av både friske personer og personer med ulike luftveissykdommer. Videre er det mulig å undersøke eksponeringer av betydning for en spesifikk immun signatur og vurdere om det er en predictor eller megler senere sykdom utvikling.
Slimhinnene slimhinnen væske har tidligere fått tak nasal lavage2, som ofte kommer etter en nasal utfordring test, der et allergen er innført i høye nivåer å stimulere en betennelsesreaksjon3,4. Men nasal lavage teknikken er ikke gjennomførbart i små barn og introduserer en ukjent fortynning faktor, som forundrer resultatene, som utvannet mellommann nivåer kan falle under gjenkjenning grensen av analysen5. Videre, på grunn av ukjent fortynningsfaktoren, målt analytt svarene fra nese utfordring testene er ikke sammenlignbare mellom individer, noe som begrenser nytteverdien av nasal lavage teknikken i en kohort sette. Endelig allergen challenge gjelder bare i sensibilisert fag, og andre utfordringer, slik som histamin utfordringen, er ikke fysiologisk relevant, potensielt forårsake en taket effekt på megler utgivelsen. Disse problemene er omgås i presentert filter papirbaserte teknikken for slimhinnene slimhinnen væske samling, hvor enkelte utskillelsen av væsker og analytt nivåer er de eneste faktorene som påvirker Inter-individuelle avvik.
Under utvinning prosedyren, er analytter elut fra filter avisene etter tillegg av identiske volumer bufferen til alle prøvene. Dette favoriserer lignende ex vivo fortynning av alle prøvene. En utvinning buffer albumin-baserte isotonic salt løsning brukes for utvinning trinn; Det gjør det mulig utvinning av protein-basert meglere og stabiliserer proteiner for å begrense denaturering under påfølgende frysing av elut proteiner før kvantifisering. For å unngå protein fornedrelse under utvinning fase, lagt en cocktail av proteasehemmere til utvinning bufferen.
Gjennomføringen av teknikker som tillater for kvantifisering av fred, i vivo-genererte immun meglere på slimhinnene nettsteder er av største betydning. Først utgjør mucosal området den største immunologiske orgelet i kroppen. Andre nasal plasseringen er hovedwebområdet av luftbårne eksponering og koblet tett åndedretts immunologiske rommet av lungene1. Tredje åpner mulighet for kartlegging dette viktig organ med en noninvasive teknikk muligheten for å gi en overflod av informasjon om viktige mikrobe-immune samhandling aksen i forhold til helse og sykdom i luftveiene. Fjerde, det er mange andre mulige anvendelser av denne teknikken, som studerer lokale immunologiske endringer i randomiserte kontrollerte forsøk av narkotika og mikronæringsstoffer.
Vi implementert først teknikken i København prospektive studier på astma i barndommen2000 (COPSAC2000) kohort, hvor vi bestemt immun profilen til slimhinnene slimhinnen væske i 7 år gamle barn med allergisk rhinitt versus sunn kontroller13. Senere, brukt vi har denne teknikken langsgående COPSAC2010 kohort og vurdert airway immun profiler på 1 måned, 2 år og 6 år og forekomster av akutte åndedretts symptomer. Resultater fra 1-måned gamle nyfødte har vist betydelig assosiasjonene immun signaturen og tidlig i livet miljømessige eksponering7,8,9,10,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studier ble utført i samsvar med de veiledende prinsippene i deklarasjonen i Helsinki. Godkjenninger etikk for København (KF 01-289/96 COPSAC2000 ) og H-B-2008-093 for COPSAC2010og dansk Data Protection Agency ble innhentet, og skriftlig samtykke ble innhentet fra begge foreldre av hvert emne før registrering.
1. eksperimentelle oppsett
- Bruk ark filter (fibrøs hydroxylated polyester ark, se Tabellen for materiale)6,7.
- Kuttet ut strimler 3 x 15 mm i størrelse 1-måned gamle barn og i en L-form for eldre barn og voksne (5 x 20 x 10 mm (kort arm av L)).
- Sett inn ett stykke filter papir i hvert nesebor av spedbarn ved hjelp av pinsett. Plass filteret papiret i den fremre delen av dårlig Concha (ca 1 cm inne i neseboret for nyfødte og 1,5 cm for alle andre aldersgrupper).
- Plasser nyfødte på en seng og gi dem sukkervann for komfort.
Merk: For barn i alle andre aldre, prøvetaking utføres enkelt med emnet sitter på en stol. - For eldre barn, setter du inn den lange arm av L-formet filter papir i hvert nesebor.
- Plasser nyfødte på en seng og gi dem sukkervann for komfort.
- Bruk neseklemmen rundt neseborene å minimere ubehag og å unngå tap av filter papir.
- Fjerne filter avisene etter 2 min absorpsjon.
- Plasser filteret papirene i merket rør og fryse dem umiddelbart på-80 ° C.
- Noen symptomer på luftveier infeksjon vist av barnet ved prøvetaking og noter.
- Registrere alle Nysing, vedvarende gråt eller Neseblod som oppstår under 2 min av prøvetaking.
2. kvantifisering av Airway immun-meglere
- Tar opptil 10 tilfeldige prøver fra fryseren. Registrere identifikasjonsnummer. Holde prøvene på is under hele arbeider prosessen.
- Etter tining på is, fordype filter papirene (per emne) fra både nostrils i 300 µL av nylagde buffer (se Tabell for materiale) som inneholder en fullstendig protease hemmer tablett (se Tabell for materiale) per 25 mL av bufferen.
- Justere volumet på bufferen som filter papirstørrelsen.
- Bruk 300 µL bufferen for filter papir 3 x 15 mm i størrelse.
- Hvis bare ett filter papir er tilgjengelig, bruk halve buffer volumet (150 µL).
- Justere volumet på bufferen som filter papirstørrelsen.
- Overføre prøvene til en plate shaker (400 rpm) for 5 min. Bruk en tidtaker.
- Overføre fuktig filter papirer og analysebuffer i kopp en celluloseacetat tube filter (0.22 µm porestørrelse) plassert i en microcentrifuge tube (se Tabell for materiale).
- Sentrifuge 16.000 x g i 5 min i et nedkjølt sentrifuger (på 4 ° C) hente filtrerte nasal ekstrakt i røret.
- Fjern koppen og holde rørene på is mens aliquoting nasal ekstrakt i brønnene av lav-protein bindende lagring plater (se Tabell for materiale).
- Lagre på-80 ° C før analysen.
- Bestemme konsentrasjonen av cytokiner og chemokines i nasal ekstrakter ved å bruke en høy følsomhet, electrochemiluminesce-baserte multiplex matrise (se Tabell for materiale).
Merk: En menneskelig 10-plex TH1/TH2 cytokin analysen, 9-plex chemokine analysen, og single-plex IL-17A, TGF-β1 og TSLP ble utført her.- For analyser, ruge nasal ekstrakter overnatting på 4 ° C. Utføre målinger som per standard produsenten protokollen (se Tabell for materiale).
Merk: Immunanalyser (se Tabell for materiale) vanligvis har et høyt dynamikkområde for måling varierer mellom 1 & 10 000 pg/mL, men for noen analyser, kan det være 100 000 pg/mL. Dette betyr at alle prøver kan kjøres på samme uttynnet, dermed begrense påvirkning av ulike fortynninger i friske og syke fag, som er tilfellet i andre lignende immunanalyser. Nedre grense for gjenkjenning for alle cytokiner var 1 pg/mL eller mindre, og chemokines, det varierte mellom 1 & 50 pg/mL. TSLP var ikke i 98% av eksempler på 1 måned gammel.
- For analyser, ruge nasal ekstrakter overnatting på 4 ° C. Utføre målinger som per standard produsenten protokollen (se Tabell for materiale).
3. statistikk
- Logg-transformere dataene før analyse å få normalfordelt rest cytokin og chemokine nivåer.
- Hvis utvalgene er analysert i mer enn en gruppe, rette cytokin og chemokine dataene for batch-wise sentrering på Logg-forvandlet data.
- Innlemme den samlede mener og anti-Logg transformasjon for å hente data i de opprinnelige målenhetene.
Merk: For alle typer analyser utført, Vurder å justere variabler som påvirker cytokiner og chemokines. Dette kan være mors påvirkninger (f.eks alkoholforbruk og røyking under graviditeten), amming, uønskede hendelser under prøvetaking, søsken, kjæledyr i hjemmet, osv.
- Innlemme den samlede mener og anti-Logg transformasjon for å hente data i de opprinnelige målenhetene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med teknikken presenteres her, var vi kan finne i vivo øvre luftveier mucosal immun profilen i barn fra så tidlig som 1 måned gammel, som ikke er gjort tidligere. Vi observert at tilstedeværelsen av bestemte airway bakterier og picornaviruses7,11, samt andre pre og perinatal eksponeringer, ble speilet i airway immun profilen til nyfødte. Videre brukt vi disse airway immun profildata for å studere virkningsmekanismen av en randomisert micronutrient prøveversjon av høy dose vitamin D. Disse resultatene understreker gyldigheten og nytten av slimhinnene slimhinnen væske teknikken som en noninvasive prøvetaking teknikk for påfølgende i vivo kvantifisering av luftveiene immun meglere.
Følgende punkter er verdt å vurdere før metodeimplementering: for å måle cytokiner i slimhinnene slimhinnen væske matrix, er det viktig å bruke high-følsomhet-baserte immunanalyse metoder, slik som fra electrochemiluminescence protokoller. Bruk av enzymet knyttet immunanalyser kan føre til inferens i absorbansen avlesning. Videre, selv om det er en sterk sammenheng mellom nesen og bronchi, måling av immun profilen i øvre luftveiene er fortsatt en begrensning. Prøvetaking ble utført på den øvre delen av slimhinnene lag; Derfor forventer vi at væsken hovedsakelig representerer sammensetningen av gel laget, ikke sol laget. Vi hadde ikke måle slimete lag markører for å bekrefte dette, som er en begrensning. Personlige variasjoner i nasal væske sekret kan i teorien påvirke oppdaget nivåene av cytokiner og chemokines. Men har vi vært i stand til å identifisere klare og varierende immunologiske fenotyper svar på ulike eksponeringer7,8,9,10,11,12, indikerer at Inter enkeltvarianter i nasal sekresjon dynamics ikke kan være en stor utfordring for denne teknikken. Mens du utfører teknikken, er det viktig å utføre alle prosedyrer ved lave temperaturer (is-avkjølt) å unngå protein fornedrelse under behandling. Protein fornedrelse kan reduseres ytterligere ved å legge til de anbefalte protein proteasehemmere protein utvinning bufferen.
Styrken på denne teknikken er likevel at det er noninvasive og enkel å utføre, slik at langsgående vurderinger av slimhinnene airway immun signaturen fra neonatal perioden og utover. Slik informasjon kan potensielt gir kunnskap om hvordan lokale airway immunsystem modnes og utvikler i barndommen og inn i voksen alder. Videre prøvetaking teknikken utføres uforstyrret og en in vivo -relevant, ufortynnet måte, som aktivert påvisning av immun meglere som ville ha vært umulig å oppdage med nasal lavage teknikken, hvor en ukjent fortynningsfaktoren reduserer gyldigheten av funnene13. Vi brukte et syntetisk, fibrøs, hydroxylated-polyester medium som er kommersielt tilgjengelig (se Tabell for materiale) og er utformet for eksempel innsamling, lagring og konjugat utgivelsen. Materialet er hydrofile, med lav biomolecular bindende, og protein inneholder prøver er stabilt under lagring på-80 ° C. Materialet er svært absorberende fiber overflater er endret for å forbedre vann wettability.
I COPSAC2010 studien valgte vi et panel av 21 cytokiner og chemokines som ble en priori å representere store phenotypical veier av immunsystemet handle lokalt i luftveiene. Bare én av disse meglere, TSLP, var ikke synlig på en måned gammel.
Et viktig fremtidig program ville være å samle slimhinnene slimhinnen væske fra lavere luftveiene (f.eks ved hjelp av bronchoscopic microsampling teknikken) å vurdere nedre luftveier immunologi. Bronchoscopic microsampling er en ny prosedyre for bronchoscopic diagnose, kan samle lokale bronkial epithelial fôr fluid; den utnytter en omsluttet polyester fiber sonde14. Når distale luftveiene er nådd, er sonden skjøvet ut av sliren spissen å absorbere bronkial epithelial væsken i bronkial lumen. Bronchoscopic microsampling har blitt brukt i akutt respiratory distress syndrom14,15,16 og kronisk obstruktiv lungesykdom17. Men i astma er et eksisterende problem at sonden kan forårsake blødninger på grunn av sykdom-indusert epithelial skjørhet og økt endometrial blodkar. Bruke slimhinnene slimhinnen væske teknikken bronchoscopic microsampling prosedyren kan ha viktige klinisk implikasjoner i forhold til vår forståelse av patofysiologien, samt overvåking, behandle og forutsi utfallet av flere akutte og kroniske lunge sykdommer i både barn og voksne.
Alle typer meglere kan teoretisk måles ved hjelp av multiplex immunanalyse plattformen av kommersielle systemet brukes her (se Tabell for materiale). Plattformen gir høy følsomhet og nøyaktig kvantifisering av en megler som et par av monoklonale antistoffer gjelder for utviklingen av en immunanalyse kan oppnås. Denne plattformen også bringer med seg høy presisjon og mindre følsomhet pH, temperatur og viskositet variasjoner i væsker som skal analyseres.
I fremtidige studier, det ville være av stor verdi å utvide gjeldende panel av immun meglere målenheten, for eksempel: antimikrobielle peptider; Total og bestemt IgA; akutt-fase reaktantene, for eksempel C - reaktivt protein; lipid meglere, som prostaglandiner; og nevrologiske meglere, som hjerne-avledet nevrotropisk faktor (BDNF). Dette kan gi en mer detaljert visning av natur mucosal svar systemet hos en kropp med omfattende luftbårne eksponering. De foreslåtte meglere kan enten måles med målrettet kvantitative høy følsomhet immunanalyser, som i det gjeldende oppsettet, eller målrettet eller uønskede kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi- eller flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS)-basert metabolomics teknikker. Sistnevnte tilnærming er allerede implementert i noen grad med utåndet pusten kondensat metoden, som har noen metodiske ulemper med hensyn til utvalg av biofluid18 som ikke er tydelig for slimhinnene slimhinnen væske teknikken.
Langsgående prøvetaking fra nyfødte periode opp, vil som utføres i COPSAC2010 kohort, øke vår forståelse av underliggende immunologiske faktorer foregående eller opptrer samtidig med airway sykdommer som astma og allergi. Slike funn kan være viktig for utviklingen av romanen therapeutics målretting bestemt sykdom endotypes og etterforskning av micronutrient narkotika virkningsmekanismer i randomiserte kliniske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklære noen potensielle, oppfattede eller reelle interessekonflikt vedrørende innhold på dette manuskriptet. Virkemiddelapparat har ikke noen rolle i utforming og gjennomføring av studien; innsamling, behandling og tolkning av data. eller den forberedelse, gjennomgang og godkjenning av manuskriptet. Ingen farmasøytiske selskapet var involvert i studien.
Acknowledgments
Vi uttrykke vår takknemlighet til barn og familier av COPSAC2010 kohort studien for all deres støtte og engasjement. Vi anerkjenner og setter pris på den unike innsatsen av forskerteamet COPSAC og teknisk hjelp fra tekniker Lisbeth Buus Rosholm, Danmarks tekniske universitet, for måling av cytokiner og chemokines.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| Low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
References
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), Supplement 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), Supplement 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
