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Biochemistry

एक नमूना से मेटाबोलाइट्स, लिपिड्स और प्रोटीन्स के व्यापक विश्लेषण के लिए एक सरल भिन्नात्मक निष्कर्षण विधि

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55802
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Golm, Germany, 2Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Cairo University

Summary

एक नमूना का उपयोग करते हुए जैविक ऊतकों से लिपिड, मेटाबोलाइट्स और प्रोटीन के व्यापक निष्कर्षण के लिए प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

जटिल जैविक प्रणालियों को समझना, जीवित कोशिका के एक से अधिक यौगिक वर्गों के माप, विश्लेषण और एकीकरण की आवश्यकता होती है, जो आमतौर पर ट्रांसस्क्रिप्टोमीक, प्रोटिओमिक, मेटाबोलामीक्स और लिपिडोमिक मापन द्वारा निर्धारित होते हैं। इस प्रोटोकॉल में, प्रति नमूना एक विभेदक का उपयोग करके जैविक ऊतकों से चयापचयों, लिपिड और प्रोटीन की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निष्कर्षण के लिए हम एक सरल विधि पेश करते हैं। निकासी विधि मिथाइल टर्ट -बेटिलीन ईथर पर आधारित है: मेथनॉल: तरल पदार्थों के लिए जल प्रणाली: हाइड्रोफोबिक और ध्रुवीय चयापचयों का तरल विभाजन, एक स्थिर गोली के रूप में प्रोटीनों की वर्षा और अन्य अणुओं के साथ-साथ दो अमिषीय चरणों में होता है। इसलिए, यह विधि विशिष्ट आणविक संरचना के तीन अलग-अलग अंश प्रदान करती है, जो द्रव्य क्रोमैटोग्राफी (एलसी) या गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) जैसे आम हाई थ्रुपुट 'ओमिक्स' प्रौद्योगिकियों जैसे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के साथ पूरी तरह से संगत है। हालांकि विधि init थाविभिन्न पौधे के ऊतक नमूनों के विश्लेषण के लिए विकसित किया गया है, यह शैवाल, कीड़े और स्तनधारी के ऊतकों और सेल संस्कृतियों के रूप में विविध प्रणालियों से जैविक नमूनों के निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए पूरी तरह से संगत साबित हुआ है।

Introduction

सिस्टम जीव विज्ञान, जो पिछली शताब्दी 1 के मध्य में उभरा और जीनोमिक और ट्रांसस्क्रिप्टमिक डेटा सेटों के बड़े पैमाने पर विश्लेषण द्वारा उन्नत किया गया , 2 , 3 , ने जटिल जैविक प्रणालियों 4 , 5 के विश्लेषण के लिए एक नया और अपरिहार्य दृष्टिकोण विकसित किया है। सिस्टम बायोलॉजी का मुख्य उद्देश्य जैविक प्रणालियों में घटक परस्पर क्रियाओं और निर्भरता को समझना और जीनोटाइप, उनकी प्राप्ति, आणविक परिवर्तनों और परिणामी फ़िनोटीप्स के बीच संबंध को पुल करने के लिए है। तदनुसार, व्यापक बड़े पैमाने पर विश्लेषणात्मक दृष्टिकोणों, अर्थात् जीनोमिक्स, ट्रांसस्क्रिप्टमिक्स, मेटाबोलामिक्स, लिपिडोमिक्स और प्रोटिओमिक्स और उनके कम्प्यूटेशनल विश्लेषण द्वारा निर्मित व्यापक डेटा सेटों का एकीकरण जटिल जैविक प्रणालियों के विवरण और समझने के लिए एक शर्त बन गया है।

बास किसी भी जीवित प्रणाली में जैविक घटकों की विशाल रासायनिक विविधता और जटिलता पर एड, बड़े और व्यापक 'ओमिक्स' डेटा सेट का उत्पादन, लागू निष्कर्षण पद्धति 9 की गुणवत्ता पर दृढ़तापूर्वक निर्भर करता है। निष्कर्षण विधि की गुणवत्ता के अलावा, विधि की अर्थव्यवस्था महत्वपूर्ण है; इसका मतलब यह है कि जितना संभव हो उतना नमूना इनपुट के रूप में बहुत आणविक जानकारी प्राप्त करना वांछनीय होगा। अक्सर नमूना मात्रा सीमित हो सकती है और इसलिए यह निष्कर्षण विधि का उपयोग करने के लिए बेहद वांछनीय है, जो किसी दिए गए नमूने के एकल निष्कर्षण से कई आणविक वर्गों को प्राप्त कर सकता है। इसका अर्थ है कि एक ही नमूना के विभिन्न नमूना aliquots से विभिन्न यौगिक कक्षाओं के निष्कर्षण के लिए कई विशेष निष्कर्षण विधियों का उपयोग करने के बजाय, एक अनुक्रमिक निकासी विधि कार्यरत है, जो अलग-अलग आणविक भिन्नों में एक विभेदक के आणविक घटकों को अलग करता है।

_content "> इन भिन्न निष्कर्षण विधियों के लिए नियोजित सामान्य विधि, फोलच एट अल से दो चरण लिपिड निष्कर्षण पद्धति पर आधारित है। 1 9 57 में विकसित। यह विधि क्लोरोफॉर्म पर आधारित है: ध्रुवीय और हाइड्रोफोबिक चयापचयों का मेथनॉल / पानी विभाजन और उच्च गुणवत्ता वाले लिपिड विश्लेषण के लिए साफ-सुथरा और डी-जटिल नमूने का इरादा है। बहु-ओमिक्स सिस्टम जीवविज्ञान के विकास के साथ, फॉल्च पद्धति आगे, चरणबद्ध, प्रोटीन और ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स और लिपिड के नमूना विभाजन के लिए इसका उपयोग करके बेहतर था। तरल क्रोमैटोग्राफी-आधारित प्रोटिओमिक्स 11 , 12 , 13 , 14 के अलावा, गैस और तरल क्रोमैटोग्राफी-आधारित चयापचय और ध्रुवीय और हाइड्रोफोबिक यौगिकों के लिपिडोमिक्स। दुर्भाग्य से, ये सभी विधियां क्लोरोफॉर्म-आधारित निष्कर्षण विधि पर निर्भर करती हैं, जो न केवल अवांछित फॉ के लिए जाता हैध्रुवीय और लिपिड चरण के बीच एक इंटरफेस के रूप में प्रोटीन गोली का रिमाशन, लेकिन जो हरे रंग की रसायन विज्ञान परिप्रेक्ष्य 15 , 16 से भी अवांछनीय विलायक है। हालांकि, विलायक मिथाइल टर्ट -बेटिलीन ईथर (एमटीबीई) इन दोनों की उपरोक्त समस्याओं पर काबू पाती है और क्लोरोफॉर्म के लिए उपयुक्त प्रतिस्थापन है। इन आवश्यकताओं के आधार पर, हमने एक एमटीबीई स्थापित करने का निर्णय लिया: मेथनॉल: पानी आधारित निकासी विधि, जो सभी पूर्वनिर्धारित विनिर्देशों को पूरा करती है और इसलिए व्यापक बहु-ओमिक्स विश्लेषण 16 के लिए एक आदर्श प्रारंभ बिंदु के रूप में कार्य करता है।

यह प्रोटोकॉल सामान्य चरण की समस्याओं के निवारण सहित नमूना तैयार करने के सरल, तेज और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वर्कफ़्लो के माध्यम से उपयोगकर्ता चरण-दर-चरण का मार्गदर्शन करता है। इसके अलावा, हम संक्षेप में अल्ट्रा-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-जन स्पेक्ट्रोमेट्री (यूपीएलसी-एमएस) से अनुकरणीय विश्लेषणात्मक आंकड़े पेश करेंगेएड लिपिडोमिक्स, मेटाबोलामोक्स और प्रोटीमोक्स प्रोफाइलिंग संयंत्र के ऊतकों के नमूने से। यद्यपि दिए गए उदाहरण अरबीडोपिस थलियाना पत्ती के ऊतक नमूने के 50 मिलीग्राम से निकले हैं , इस प्रोटोकॉल का उपयोग कई जैविक नमूनों और ऊतकों के लिए किया गया है, जिसमें शैवाल 17 , 18 , कीड़े 19 और स्तनधारी कोशिकाएं, अंगों और ऊतक 20 , 21 , 22 प्रस्तुत निष्कर्षण प्रोटोकॉल का दायरा पूर्व निष्कर्षण नमूना हैंडलिंग का स्पष्ट और विस्तृत वर्णन और निष्कर्षण प्रक्रिया ही प्रदान करना है। हालांकि हम विश्लेषणात्मक आवेदन के तीन संक्षिप्त उदाहरण प्रदान करते हैं, पूर्व और पोस्ट विश्लेषणात्मक डेटा से निपटने के बारे में विस्तृत जानकारी हमारे पिछले 16 , 23 , 24 के प्रकाशनों से प्राप्त की जा सकती है , , 26

Protocol

सावधानी : निष्कर्षण के दौरान इस्तेमाल मेथनॉल (मेओएच) और मिथाइल टर्ट -बेटिलीन ईथर (एमटीबीई), ज्वलनशील होते हैं, और लंबे समय तक जोखिम और / या संपर्क, श्वसन, आंख या त्वचा की जलन पर हो सकते हैं। कृपया उन्हें ध्यान से एक धूमिल हुड में ही रखें और निकासी (प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, आदि ) के दौरान उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं का उपयोग करें। तरल नाइट्रोजन और सूखी बर्फ, इस प्रोटोकॉल के कई चरणों में उपयोग किया जाता है, लंबे समय तक त्वचा संपर्क के कारण गंभीर जलता हो सकता है। कृपया सुरक्षात्मक दस्ताने और चश्मा पहनकर सावधानी से उन्हें व्यवस्थित करें उपयोगकर्ता नमूना विश्लेषण के लिए विभिन्न रसायनों, अभिकर्मकों या आंतरिक मानकों का उपयोग कर सकते हैं, जिनमें से कुछ विषाक्त हो सकते हैं। कृपया उपयोग की जाने वाली सभी सामग्री के लिए संबंधित रासायनिक सुरक्षा डेटा शीट की जांच करें।

1. जैविक नमूने का संग्रह और फसल काटना

  1. लेबल कटाई ट्यूबों तैयार करें
    नोट: यहां, लेबल, 2 एमएल, गोल-तल, सुरक्षित स्थान पर जैविक नमूने फसल करेंकश्मीर microcentrifuge दो 5 मिमी व्यास युक्त ट्यूब्स, ऊतक homogenizer के लिए धातु गेंदों।
  2. एक भरा द्रव नाइट्रोजन देवर तैयार करें।
  3. जैविक नमूना काटा और तरल नाइट्रोजन में ऊतक को फ्रीज करें। घाव से प्रेरित चयापचय परिवर्तनों से बचने के लिए कुछ ही सेकंड में जितनी जल्दी हो सके उतना जल्दी ही इस चरण को पूरा करें।
    नोट: प्रदर्शन के प्रयोजनों के लिए, 30 दिन पुरानी जंगली प्रकार के अरबीप्सिस थलियाना (कर्नल-0) से लंबे समय तक स्थितियों के तहत मिट्टी पर उगने वाली पत्तियां का उपयोग करें।
  4. सूखा बर्फ पर कटाई के नमूनों को अल्पकालिक विराम के लिए रखें या उन्हें लंबी अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

2. पीस और ऊतक विघटन

  1. कम-से-कम 10 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में ऊतक होमोजिज़रेटर के ट्यूब धारकों को प्री-कूल करें यदि एक ऊतक होमोजिजिएजर उपलब्ध नहीं है, तो साफ और पूर्व-ठंडा मोर्टारों और मस्तिष्क का उपयोग करें।
  2. नमूनों को तरल नाइट्रोजन, सूखी बर्फ या -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से ले जाओ और उन्हें पूर्व ठंडा में रखेंट्यूब धारक
  3. ऊतक homogenizer में ट्यूब धारकों को जल्दी से डाल दिया।
  4. जैविक सामग्री को ठीक और सजातीय पाउडर में पीस लें। पत्तियों के लिए 1 मिनट के लिए 20 हर्ट्ज का उपयोग करें
    ध्यान दें; होमोजीनाइजेशन समय और गति ऊतक के आधार पर अलग-अलग हो सकती है, यह सुनिश्चित करें कि नमूनों को एक अच्छा पाउडर में समयुपित किया गया है और यह पाउडर होमोजनाइज़ेशन के हर चरण पर स्थिर रहता है।
  5. ट्यूब धारकों से जैविक नमूनों को ले लो और उन्हें आगे निकालने तक जमे हुए रखें।

3. ऊतकों का वजन

  1. अपेक्षित नमूना मात्रा के लिए पर्याप्त परिशुद्धता के साथ एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करें।
  2. एक लेबल 2 एमएल गोल नीचे सुरक्षित-लॉक microcentrifuge ट्यूब तैयार करें।
  3. तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों और स्पट्यूला को प्री-कूल रखें।
  4. 2 एमएल सुरक्षित-लॉक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में ऊतक पाउडर की आवश्यक मात्रा को विभाजित करना।
    सावधानी: संयंत्र सामग्री के किसी भी defrosting से बचने के समय के लिए लिया समय कम से कमनमूने से अधिक
  5. तरल नाइट्रोजन के वजन के तुरंत बाद अनियंत्रित नमूने लौटें।
  6. प्रत्येक नमूने के लिए रिकॉर्ड सटीक वजन अधिकांश पौधे के ऊतकों के लिए 10-50 मिलीग्राम ± 10% का उपयोग करें।
  7. अतिरिक्त निकासी तक -80 डिग्री सेल्सियस पर अनियंत्रित नमूनों को स्टोर करें।

4. अभिकर्मक सेटअप

  1. मिथाइल टर्ट-बथिल ईथर (एमटीबीई) / मेथनॉल (मेओएच) का एक निष्कर्षण मिश्रण का उपयोग करें।
    1. 100 एमएल निष्कर्षण विलायक की तैयारी के लिए, एमटीबीई: मेओएच (3: 1, वॉल / वॉल्यूम) का मिश्रण बनाने के लिए 25 एमएल ऑफ मेओएच को 75 एमएल का एमटीबीई जोड़ें।
    2. विश्लेषणात्मक आवश्यकताओं के अनुसार पोस्ट विश्लेषण सामान्यीकरण के लिए आंतरिक मानकों को जोड़ें आमतौर पर, यूपीएलसी-एमएस-आधारित लिपिड विश्लेषण के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में 1,2 डायहेप्टेडैनॉयल-एसटी-ग्लिसराओ-3-फॉस्फोोकोलिन के 50 μL (क्लोरोफॉर्म में 1 मिलीग्राम / एमएल) को जोड़ें, जबकि 13 सी सोर्बिटोल के 50 μL को जोड़ते हैं ( 1 मिलीग्राम / एमएल पानी में) प्राथमिक के जीसी-एमएस आधारित विश्लेषण के लिए आंतरिक मानकों के रूप मेंचयापचयों। यूपीएलसी-एमएस आधारित मेटाबोलाइट विश्लेषण के लिए आंतरिक मानकों को 50 μL कॉर्टिकोसोर्स्टोन (मेथनॉल में 1 मिलीग्राम / एमएल) और 25 μL एम्पीसिलीन (1 मिलीग्राम / एमएल मेथनॉल में) के लिए है।
    3. एमएलबीई के साथ साफ कांच की बोतल में विलायक स्थानांतरित करें: मेओएच मिश्रण
    4. निष्कर्षण मिश्रण को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस तक स्टोर करें
      नोट: प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम बनाए रखने के लिए लंबी अवधि के लिए निष्कर्षण मिश्रण को संग्रहित न करें।
  2. चरण अलग करने के लिए, पानी (एच 2 ओ) / मेथनॉल (मेओएच) का उपयोग करें।
    1. 100 एमएल एच 2 ओ: मेओएच की तैयारी के लिए, एच 2 ओ के 25 एमएल ऑफ मेओएच के 75 एमएल को एच 2 ओ: मेओएच (3: 1, वॉल / वॉल) बनाने के लिए जोड़ें।
    2. विलायक को एक साफ कांच की बोतल में स्थानांतरित करें जो एच 2 ओ: मेओएच मिश्रण से छींटा गया था। यह विलायक कमरे के तापमान पर कई हफ्तों तक संग्रहीत किया जा सकता है।

5. नमूने का निष्कर्षण

  1. पूर्व-कूल निष्कर्षण एमएक तरल कूलिंग सिस्टम या एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर का उपयोग करके मिश्रण (एमटीबीई: मेओएच, 3: 1, वॉल / वॉल) से -20 डिग्री सेल्सियस
  2. अनियमित नमूनों को एक-एक करके बाहर निकालें और प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए पूर्व ठंडा निष्कर्षण मिश्रण के 1 एमएल जोड़ें। सावधानी: एमटीबीई की कम चिपचिपाहट के कारण इस कदम को जल्दी से चलाएं।
  3. एक भंवर मिक्सर पर तुरन्त मिलाएं जब तक निकासी मिश्रण के अंदर ऊतक को अच्छी तरह समरूप नहीं किया जाता है।
    नोट: यह कदम बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह प्रोटीन को वेग करने के लिए आवश्यक है और उनकी एंजाइमी गतिविधियों को निष्क्रिय नहीं करता है।
  4. 4 9 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 100 आरपीएम पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर सभी नमूने सेते हैं।
  5. एक बर्फ कूल्ड सोओनाशन बाथ में 15 मिनट के लिए नमूनों को दोहराएं।

6. फेज अलगाव द्वारा फैलाव

  1. प्रत्येक नमूना ट्यूब में 650 μL एच 2 ओ: मेओएच (3: 1, वॉल / वॉल) जोड़ें।
  2. 1 मिनट के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह मिक्स करें
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 20,000 x ग्रा की गति पर नमूनों को अपकेंद्रित करें
    नोट: इस चरण के बाद, ट्यूब के निचले भाग में एक ठोस गोली के साथ दो अमिषीय तरल चरण होते हैं।
    सावधानी: दो तरल चरणों के मिश्रण से बचने के लिए ट्यूबों को सावधानी से संभाल लें और उपजी गोली को खदेड़ने से बचें।

7. ध्रुवीय और हाइड्रोफोबिक अंशों का विभाजन करना

  1. ऊपरी, लिपिड युक्त चरण से विलायक के 500 μL को स्थानांतरित करें, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में लेबल करें।
    नोट: विशेषाधिकृत लिपिड नमूनों को तत्काल यूपीएलसी-एमएस विश्लेषण (चरण 8.1) के लिए सीधा किया जा सकता है या कई -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. 500 μL नमूना से हटा दिए जाने के बाद, एक 200 μL विंदुक का उपयोग करते हुए शेष लिपिड चरण को हटा दें।
  3. निचले चरण (ध्रुवीय और अर्ध-ध्रुवीय चयापचयों) से विलायक के 400 μL को एक लेबल 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ़्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। निर्विवाद ध्रुवीय नमूने सीधे तत्काल यूपीएलसी-एमएस विश्लेषण (चरण 8.2) के लिए केंद्रित हो सकते हैं या संग्रहीत करने के लिए-80 डिग्री सेल्सियस पर कई सप्ताह
  4. अतिरिक्त विश्लेषण करने के लिए 200 μL का एक अतिरिक्त विभाज्य लें, जैसे कि गैस क्रोमैटोग्राफी-आधारित मेटाबोलाइट विश्लेषण के अनुसार अनमोल 16 वर्णित है।
  5. अतिरिक्त मात्रा बंद pipetting द्वारा जलीय चरण के शेष निकालें।
  6. 500 μL मेथनॉल के साथ प्राप्त प्रोटीन, स्टार्च, सेल दीवार गोली धो लें और इसे 1 मिनट के लिए भंवर डालें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी की गति से नमूनों को अपकेंद्रित करें
  8. प्रोटीन निष्कर्षण और पाचन (चरण 11) या स्टार्च / सेल दीवार विश्लेषण के रूप में पहले 16 वर्णित
    नोट: यदि तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो ये छर्रों को कई हफ्तों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

8. एकाग्रता और अंश का भंडारण

  1. लिपिड नमूनों से विलायक (चरण 7.1 से) या तो एक वैक्यूम सांद्रक में बिना 1-2 घंटे के लिए वाष्पीकरण करना या अधिमानतः नाइट्र का उपयोग करनालिपिड के ऑक्सीडेटिव संशोधनों से बचने के लिए ओएनजी प्रवाह बाष्पीकरण।
    नोट: सूखे नमूनों का तुरंत विश्लेषण किया जाना चाहिए। भंडारण के लिए, एमटीबीई समाधान में नमूने छोड़ें, आदर्श ग्लास शीशियों (चरण 7.1) में।
  2. सॉल्वेंट को जलीय नमूनों (चरण 7.3 या 7.4 से) से बिना किसी वैक्यूम कॉन्ट्रैटर में रात भर हीटिंग के बिना लुप्त हो जाना। नोट: विश्लेषण किए जाने से पहले सूखे नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर कई हफ्तों तक संग्रहीत किया जा सकता है।

9. यूपीएलसी-एमएस 24 का प्रयोग करके लिपिड्स का विश्लेषण

  1. एसिटोनिट्रिले के 400 μL में सूखे लिपिड अंश (चरण 8.1 से) को दोबारा स्थगित करें: 2-प्रोपेनॉल (7: 3, वॉल / वॉल्यूम)।
  2. गिलास शीशियों और टोपी के लिए पर्याप्त तरल स्थानांतरण
  3. एक ठंडा आटोसामप्लर (4 डिग्री सेल्सियस) में गिलास शीशियों को रखें।
  4. प्रति नमूना 2 μL इंजेक्ट करें और 400 μL / मिनट की प्रवाह दर पर चल रहे एक यूपीएलसी प्रणाली का उपयोग करते हुए 60 डिग्री सेल्सियस पर रिवर्सेड चरण (आरपी) सी 8 कॉलम पर लिपिड अलग करें।
  5. मोबाइल का उपयोग करेंक्रोमैटोग्राफिक अलग होने के लिए तालिका 1 में वर्णित चरणों।
  6. मास स्पेक्ट्रा को सकारात्मक और नकारात्मक आयनीकरण मोड में एक उपयुक्त एमएस उपकरण का उपयोग करके 150 से 1500 एम / जेड के बीच जन श्रेणी को कवर किया गया।

10. यूपीएलसी-एमएस 25 का उपयोग करके ध्रुवीय और अर्ध-ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण

  1. 200 μL UPLC- ग्रेड मेथनॉल में पानी ध्रुवीय चरण (चरण 8.2 से) को फिर से निलंबित करें: पानी (1: 1, वॉल्यूम / वॉल्यूम)।
  2. गिलास शीशियों और टोपी के लिए पर्याप्त तरल स्थानांतरण
  3. एक ठंडा आटोसामप्लर (4 डिग्री सेल्सियस) में गिलास शीशियों को रखें।
  4. प्रत्येक नमूने से 2 μL इंजेक्षन करें और 400 μL / मिनट की प्रवाह दर पर चल रहे एक यूपीएलसी प्रणाली का उपयोग करके 40 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित आरपी सी 18 कॉलम पर मेटाबोलाइट्स अलग करें।
  5. तालिका 2 में दी गई पैरामीटर के साथ क्रोमैटोग्राफिक अलग होने के लिए मोबाइल चरणों का उपयोग करें
  6. सकारात्मक और नकारात्मक आयनीकरण मोड में पूर्ण स्कैन जन स्पेक्ट्रा प्राप्त करेंएक उपयुक्त जन स्पेक्ट्रोमीटर को 50 और 1,500 मी / जेड के बीच एक बड़े पैमाने पर सीमा को कवर करते हुए

11. प्रोटीन एक्सट्रैक्शन, पाचन और विश्लेषण 16

  1. पसंद के प्रोटीन निष्कर्षण बफर के 200 μL में धोया हुआ प्रोटीन / स्टार्च / सेल दीवार गोली (चरण 7.8 से) को पुनः निलंबित करें। नोट: हम यूरिया / थियोरिया बफर (5 एम यूरिया, 2 मिमी थियोरिया, 15 मिमी डीटीटी, 2% सीएपीएस और प्रोटीज और फॉस्फेटस इनहिबिटरस) का उपयोग करते हैं।
  2. एक बर्फ कूल्ड ध्वनि स्नान में 10 मिनट के लिए नमूनों को दोहराएं।
  3. कमरे के तापमान पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन (100 आरपीएम) पर 30 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
  4. 5 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम में भंग प्रोटीन अपकेंद्रित्र
  5. एक नई ट्यूब में प्रोटीन सतह पर तैरनेवाला लीजिए
  6. एकत्र सतह पर तैरने वाले 28 से प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें
  7. पसंद के एक प्रोटोकॉल के साथ प्रोटीन में 50 ग्राम प्रोटीन डाइजेस्ट करें आमतौर पर, ट्रिप्सिन / लिस-सी मिश्रण एसीडीआई का उपयोग करेंनिर्देश मैनुअल के लिए एनजी
  8. पाचन के बाद, सी 18 चरण की युक्तियों का उपयोग करते हुए पेप्टाइड्स को हटाने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले और पचाने वाली पेप्टाइड्स 29 को नमस्कार करें।
  9. वैक्यूम कॉन्ट्रैटर में बिना सुखाने के नमूनों को बिना हीटिंग के ध्यान केंद्रित करें।
  10. नमूनों को उचित लोडिंग बफर (जैसे 5% एसिटोनिट्रीले, 0.5% फॉर्मिक एसिड) में पुन: निलंबित करना और एलएसी-एमएस / एमएस द्वारा नैनो एलसी सिस्टम से जुड़ा एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन जन स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके पेप्टाइड मिश्रण का विश्लेषण करना।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत अनुकरणीय प्रोटिओमिक्स डेटा सेट में, हमने तालिका 3 में वर्णित रूप में एक ढाल का उपयोग किया था।
  11. मास स्पेक्ट्रोमीटर सेट करें, एक शीर्ष 15 रणनीति का उपयोग करके, जहां एक पूर्ण स्कैन (एफएस) को 15 डेटा आश्रित एमएस / एमएस स्कैन के द्वारा निम्नलिखित पैरामीटरों के साथ पीछा किया गया था: एफएस बड़े पैमाने पर 200-2000 मी / जेस में था 3x10 6 आयनों के लक्ष्य मूल्य के साथ 70,000 का एक संकल्प। उच्च-एनई द्वारा डेटा-आधारित एमएस / एमएस स्कैन प्राप्त करेंRG collisional dissociation (HCD) एमएस / एमएस को 1e 5 आयनों के लिए लक्ष्य मूल्य निर्धारित करें, 50 एमएस के अधिकतम आयन भरण समय, 4.0 एम / जेड की अलगाव विंडो, 30% की सामान्य टक्कर ऊर्जा (एनसीई) और 1% का एक अंडरफिल अनुपात। संकल्प 17.500 में एमएस / एमएस आयनों को मापें और गतिशील बहिष्कार 60 एस के लिए सेट किया गया था

Representative Results

जटिल बहुआयामी डेटा सेट जटिल जैविक प्रणालियों की समझ के लिए अमूल्य हैं। एक सफल जैविक प्रयोग की रणनीति आम तौर पर एक सार्थक प्रयोगात्मक डिजाइन, प्रयोग सेट-अप और प्रदर्शन से शुरू होती है, नमूना संग्रह, निष्कर्षण, विश्लेषणात्मक डेटा अधिग्रहण, कच्चे डेटा प्रोसेसिंग, सांख्यिकीय डेटा विश्लेषण, प्रासंगिक मेटाबोलाइट और जैविक डेटा व्याख्या मार्ग मैपिंग और विज़ुअलाइज़ेशन ( चित्रा 1 ) सहित।

निष्कर्षण प्रोटोकॉल में यहां पेश किया गया है, हम नमूना-संग्रह, हैंडलिंग और -राउक्शन चरणों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो चित्र 2 में विस्तृत कार्यप्रवाह अवलोकन में दर्शाए गए हैं। प्रदर्शन के प्रयोजनों के लिए, 50 मिलीग्राम अरबिडोप्सिस के टिशू का चयन किया गया था। यह सामग्री तीनों को पेश करने से पहले इसे काटा, जमीन और निकाला गया थाअनुकरणीय विश्लेषणात्मक यूपीएलसी-एमएस प्लेटफार्म, डेटा प्रदान करते हैं जिसका उपयोग लक्षित और अलक्षित लिपिडॉमिक, मेटाबोलामीक और प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। आंकड़े 2 और 6 अतिरिक्त, मानक स्थितियों के तहत, निकासी विलायक की तरह दिखना चाहिए की प्रतिनिधि चित्रों को शामिल करना चाहिए। इसके अतिरिक्त, उपसामयिक अणुओं (प्रोटीन और स्टार्च) और अनुपयुक्त नमूना homogenization के नमूनों के अत्यधिक मात्रा वाले नमूनों के उदाहरण दिखाए गए हैं ( चित्रा 3 )। इन दो सामान्य समस्याओं के लिए समस्या निवारण चित्रा 3 में संक्षेप में दिया गया है, लेकिन यह हमारे पिछले प्रकाशन 16 में अधिक विस्तार से भी चर्चा की गई है।

आंकड़े 4 और 5 लिपिड, ध्रुवीय / सेमी से व्युत्पन्न तीन विश्लेषणात्मक वर्णगुणों का रूपरेखा उदाहरणI- ध्रुवीय चयापचयों और प्रोटीन विश्लेषण ऊपरी एमटीबीई चरण ( चित्रा 2 ) से ली गई लिपिड्स, का विश्लेषण किया गया था रिवर्सेड चरण (आरपी) सी 8 अल्ट्रा परफॉर्मेंस तरल क्रोमैटोग्राफी जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री से जोड़ा गया था। सकारात्मक और नकारात्मक एमएस ionization मोड ( चित्रा 4 , ऊपरी फलक) 16 , 24 का उपयोग करके लिपिड प्राप्त कर सकते हैं।

ध्रुवीय और अर्ध-ध्रुवीय प्राथमिक और माध्यमिक चयापचयों का विश्लेषण ध्रुवीय (पानी / मेथनॉल) चरण ( चित्रा 2 ) द्वारा उलट चरण (आरपी) सी 18 यूपीएलसी-एमएस 25 द्वारा किया गया । उलट चरण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करते हुए सचित्र पद्धति, अर्ध-ध्रुवीय चयापचयों (अर्थात पौधे के माध्यमिक चयापचय से चयापचयों) के विश्लेषण के लिए बेहद संगत है, जो कि एमएस में सकारात्मक और नकारात्मक ionization मोड का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है।( चित्रा 4 , कम फलक) 16 इस अंश (शर्करा, ध्रुवीय अमीनो एसिड इत्यादि) से अधिक हाइड्रोफिलिक चयापचयों, जो विपरीत चरण सामग्री पर अच्छा प्रतिधारण नहीं दिखाते हैं, का विश्लेषण अन्य विश्लेषणात्मक तरीकों जैसे जीसी-एमएस 16 या हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन तरल क्रोमैटोग्राफी 30 द्वारा किया जा सकता है।

निष्कर्षण ट्यूब ( चित्रा 2 ) के निचले भाग में ठोस गोली से निकाली गई प्रोटीन, शॉट बंदूक एलसी-एमएस ( चित्रा 5 ) का उपयोग करके पचाने और विश्लेषण किया गया था, जबकि स्टार्च और सेल दीवार की निकासी के लिए प्रोटोकॉल सामग्री को हमारे पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 16 से प्राप्त किया जा सकता है

सारांश में, 200 से अधिक लिपिड प्रजातियां, 50 एनोटेटेड अर्ध-ध्रुवीय चयापचयों और कई हजार प्रोटीयएनएस नियमित रूप से हमारे उदाहरण में प्रयुक्त प्रकार के नमूनों से पहचाना जा सकता है। इसके अतिरिक्त, विधि ने विभिन्न ऊतकों, अंगों और सेल संस्कृति सामग्री ( चित्रा 6 ) का उपयोग करते हुए व्यापक प्रयोज्यता दिखायी।

आकृति 1
चित्रा 1: बड़े पैमाने पर अलंकृत ऑमिक्स विश्लेषण के लिए सामान्य वर्कफ़्लो इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 चित्रा 2 : एक जैविक नमूना के एक एकल विभाज्य से लिपिड्स, मेटाबोलाइट्स और प्रोटीन्स के विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करना और निष्कर्षण कार्यप्रवाह।इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3 : दो-चरण विभाजन निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करके सामान्य रूप से निगमित समस्याओं के उदाहरणों को दर्शाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 : अरबिडोप्सिस थलियाना लीफ एक्सट्रैक्ट्स से लिपिड और अर्ध-ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स के प्रतिनिधि क्रोमैटोग्राम । बेस पीक क्रोमैटोग्रामलिपिड्स (ऊपरी फलक) और अर्ध-ध्रुवीय चयापचयों (कम फलक) का विश्लेषण सकारात्मक आयनाईकरण मोड 16 में किया जाता है । प्रत्येक क्रोमैटोग्राम के ऊपरी दाएं कोने में पाई चार्ट अलग-अलग रासायनिक वर्गों को निर्दिष्ट लिपिड और चयापचयों की संख्या को दर्शाता है। च्लोए, क्लोरोफिल; डैग, डायसीलेग्लिसराइड; डीजीडीजी, डिएगालेक्टोसिडियलिग्लिसराल; एफए, फैटी एसिड; LysoPC, लियोसोफोस्फेटिडाइलक्लाइन; एमजीडीजी, मोनोगैलेक्टोसिडियलिग्लिसराल; पीसी, फास्फेटिडाइलकोलिन; पीई, फास्फेटिडेलेथानोलमाइन; पीजी, फास्फेटिडाइलग्लिसराल; पीआई, फास्फेटिडाइलिनोजिटोल; पीएस, फास्फेटिडाइलेसेरिन; एसपी, स्पिंगोलिपिड; एसक्यूडीजी, सल्फ़ोक्विनोवोसिल्डियसीलिग्लिसराल; टैग, ट्राइसीलेग्लिसराइड इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5 Trong>: Arabidopsis thaliana पत्ता निष्कर्षों से पेप्टाइड्स के प्रतिनिधि बेस पीक क्रोमैटोग्राम ।
ऊपरी दाएं कोने में पाई चार्ट दिखाता है कि विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं को निर्दिष्ट प्रोटीनों की संख्या 16 है । इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6 : प्रतिनिधि एक्सट्रैक्शन विभिन्न प्रकार के ऊतक प्रकार के उदाहरण, जंगली प्रकार के अरबिडोप्सिस थलियाना से ।
सभी नमूने संकेतित ऊतकों से 50 मिलीग्राम ताजे वजन का उपयोग करके निकाले गए थे।"> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<टीडी> 19.50 से 1 9 .51 मिनट
समय (मिनट) % बफर ए से बफर बी
0 से 1 मिनट 45% ए बफर ए: 1% 1 एम एनएच 4-एसीटेट, यूपीएलसी एमएस ग्रेड पानी में 0.1% एसिटिक एसिड
1 से 4 मिनट रैखिक ढाल 45% से 25% ए बफर बी: 1% 1 एम एनएच 4-एसीटेट, एसिटोनिट्रीले / आईसोप्रोणोल में 0.1% एसिटिक एसिड 7: 3, (वी: वी)
4 से 12 मिनट रैखिक ढाल 25% ए से 11% ए फ्लो दर 400 μL / मिनट
12 से 15 मिनट रैखिक ढाल 11% ए से 0% ए इंजेक्शन मात्रा 2 μL
15 से 1 9 .5 मिनट 4.5 मिनट के लिए कॉलम को 0% ए से धोएं
45% ए पर वापस सेट करें
19.51 से 24 मिनट 45% ए के साथ संतुलित करें

तालिका 1: आरपी-यूपीएलसी लिपिड्स के पृथक्करण के लिए ढाल पैरामीटर आरपी, उलट चरण यूपीएलसी, अल्ट्रा-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी

समय (मिनट) % बफर ए से बफर बी
0 से 1 मिनट 99% ए बफर ए: यूपीएलसी ग्रेड पानी में 0.1% फार्मिक एसिड
1 से 11 मिनट रैखिक ढाल 99% ए से 60% ए बफर बी: यूपीएलसी ग्रेड एसिटोनिट्रिले में 0.1% फार्मिक एसिड
11 से 13 मिनट रैखिक ढाल 60% ए से 30% ए फ्लो दर 4001, एल / मिनट
13 से 15 मिनट रैखिक ढाल 30% ए से 1% ए इंजेक्शन मात्रा 2 μL
15 से 16 मिनट 1 मिनट के लिए 1 मिनट के साथ स्तंभ 1 धो लें
16 से 17 मिनट रैखिक ढाल 1% से 99% ए
17 से 20 मिनट 99% ए पर 3 मिनट के लिए संतुलित करें

तालिका 2: आरपी-यूपीएलसी के लिए ढाल पैरामीटर ध्रुवीय और अर्ध-ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स के विभाजन। आरपी, उलट चरण यूपीएलसी, अल्ट्रा-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी

समय (मिनट) % बफर ब से बफर ए
0 से 5 मिनट 0 से 10% तक रैखिक ढाल बफर ए: यूपीएलसी ग्रेड पानी में 0.1% फार्मिक एसिड
5 से 80 मिनट रैखिक ढाल 10% से 40% तक बफर बी: 60% यूपीएलसी ग्रेड एसिटोनिट्रीले में 0.1% फार्मिक एसिड
80 से 85 मिनट रैखिक ढाल 40% से 60% तक फ्लो दर 300 एनएल / मिन
85 से 86 मिनट रैखिक ढाल 60% से 95% तक इंजेक्शन मात्रा 5 μL
86 से 91 मिनट 5 मिनट के लिए 95% के साथ धो कॉलम
91 से 92 मिनट रैखिक ढाल 95% से 0%
93 से 110 मिनट 0 मिनट के लिए स्तंभ को संतुलित करना 0%

तालिका 3: पेप्टाइड्स के नैनो-एलसी पृथक्करण के लिए ढाल पैरामीटर एलसी, तरल क्रोमैटोग्राफी

Discussion

इस लेख में, हम एक एकल 50 मिलीग्राम लीप नमूने से व्यापक लिपिडोमिक, मेटाबोलामोइक और प्रोटियोमिक विश्लेषण के लिए सरल और अत्यधिक लागू निष्कर्षण प्रोटोकॉल का वर्णन और वर्णन करते हैं। इस विधि का कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है, जो 17 , 18 , 1 9 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 के विभिन्न लेखों में प्रकाशित हुए हैं। और इसके सीधे-आगे के अलावा साबित हुएकार्यप्रवाह और उच्च प्रयोज्यता मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य

यहां दिए गए आवेदन एक जटिल जैविक नमूने की प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए कुछ नियमित तरीके दिखाते हैं। इन सचित्र बड़े पैमाने पर मेटाबोलामोिक और लिपिडोमिक डेटा सेट विश्लेषण जैविक प्रणाली के चयापचय में व्यापक या विशिष्ट परिवर्तनों के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान कर सकते हैं, जबकि प्रोटीन के विश्लेषण से प्राप्त डेटा मात्रात्मक (बहुतायत) और गुणात्मक (संशोधनों) में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ) सेलुलर फ़ंक्शंस और मशीनरी को नियंत्रित करने वाले एंजाइम, स्ट्रक्चरल प्रोटीन या ट्रांसक्रिप्शन कारक (टीएफ) में परिवर्तन तदनुसार, समेकित ओमिक्स डेटा में विशिष्ट चयापचय मार्गों या सेलुलर प्रक्रियाओं से संबंधित विविध अणुओं के आणविक परिवर्तनों को बताकर, जैविक प्रणाली के आनुवंशिक या जैविक और / या अबायोटिक उलझनियों द्वारा प्रेरित संभावित परिवर्तनों के बारे में प्रारंभिक जानकारी प्रकट करने की क्षमता है।

बेशक, दीर्घकालिक में, एक सफल सिस्टम जीव विज्ञान विश्लेषण के लिए, विश्लेषित और एनोटेट किए गए आणविक संस्थाओं की संख्या को अधिकतम करने के लिए, सेलुलर फ़ंक्शंस की निगरानी और संभवतः पूरी तरह से गतिविधियों की अनुमति देने के लिए, यह काफी आवश्यक है। इस प्रयोजन के लिए, प्राप्त किए गए अंश भिन्न वैश्वीकृत विश्लेषणात्मक विधियों के लिए अतिरिक्त रूप से लागू हो सकते हैं, और आगे यौगिक या मिश्रित कक्षाएं ( चित्रा 4 ) को लक्षित कर सकते हैं।

यह कहने के बाद, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि प्राप्त आंकड़ों की वैश्विक विश्लेषण रणनीति दो अलग-अलग रणनीतियों का पालन कर सकती है: एक तरफ, हम ज्ञात परिसरों की मात्रा का ठहराव करके सेलुलर फ़ंक्शन की व्याख्या को बल देते रहे हैं। दूसरी ओर, मापा चयापचयों और लिपिड के कई अभी तक ज्ञात या एनोटेट नहीं हैं। ये, फिर भी, संयुक्त राष्ट्र-एनोटेट यौगिक मापन में बहुत सारी सार्थक जानकारी भी होती है, जिसका उपयोग वर्गीकरण या भेदभाव के लिए सांख्यिकीय तरीकों से किया जा सकता है।एटीन समूह या उपचार 20 , 21 , 22

फिर भी, इन अज्ञात यौगिकों, विशेष रूप से समूह वर्गीकरण के लिए प्रासंगिक या बायोमार्कर के रूप में सेवा करने वालों को पहचानने की आवश्यकता है। यह पहचान प्रक्रिया दुर्भाग्य से काफी कठिन है और अतिरिक्त विश्लेषणात्मक माप या रणनीति के बिना प्राप्त नहीं की जा सकती 38 । जैसा कि चित्रा 4 से देखा जा सकता है, संयुक्त राष्ट्र-एनोटेट यौगिकों की संख्या काफी अधिक है (वास्तव में विशाल बहुमत)। फिर भी, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, इन क्रोमैटोग्राफिक चोटियों को डेटा विश्लेषण में संभाला जा सकता है और इसलिए महत्वपूर्ण प्रभावित संस्थाओं को स्पष्ट किया जा सकता है और आगे की पहचान रणनीतियों के अधीन किया जा सकता है।

संक्षेप में, हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रायोगिक प्रणालियों के जीवविज्ञान के लिए और शास्त्रीय सांख्यिकीय आवेदकों के लिए कई लाभ प्रदान करता हैations।

सबसे पहले, क्योंकि सभी अंश एक नमूने से निकाले जाते हैं, विभिन्न प्रयोगात्मक डेटा सेट (लिपिड्स, मेटाबोलाइट्स, प्रोटीन) के बीच अंतर काफी कम हो जाता है क्योंकि प्रत्येक डेटा सेट उसी नमूना विभाज्य से प्राप्त होता है यह स्पष्ट रूप से प्राप्त परिणाम की वृद्धि की तुलनात्मकता की ओर जाता है।

दूसरा, विधि आसानी से स्केलेबल है और यह इसलिए छोटे से बड़े नमूना मात्रा के साथ बेहद संगत बनाता है। हम नियमित रूप से 10-100 मिलीग्राम ऊतक नमूनों का उपयोग करते हैं, लेकिन सफल लिपिडॉमिक अध्ययन भी 20 अरबिडोप्सिस 31 के रूप में किए जाते हैं । विशेष रूप से छोटे नमूना मात्रा के साथ संगतता इस पद्धति को लागू करती है यदि सीमित मात्रा में जैविक ऊतकों या नमूने उपलब्ध हैं। फिर भी, भले ही पर्याप्त नमूना सामग्री उपलब्ध हो, यहां प्रस्तुत विधि में इन नमूनों का उपयोग करने के बजाय प्रयोगात्मक replicates की एक बड़ी संख्या में उपयोग करने के लिए लाभ प्रदान करता हैउन्हें विभिन्न निष्कर्षण प्रक्रियाओं के लिए गाएं यह एक बेहतर और परिष्कृत सांख्यिकीय डेटा विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।

तीसरा, चूंकि यह विधि ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय अणुओं के तरल-तरल विभाजन पर आधारित है, यह सरल एक चरण निष्कर्षण विधियों ( जैसे मेथनॉल निष्कर्षण) के विपरीत प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण डी-कॉम्प्लेक्सिंग चरण प्रदान करता है। यह कुशल नमूना डी-कॉम्प्लेक्सिंग एक दूसरे से रासायनिक दखल अणुओं के पृथक्करण के कारण अलग-अलग अंशों के आंशिक शुद्धि की ओर ले जाता है। तदनुसार, रासायनिक विभाजन प्रक्रिया न केवल अलग-अलग रासायनिक वर्गों में निकाले गए नमूनों के व्यवस्थित भुखमरी के लिए एक व्यावहारिक लाभ प्रदान करती है, बल्कि व्यक्तिगत विश्लेषणात्मक माप को भी सुधारती है, क्योंकि यह भिन्न भिन्न भागों से संदूषित यौगिकों को हटाता है। स्पष्ट रूप से, हम देख सकते हैं कि विशेष रूप से लिपिड, जो कि जैविक चरण में विभाजित हैं और जो आमतौर पर नकारात्मक रूप से प्रभावित होते हैंध्रुवीय यौगिकों के क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण, ध्रुवीय अंश से लगभग पूरी तरह से अनुपस्थित रहेगा यह हाइड्रोफोबिक लिपिड के विश्लेषण के लिए भी सही है, जो ध्रुवीय यौगिकों के कम हो जाएगा। एक दूसरे से ध्रुवीय और गैर-विखंडन यौगिकों की शुद्धि के अलावा, हम नमूना से प्रोटीन और अन्य मैक्रो-अणुओं को कम करते हैं और इकट्ठा करते हैं, न कि केवल एक अलग अंश प्रदान करते हैं, जो प्रोटीन, स्टार्च और सेल दीवार विश्लेषण 16 के लिए उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह भी अलग-अलग हिस्सों में एक क्लीनर नमूना की ओर जाता है यह विशेष रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि यह ज्ञात है कि बड़े macromolecules की उपस्थिति, विश्लेषणात्मक कॉलम के नुकसान या कम से कम छोटा जीवनकाल की ओर जाता है।

अंतिम लेकिन कम से कम, वर्णित एमटीबीई निकासी विधि, जो कम खतरनाक और अधिक अनुकूल क्लोरोफॉर्म प्रतिस्थापन विलायक 15 पर निर्भर है, पहले से ही हमारे समूह से कई अध्ययनों से दिखाया गया है, व्यापक रूप सेपौधों 16 , शैवाल 17 , 18 , मक्खियों 19 से विभिन्न जैविक नमूने के लिए दक्षता , लेकिन कई स्तनधारी ऊतकों, अंगों या कोशिकाओं 20 , 21 , 22 ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

एमएस को जीईआरएलएस-डीएएडी कार्यक्रम से पूर्ण पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है। पांडुलिपि पर प्रूफ पढ़ने और टिप्पणी करने के लिए हम डॉ। एंड्रयू विस्ज़निव्स्की को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम मैक्स-प्लैंक इंस्टीट्यूट ऑफ आण्विक प्लांट फिजियोलॉजी, गोलम, जर्मनी में जीआईवलिस्को लैब के सभी सदस्यों के लिए उनकी मदद के लिए बहुत आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and standards
Ampicillin  Sigma Aldrich A9393-5G Internal standard for metabolites
Corticosterone  Sigma Aldrich 27840-500MG Internal standard for metabolites, HPLC grade
13C Sorbitol Sigma Aldrich 605514 Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC)  Avanti Polar Lipids 850360P Internal standard for lipids
Methanol (MeOH)  Biosolve Chemicals 13684102 ULC-MS grade
Water Biosolve Chemicals 23214102 ULC-MS grade
Methyl tert-butyl ether (MTBE)  Biosolve Chemicals 13890602 HPLC grade
Trypsin/Lys-C mix  Promega V5072 Enzymatic digestion of proteins
Equipment
Balance  Sartorius Corporation  14 557 572
Tissue grinding mixer mill  Retsch, Mixer Mill MM 300 20.746.0001
Mortar and pestle  Sigma Aldrich Z247464-1EA
Vortex mixer  Vortex-Genie 2, Model G560 SI-0236
Vacuum concentrator Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators 7.008.500.002
2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes  Eppendorf 30120094 Used for sample extarction
1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes  Eppendorf 30120086 Used for fractions
Shaker Eppendorf Thermomixer 5436 2050-100-05
Sonicator  USC 300 TH 142-0084
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf, model 5427R 22620701
UPLC system  Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK)
 MS system  Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany).
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) Waters, Machester, UK 186002878 Analysis of lipids
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles)  Waters, Machester, UK 186003539 Analysis of metabolites
Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system  Thermo-Fisher, Bremen, Germany Analysis of peptides

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Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample. J. Vis. Exp. (124), e55802, doi:10.3791/55802 (2017).

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