Summary
En protokoll for omfattende utvinning av lipider, metabolitter og proteiner fra biologiske vev ved bruk av en prøve presenteres.
Abstract
Forståelse av komplekse biologiske systemer krever måling, analyse og integrasjon av flere sammensatte klasser av levende celle, vanligvis bestemt av transkriptomiske, proteomiske, metabolomiske og lipidomiske målinger. I denne protokollen presenterer vi en enkel metode for reproduserbar ekstraksjon av metabolitter, lipider og proteiner fra biologiske vev ved bruk av en enkelt alikvot per prøve. Ekstraksjonsmetoden er basert på et metyl tert -butyleter: metanol: vannsystem for væske: flytende partisjonering av hydrofobe og polare metabolitter i to ublandbare faser sammen med utfelling av proteiner og andre makromolekyler som en fast pellet. Denne metoden gir derfor tre forskjellige fraksjoner av spesifikk molekylær sammensetning, som er fullt kompatible med vanics-teknologier med høy gjennomstrømning, slik som væskekromatografi (LC) eller gaskromatografi (GC) koblet til massespektrometre. Selv om metoden var initIalt utviklet for analyse av forskjellige plantevevsprøver, har det vist seg å være fullt kompatibelt for utvinning og analyse av biologiske prøver fra systemer som er så forskjellige som alger, insekter og pattedyrsvev og cellekulturer.
Introduction
Systembiologi, som kom fram i midten av forrige århundre 1 og ble avansert ved storskalaanalyse av genomiske og transkriptomiske datasett 2 , 3 , har utviklet seg til en ny og uunnværlig tilnærming til analyse av komplekse biologiske systemer 4 , 5 . Hovedmålet med systembiologi er å dechiffrere komponentinteraksjonene og avhengighetene i biologiske systemer og å bygge broen mellom genotyper, deres realisering, molekylære transformasjoner og resulterende fenotyper. Følgelig er integrasjonen av omfattende datasett, produsert av de ulike storskala analytiske tilnærmingene, nemlig genomics, transkriptomics, metabolomics, lipidomics og proteomics og deres beregningsanalyse, blitt en forutsetning for beskrivelse og forståelse av komplekse biologiske systemer.
Bas Redegjort for det store kjemiske mangfoldet og kompleksiteten av biologiske komponenter i ethvert levende system, bygger produksjonen av store og omfattende "omics" datasett sterkt på kvaliteten på den anvendte ekstraksjonsmetoden 9 . I tillegg til kvaliteten på ekstraksjonsmetoden er metodenes økonomi viktig; Dette betyr at det ville være ønskelig å få så mye molekylær informasjon fra så lite prøveinngang som mulig. Eksempelvis kan mengder av prøver være begrensende, og det er derfor svært ønskelig å benytte seg av en ekstraksjonsmetode som kan utlede så mange molekylære klasser fra en enkelt ekstraksjon av en gitt prøve. Dette betyr at i stedet for å bruke flere spesialiserte ekstraksjonsmetoder for ekstraksjon av forskjellige sammensatte klasser fra forskjellige prøveallikser av samme prøve, anvendes en sekvensiell ekstraksjonsmetode som fraksjonerer de molekylære bestanddelene av en enkelt alikvot i forskjellige molekylfraksjoner.
Den vanlige fremgangsmåten anvendt for disse fraksjonerte ekstraksjonsmetoder er basert på tofase-lipidekstraksjonsmetoden fra Folch et al., Utviklet i 1957 10. Denne metoden er basert på en kloroform: metanol / vann-oppdeling av polare og hydrofobe metabolitter og var Ment for å rydde opp og de-komplekse prøver for høy kvalitet lipid analyse. Med utviklingen av multi-omics systembiologi ble Folch-metoden ytterligere trinnvis forbedret ved å benytte den til prøvepartisjonering av proteiner og polare metabolitter og lipider for Gass- og væskekromatografibasert metabolomikk og lipidomik av polare og hydrofobe forbindelser, i tillegg til væskekromatografi-baserte proteomika 11 , 12 , 13 , 14. Dessverre er alle disse metodene avhengig av en kloroformbasert ekstraksjonsmetode, som ikke bare Fører til den uønskede foRation av proteinpellet som en interfase mellom polar- og lipidfasen, men som også er et uønsket løsningsmiddel fra et grønt kjemiperspektiv 15 , 16 . Løsningsmiddelet metyl- tert -butyleter (MTBE) overvinner imidlertid begge disse ovennevnte problemer og er en egnet erstatning for kloroform. Basert på disse kravene bestemte vi oss for å etablere en MTBE: metanol: vannbasert utvinningsmetode, som oppfyller alle ovennevnte spesifikasjoner og derfor fungerer som et ideelt utgangspunkt for omfattende multi-omics analyse 16 . Denne protokollen veileder brukeren trinn for trinn gjennom den enkle, raske og reproduserbare arbeidsflyten i prøvepreparatet, inkludert feilsøking av vanlige observerte problemer. Videre vil vi kort introdusere eksempler på analytiske data fra ultra-ytelse væskekromatografi-massespektrometri (UPLC-MS) -basEd lipidomics, metabolomics og proteomics profilering fra plantevevsprøver. Selv om de givne eksemplene er avledet fra 50 mg av en Arabidopsis thaliana leaf- vevsprøve , har denne protokollen blitt brukt til flere andre biologiske prøver og vev, inkludert alger 17 , 18 , insekter 19 og pattedyrceller, organer og vev 20 , 21 , 22 . Omfanget av den presenterte ekstraksjonsprotokollen er å gi en klar og detaljert beskrivelse av forhåndsekstraksjonsprøvehåndteringen og selve utvinningsfremgangsmåten. Selv om vi gir tre korte eksempler på analytisk søknad, kan du få detaljert informasjon om før og etter analytisk datahåndtering fra våre tidligere publikasjoner 16 , 23 , 24 ,
Protocol
Forsiktig : Metanol (MeOH) og metyl tert -butyleter (MTBE), som brukes under ekstraksjon, er brennbare og kan ved langvarig eksponering og / eller kontakt, åndedretts-, øye- eller hudirritasjon. Vennligst håndter dem forsiktig bare i en avtrekksdeksel og bruk de riktige sikkerhetsprosedyrene under ekstraksjonen (lab coat, vernebriller, hansker, etc. ). Flytende nitrogen og tøris, brukt i flere trinn i denne protokollen, kan forårsake alvorlige brannskader ved langvarig hudkontakt. Vennligst håndter dem forsiktig ved å bruke vernehansker og briller. Brukere kan bruke forskjellige kjemikalier, reagenser eller interne standarder for prøveanalyse, hvorav noen kan være giftige. Vennligst undersøk de relevante kjemikaliesikkerhetsdatabladene for alt materiale som brukes.
1. Innsamling og innhøsting av biologiske prøver
- Forbered merkede høstrør.
MERK: Her høst biologiske prøver i merket, 2 mL, rundbunn, trygt lokK mikrocentrifugerør som inneholder to 5 mm diameter metallboller for vevshomogenisatoren. - Forbered en fylt flytende nitrogen dewar.
- Høst den biologiske prøven og skru opp vevet i flytende nitrogen. Utfør dette trinnet så raskt som mulig innen få sekunder for å unngå metabolske endringer forårsaket av sår.
Merk: Bruk rosettblader fra 30-dagers wild-type Arabidopsis thaliana (Col-0) som vokser på jord under langdagsforhold, til demonstrasjonsformål. - Hold de høstede prøvene på tøris for kortvarig pauser eller lagre dem ved -80 ° C i lengre perioder.
2. Slipe- og vævsforstyrrelser
- Forkjøl rørholderne av vevshomogenisatoren i flytende nitrogen i minst 10 minutter. Hvis det ikke er en vevshomogenisator, bruk rene og forkjølte mørtel og pestler.
- Ta prøvene fra flytende nitrogen, tørr is eller -80 ° C fryser og legg dem i forkjøltRørholdere.
- Sett rørholderne raskt i vevshomogenisatoren.
- Grind det biologiske materialet i et fint og homogent pulver. Bruk 20 Hz i 1 min for blader.
Merk; Homogeniseringstid og -hastighet kan varieres avhengig av vevet, sørg for at prøven blir homogenisert i et fint pulver og at dette pulveret holdes frosset ved hvert trinn i homogeniseringen. - Ta de biologiske prøvene fra rørholderne og hold dem frosne til videre utvinning.
3. Veiing av væv
- Bruk en analytisk balanse med tilstrekkelig presisjon for de nødvendige prøvene.
- Klargjør et merket 2 ml rundbunns sikkerhetslås-mikrocentrifugerør.
- Forkjøl rørene og spatelene i flytende nitrogen.
- Aliquot den nødvendige mengden vevspulver inn i 2 ml safe-lock mikrocentrifugerøret.
Forsiktig: Unngå avfrosting av plantematerialet ved å minimere tiden som er tatt til wI nærheten av prøvene. - Returner de alikvoterte prøvene umiddelbart etter veiing til flytende nitrogen.
- Legg inn nøyaktig vekt for hver prøve. Bruk 10-50 mg ± 10% for de fleste plantevev.
- Oppbevar alikvotene ved -80 ° C til ytterligere ekstraksjon.
4. Reagensoppsett
- Bruk en ekstraksjonsblanding av metyl tert -butyleter (MTBE) / metanol (MeOH).
- Til fremstilling av 100 ml ekstraksjonsløsningsmiddel, tilsett 75 ml MTBE til 25 ml MeOH for å lage en blanding av MTBE: MeOH (3: 1, vol / vol).
- Legg til interne standarder for normalisering av postanalysen i henhold til analytiske behov. Typiskt tilsettes 50 μl 1,2-diheptadecanoyl- sn -glycero-3-foskokolin (1 mg / ml i kloroform) som en intern standard for UPLC-MS-basert lipidanalyse, mens man tilsetter 50 ul 13 C sorbitol ( 1 mg / mL i vann) som interne standarder for GC-MS-basert analyse av primærmetabolitter. Interne standarder for UPLC-MS-basert metabolittanalyse er 50 μl kortikosteron (1 mg / mL i metanol) og 25 μl ampicillin (1 mg / ml i metanol).
- Overfør løsningsmidlet til en ren glassflaske som ble skyllet med MTBE: MeOH-blanding.
- Oppbevar ekstraksjonsblandingen i opptil 1 uke ved 4 ° C.
MERK: Ikke lag ekstraksjonsblandingen i lengre perioder for å opprettholde reproducerbare resultater.
- For å indusere faseseparasjon, bruk vann (H 2 O) / metanol (MeOH).
- Til fremstilling av 100 ml H20: MeOH, tilsett 75 ml H20 til 25 ml MeOH for å lage H20: MeOH (3: 1, vol / vol).
- Overfør løsningsmidlet til en ren glassflaske som ble skyllet med H20: MeOH-blanding. Dette løsningsmidlet kan lagres i flere uker ved romtemperatur.
5. Ekstraksjon av prøver
- Forkjøl ekstraksjonen mIxtur (MTBE: MeOH, 3: 1, vol / vol) til -20 ° C ved bruk av et flytende kjølesystem eller en -20 ° C fryser.
- Ta ut alikvoterte prøver en etter en, og tilsett 1 ml av den forkjølte ekstraksjonsblandingen til hvert prøverør. Forsiktig: Utfør dette trinnet raskt på grunn av MTBEs lave viskositet.
- Bland umiddelbart på en vortexblander til vevet er godt homogenisert i ekstraksjonsblandingen.
MERK: Dette trinnet er svært viktig, siden det er nødvendig å utfelle proteinene og inaktivere deres enzymatiske aktiviteter. - Inkuber alle prøvene på en orbital shaker ved 100 rpm i 45 minutter ved 4 ° C.
- Sonikat prøvene i 15 minutter i et isavkjølt sonikasjonsbad.
6. Fraksjonering ved faseseparering
- Tilsett 650 μl H20: MeOH (3: 1, vol / vol) til hvert prøverør.
- Bland godt ved vortexing i 1 min.
- Sentrifuger prøvene med en hastighet på 20.000 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
MERK: Etter dette trinnet er det to ublandbare væskefaser med en solid pellet i bunnen av røret.
Forsiktig: Håndter rørene forsiktig for å unngå blanding av de to væskefasene og unngå å forstyrre den utfelte pelleten.
7. Aliquoting av polare og hydrofobe fraksjoner
- Overfør 500 μl av løsningsmidlet fra den øvre lipidholdige fasen til et merket 1,5 ml mikrocentrifugerør.
MERK: De alikvoterte lipidprøver kan direkte konsentreres for umiddelbar UPLC-MS analyse (trinn 8.1) eller lagres i flere uker ved -80 ° C. - Når 500 μL er fjernet fra prøven, fjern den gjenværende lipidfasen ved hjelp av en 200 μl pipette.
- Overfør 400 μL av løsningsmidlet fra den nedre fasen (polære og semi-polare metabolitter) til et merket 1,5 ml mikrocentrifugerør. De alikvoterte polarprøver kan direkte konsentreres for umiddelbar UPLC-MS analyse (trinn 8.2) eller lagret forR adskillige uker ved -80 ° C.
- Ta en ekstra alikvot på 200 μL for å utføre tilleggsanalyse, for eksempel gasskromatografibasert metabolittanalyse som beskrevet dyrt 16 .
- Fjern resten av den vandige fasen ved pipettering av overflødig volum.
- Vask det oppnådde proteinet, stivelsen, celleveggpellet med 500 μL metanol ved grundig vortexing den i 1 min.
- Sentrifuger prøvene med en hastighet på 10.000 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
- Utfør proteinutvinning og fordøyelse (trinn 11) eller stivelse / cellevegganalyse som beskrevet tidligere 16 .
MERK: Hvis de ikke brukes umiddelbart, kan disse pellets lagres i flere uker ved -80 ° C.
8. Konsentrasjon og lagring av fraksjoner
- Fordamp løsningsmidlet fra lipidprøver (fra trinn 7.1) i enten vakuumkoncentrator uten oppvarming (i 1-2 timer) eller bruk fortrinnsvis en nitrOgen-flytende fordamper for å unngå oksidative modifikasjoner av lipidene.
MERK: Tørkede prøver skal analyseres umiddelbart. For oppbevaring, la prøver i MTBE-oppløsning, helst i glassflasker (trinn 7.1). - Fordamp løsningsmiddelet fra de vandige prøvene (fra trinn 7.3 eller 7.4) natten over i vakuumkoncentrator uten oppvarming. MERK: De tørkede prøvene kan lagres i flere uker ved -80 ° C før analyse.
9. Analyse av lipider ved anvendelse av UPLC-MS 24
- Resuspender de tørkede lipidfraksjonene (fra trinn 8.1) i 400 ul acetonitril: 2-propanol (7: 3, vol / vol).
- Overfør tilstrekkelig væske til glass hetteglass og hette tett.
- Sett glassglassene i en avkjølt autosampler (4 ° C).
- Injiser 2 μL per prøve og separer lipidene på en reversert fase (RP) C 8 kolonne holdt ved 60 ° C ved bruk av et UPLC-system som kjører ved en strømningshastighet på 400 μl / min.
- Bruk mobilenFaser beskrevet i tabell 1 for kromatografisk separasjon.
- Oppnå massespektrene i positiv og negativ ioniseringsmodus ved å bruke et egnet MS-instrument som dekker massespekteret mellom 150 og 1500 m / z.
10. Analyse av polære og semi-polare metabolitter ved bruk av UPLC-MS 25 .
- Re-suspendere polarfasen (fra trinn 8.2) i 200 ul UPLC-metanol: vann (1: 1, vol / vol).
- Overfør tilstrekkelig væske til glass hetteglass og hette tett.
- Sett glassglassene i en avkjølt autosampler (4 ° C).
- Injiser 2 μL fra hver prøve og separer metabolittene på en RP C 18 kolonne holdt ved 40 ° C ved bruk av et UPLC-system som kjører ved en strømningshastighet på 400 μl / min.
- Bruk mobilfasene for kromatografisk separasjon med parametrene gitt i tabell 2 .
- Skaff fullskala massespektre i positiv og negativ ioniseringsmodus ossEt passende massespektrometer som dekker et massespekter mellom 50 og 1500 m / z.
11. Proteinekstraksjon, fordøyelse og analyse 16
- Resuspender den vaskede protein / stivelse / celleveggpellet (fra trinn 7.8) i 200 μl av den valgte proteinekstraksjonsbufferen. Merk: Vi bruker urea / tiourea buffer (5 M urea, 2 mM tiourea, 15 mM DTT, 2% CHAPS og protease og fosfatase inhibitorer) 27 .
- Sonikat prøvene i 10 minutter i et iskjølt lydbad.
- Inkuber prøver i 30 minutter på en orbital shaker (100 rpm) ved romtemperatur.
- Sentrifuger de oppløste proteiner ved 10 000 x g i 5 minutter.
- Samle protein supernatanten i et nytt rør.
- Bestem proteinkonsentrasjonen fra den oppsamlede supernatanten 28 .
- Fordel 50 μg protein i oppløsning med en valgfri protokol. Bruk vanligvis Trypsin / Lys-C mix accordiNg i bruksanvisningen.
- Etter fordøyelsen, utføre desalting av peptidene før massespektrometri ved hjelp av C18-trinnstip og eluere de fordøyede peptidene 29 .
- Konsentrér prøvene til nær tørrhet i vakuumkoncentrator uten oppvarming.
- Tilbakestill prøvene i passende lastebuffer (f.eks. 5% acetonitril, 0,5% myresyre) og analyser peptidblandingene ved LC-MS / MS ved bruk av et høyoppløselig massespektrometer koblet til et nano-LC-system.
MERK: I det eksemplariske proteomikdatasettet som presenteres i denne protokollen, brukte vi en gradient som beskrevet i tabell 3 . - Sett massespektrometeret ved hjelp av en topp 15-strategi, hvor en full skanning (FS) ble fulgt av opptil 15 dataavhengige MS / MS-skanninger, til følgende parametere: FS var i massespekteret 200-2000 m / z ved En oppløsning på 70.000 med en målverdi på 3x10 6 ioner. Hent data-avhengige MS / MS-skanninger av høyere-enRgy kollisional dissosiasjon (HCD). Angi målverdiene for MS / MS til 1e 5 ioner, med en maksimal ionfyllingstid på 50 ms, et isolasjonsvindu på 4,0 m / z, normalisert kollisionsenergi (NCE) på 30% og et underfyllingsforhold på 1%. Mål MS / MS-ioner ved en oppløsning 17.500, og den dynamiske ekskluderingen ble satt til 60 s.
Representative Results
Omfattende multi-omics datasett er uvurderlige for forståelse av komplekse biologiske systemer. Strategien for et vellykket biologisk eksperiment starter vanligvis fra en meningsfull eksperimentell design, eksperimentoppsett og ytelse, etterfulgt av prøveinnsamling, utvinning, analytisk datainnsamling, rå databehandling, statistisk dataanalyse, identifisering av relevant metabolitt og biologisk datafortolkning Inkludert kartlegging av kart og visualisering ( figur 1 ).
I utvinningsprotokollen som er introdusert her, fokuserer vi på prøveinnsamling, -håndtering og -ekstraksjonstrinn, som er avbildet i detaljert arbeidsflytoversikt i figur 2 . For demonstrasjonsformål ble 50 mg Arabidopsis bladvev valgt. Dette materialet ble høstet, malt og ekstrahert før det ble underkastet treEksempler på analytiske UPLC-MS-plattformer, som gir data som kan benyttes for målrettet og ikke-målrettet lipidomisk, metabolomisk og proteomanalyse. Fig. 2 og 6 inneholder i tillegg representative bilder av hvordan det under ekstraordinære forhold skal se ut. I tillegg er eksempler på prøver som inneholder store mengder utfelt makromolekyler (proteiner og stivelse) og prøver med uhensiktsmessig prøvehomogenisering vist ( figur 3 ). Feilsøkingen for disse to vanlige problemene er gitt kort i figur 3, men det er også omtalt nærmere i vår tidligere publikasjon 16 .
Figur 4 og 5 skissere eksempler på tre analytiske kromatogrammer avledet fra lipiden, den polare / semI-polare metabolitter og proteinanalyser. Lipider, som ble tatt fra den øvre MTBE-fasen ( figur 2 ), ble analysert ved reversfase (RP) C8 ultraprestasjonsvæskekromatografi koplet til høyoppløselig massespektrometri. Lipider kan kjøpes ved hjelp av positive og negative MS-ioniseringsmoduser ( Figur 4 , øvre rute) 16 , 24 .
Polare og halvpolare primære og sekundære metabolitter ble analysert fra polar (vann / metanol) fase ( figur 2 ) ved reversfase (RP) C18 UPLC-MS 25 . Den illustrerte metoden, ved bruk av reversfasekromatografi, er svært kompatibel med analysen av semi-polare metabolitter (nemlig metabolitter fra plant sekundær metabolisme), som kan analyseres ved bruk av positive og negative ioniseringsmoduser i MS( Figur 4 , nedre rute) 16 . Flere hydrofile metabolitter fra denne fraksjonen (sukkerarter, polare aminosyrer etc.) som ikke viser god oppbevaring på det reverserte fasematerialet, kan analyseres ved hjelp av andre analysemetoder, slik som GC-MS 16 eller hydrofil vekselskromatografi 30 .
Proteinene, som ble hentet fra den faste pellet i bunnen av ekstraksjonsrøret ( figur 2 ), ble oppløset og oppløst i oppløsning ved hjelp av skuddpistol LC-MS ( figur 5 ), mens protokollen for ekstraksjon av stivelse og cellevegg Materialet kan hentes fra vår tidligere publiserte protokoll 16 .
Sammendrag, mer enn 200 lipidarter, 50 annoterte semipolare metabolitter og flere tusen proteinerNs kan rutinemessig identifiseres fra prøver av typen som brukes i vårt eksempel. I tillegg viste metoden bred anvendelighet ved bruk av forskjellige vev, organer og cellekulturmateriale ( figur 6 ).
Figur 1: Generell arbeidsflyt for stor skala uten målrettet Omics-analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Eksempelforberedelse og ekstraksjons arbeidsflyt for analyse av lipider, metabolitter og proteiner fra en enkelt alikvot av en biologisk prøve.Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 : Illustrerende eksempler på vanlig observerte problemer ved bruk av tofasepartisjoneringsekstraksjonsprotokoller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 : Representative kromatogrammer av lipid- og semipolare metabolitter fra Arabidopsis thaliana Leaf Extracts. BasestrekkromatogramS av lipider (øvre rute) og semi-polare metabolitter (nedre rute) analysert i positiv ioniseringsmodus 16 . Kakediagrammet i øvre høyre hjørne av hvert kromatogram viser antall identifiserte lipider og metabolitter tilordnet forskjellige kjemiske klasser. Chl, klorofyller; DAG, diacylglyserid; DGDG, digalactosyldiacylglycerol; FA, fettsyre; LysoPC, lysofosfatidylkolin; MGDG, monogalaktosyldiacylglycerol; PC, fosfatidylkolin; PE, fosfatidyletanolamin; PG, fosfatidylglycerol; PI, fosfatidylinositol; PS, fosfatidylserin; SP, sfingolipid; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol; TAG, triacylglyserid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5
Sirkeldiagrammet i øverste høyre hjørne indikerer antall identifiserte proteiner tilordnet forskjellige biologiske prosesser 16 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6 : Representative ekstraksjonseksempler av forskjellige vevstyper fra villtype arabidopsis thaliana .
Alle prøver ble ekstrahert ved anvendelse av 50 mg ferskvekt fra de angitte vevene."> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tid (min) | % Buffer a til buffer b | |
| 0 til 1 min | 45% A | Buffer A: 1% 1 M NH4-acetat, 0,1% eddiksyre i UPLC MS-klasse vann |
| 1 til 4 min | Linjær gradient fra 45% A til 25% A | Buffer B: 1% 1M NH4-acetat, 0,1% eddiksyre i acetonitril / isopropanol 7: 3, (v: v) |
| 4 til 12 min | Lineær gradient fra 25% A til 11% A | Strømningshastighet 400 μl / min |
| 12 til 15 min | Lineær gradient fra 11% A til 0% A | Injeksjonsvolum 2 μL |
| 15 til 19,5 min | Vask kolonnen i 4,5 min med 0% A | |
| Sett tilbake til 45% A | ||
| 19,51 til 24 min | Equilibrere med 45% A |
Tabell 1: Gradientparametre for RP-UPLC-separering av lipider. RP, reversert fase. UPLC, ultra-ytelse væskekromatografi.
| Tid (min) | % Buffer a til buffer b | |
| 0 til 1 min | 99% A | Buffer A: 0,1% maursyre i vann i UPLC-klasse |
| 1 til 11 min | Lineær gradient fra 99% A til 60% A | Buffer B: 0,1% maursyre i UPLC grad acetonitril |
| 11 til 13 min | Linjær gradient fra 60% A til 30% A | Strømningshastighet 4001; l / min |
| 13 til 15 min | Linjær gradient fra 30% A til 1% A | Injeksjonsvolum 2 μL |
| 15 til 16 min | Vask kolonnen i 1 min med 1% A | |
| 16 til 17 min | Linjær gradient fra 1% A til 99% A | |
| 17 til 20 min | Equilibrere i 3 minutter ved 99% A |
Tabell 2: Gradientparametre for RP-UPLC-separering av polare og semipolare metabolitter. RP, reversert fase. UPLC, ultra-ytelse væskekromatografi.
| Tid (min) | % Buffer B til Buffer A | |
| 0 til 5 min | Lineær gradient fra 0 til 10% | Buffer A: 0,1% maursyre i vann i UPLC-klasse |
| 5 til 80 min | Lineær gradient fra 10% til 40% | Buffer B: 0,1% maursyre i 60% acetonitril av UPLC-kvalitet |
| 80 til 85 min | Lineær gradient fra 40% til 60% | Strømningshastighet 300 nL / min |
| 85 til 86 min | Lineær gradient fra 60% til 95% | Injeksjonsvolum 5 μl |
| 86 til 91 min | Vask kolonne i 5 minutter med 95% | |
| 91 til 92 min | Linjær gradient fra 95% til 0% | |
| 93 til 110 min | Equilibrere kolonnen i 17 minutter ved 0% |
Tabell 3: Gradientparametre for Nano-LC-separering av peptider. LC, væskekromatografi.
Discussion
I denne artikkelen beskriver og illustrerer vi en enkel og svært anvendelig ekstraksjonsprotokoll for omfattende lipidomisk, metabolomisk og proteomanalyse fra en enkelt 50 mg bladprøve. Metoden har tidligere vært brukt i flere studier, som har blitt publisert i forskjellige artikler 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 Og viste seg, i tillegg til sin rett fremArbeidsflyt og høy anvendelighet for å være robust og reproduserbar.
De her angitte søknadene viser noen rutinemetoder for den første screening av en kompleks biologisk prøve. Disse illustrerte storskala metabolomiske og lipidomiske datasettene kan gi omfattende informasjon om de brede eller spesifikke forandringene i metabolismen av det analyserte biologiske systemet, mens dataene som er oppnådd ved analyse av proteiner, gir innsikt i kvantitative (overflod) og kvalitative (modifikasjoner ) Endringer av enzymer, strukturelle proteiner eller transkripsjonsfaktorer (TFs) som styrer cellefunksjoner og maskiner. Følgelig har integrative omics-data potensial til å avsløre innledende informasjon om mulige forandringer indusert av genetiske eller biotiske og / eller abiotiske forstyrrelser i et biologisk system ved å belyse molekylære endringer av forskjellige molekyler assosiert med bestemte metabolske veier eller cellulære prosesser.
SelvfølgeligPå lang sikt er det ganske viktig, for en vellykket systembiologianalyse, å maksimere antall analyserte og annoterte molekylære enheter, slik at overvåking av mobilfunksjoner og aktiviteter så fullstendig som mulig. For dette formål kunne de oppnådde fraksjoner påføres i tillegg til forskjellige analysemetoder, rettet mot ytterligere forbindelser eller sammensatte klasser ( figur 4 ).
Når det er sagt, må det nevnes at den globale analysestrategien for de innhentede dataene kan følges av to forskjellige strategier: På den ene side har vi lagt vekt på å avklare cellulære funksjoner ved kvantifisering av kjente forbindelser. På den annen side er mange av de målte metabolitter og lipider ennå ikke kjent eller merket. Disse, men likevel ikke-annoterte sammensatte målinger inneholder også rikelig med meningsfylt informasjon, som kan benyttes ved statistiske metoder for klassifisering eller diskriminering bEtween grupper eller behandlinger 20 , 21 , 22 .
Likevel, disse ukendte forbindelsene, spesielt de som er relevante for gruppeklassifisering eller betjening som biomarkører, må identifiseres. Denne identifiseringsprosessen er dessverre ganske kjedelig og kan ikke oppnås uten ytterligere analytiske målinger eller strategier 38 . Som det fremgår av figur 4 , er antall ikke-merkede forbindelser ganske høye (faktisk det store flertallet). Likevel, som nevnt ovenfor, kan disse kromatografiske topper håndteres i dataanalysen, og derfor kan signifikant berørte enheter bli belyst og utsatt for ytterligere identifikasjonsstrategier.
Sammendrag kan vi konkludere med at den her introduserte protokollen gir flere fordeler for eksperimentell systembiologi, så vel som for klassisk statistisk applikasjonasjon.
For det første, siden alle fraksjoner trekkes ut fra en enkelt prøve, blir variasjonen mellom de forskjellige eksperimentelle datasettene (lipider, metabolitter, proteiner) signifikant redusert siden hvert datasett er avledet fra samme prøveallikott. Dette fører klart til økt sammenligning av de oppnådde resultatene.
For det andre er metoden lett skalerbar og gjør den derfor svært kompatibel med små til store mengder. Vi bruker rutinemessig 10-100 mg vevsprøver, men vellykkede lipidomiske studier har også blitt utført på så lite som 20 Arabidopsis-frø 31 . Spesielt kompatibiliteten med små prøvebeløp gjør denne metoden anvendelig dersom begrensede mengder biologiske vev eller prøver er tilgjengelige. Likevel, selv om tilstrekkelig prøvemateriale er tilgjengelig, gir metoden som presenteres her fordelen å bruke disse prøvene i et større antall eksperimentelle replikater i stedet for degSyng dem for forskjellige utvinningsrutiner. Dette muliggjør en bedre og raffinert statistisk dataanalyse.
For det tredje, siden metoden er basert på en væskefluid fraksjon av polære og ikke-polare molekyler, gir det i motsetning til enkle enfase-ekstraksjonsmetoder ( f.eks. Metanolekstraksjoner) et signifikant de-kompleksdannelsestrinn i prosedyren. Denne effektive prøve-de-kompleksdannelse fører til delvis rensing av de enkelte fraksjoner på grunn av separasjon av kjemisk forstyrrende molekyler fra hverandre. Følgelig gir kjemisk partisjoneringsprosess ikke bare en praktisk fordel for systematisk alikvotering av de ekstraherte prøver i forskjellige kjemiske klasser, men forbedrer også de enkelte analytiske målinger, siden det fjerner forurensende forbindelser fra de forskjellige fraksjoner. Det er klart at vi kan observere det spesielt lipidene, som er partisjonert i den organiske fasen, og som vanligvis påvirker negativtKromatografisk analyse av polære forbindelser, vil være nesten helt fraværende fra polarfraksjonen. Det samme gjelder for analysen av de hydrofobe lipidene, som vil bli utarmet av de polare forbindelser. I tillegg til rensing av polare og ikke-polare forbindelser fra hverandre, bryter vi ut og samler proteiner og andre makromolekyler fra prøven, som ikke bare gir en egen fraksjon, som kan benyttes til protein, stivelse og cellevegganalyse 16 , men også Fører til en renere prøve i de enkelte fraksjoner. Dette er spesielt relevant, siden det er kjent at tilstedeværelsen av store makromolekyler, fører til skade eller minst kortere levetid for de analytiske kolonnene.
Sist men ikke minst, har den beskrevne MTBE-ekstraksjonsmetoden, som er basert på det mindre farlige og gunstigere kloroformutskiftningsmiddelet 15 , allerede vist ved flere studier fra vår gruppe, for å være meget applIcability for forskjellige biologiske prøver fra planter 16 , alger 17 , 18 , flyr 19, men også flere pattedyrvev, organer eller celler 20 , 21 , 22 .
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
MS støttes av et fullt PhD-stipend fra GERLS-DAAD-programmet. Vi vil gjerne takke Dr. Andrew Wiszniewski for korrekturlesing og kommentere manuskriptet. Vi er svært takknemlige for alle medlemmene av Giavalisco-laboratoriet ved Max-Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Golm, Tyskland for deres hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Equipment | |||
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Tissue grinding mixer mill | Retsch, Mixer Mill MM 300 | 20.746.0001 | |
| Mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464-1EA | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| 2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| 1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| MS system | Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany). | ||
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system | Thermo-Fisher, Bremen, Germany | Analysis of peptides |
References
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J Physiol. 117 (4), 500-544 (1952).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Yang, M. Q., et al. The emerging genomics and systems biology research lead to systems genomics studies. BMC Genomics. 15, Suppl 11 1 (2014).
- Sheth, B. P., Thaker, V. S. Plant systems biology: insights, advances and challenges. Planta. 240 (1), 33-54 (2014).
- Ideker, T., Galitski, T., Hood, L. A new approach to decoding life: Systems biology. Annu Rev Genom Hum G. 2, 343-372 (2001).
- Somvanshi, P. R., Venkatesh, K. V. A conceptual review on systems biology in health and diseases: from biological networks to modern therapeutics. Syst Synth Biol. 8 (1), 99-116 (2014).
- Oliver, S. G., Winson, M. K., Kell, D. B., Baganz, F. Systematic functional analysis of the yeast genome. Trends Biotechnol. 16 (9), 373-378 (1998).
- Tweeddale, H., Notley-McRobb, L., Ferenci, T. Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli, as revealed by global metabolite pool ("metabolome") analysis. J Bacteriol. 180 (19), 5109-5116 (1998).
- Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical analysis : PCA. 21 (1), 4-13 (2010).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Weckwerth, W., Wenzel, K., Fiehn, O. Process for the integrated extraction, identification and quantification of metabolites, proteins and RNA to reveal their co-regulation in biochemical networks. Proteomics. 4 (1), 78-83 (2004).
- Wienkoop, S., et al. Integration of metabolomic and proteomic phenotypes: analysis of data covariance dissects starch and RFO metabolism from low and high temperature compensation response in Arabidopsis thaliana. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1725-1736 (2008).
- Valledor, L., et al. A universal protocol for the combined isolation of metabolites, DNA, long RNAs, small RNAs, and proteins from plants and microorganisms. Plant J. 79 (1), 173-180 (2014).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1 (3), (2016).
- Alfonsi, K., et al. Green chemistry tools to influence a medicinal chemistry and research chemistry based organisation. Green Chem. 10 (1), 31-36 (2008).
- Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
- Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
- Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. J Appl Phycol. 27 (3), 1149-1159 (2015).
- Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
- Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nat Commun. 5, 3584 (2014).
- Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLoS Biol. 12 (5), 1001871 (2014).
- Krueger, S., Steinhauser, D., Lisec, J., Giavalisco, P. Analysis of subcellular metabolite distributions within Arabidopsis thaliana leaf tissue: a primer for subcellular metabolomics. Methods Mol Biol. 1062, 575-596 (2014).
- Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. FrontPlant Sci. 2, 54 (2011).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. Plant J. 68 (2), 364-376 (2011).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. Plant J. 73 (6), 897-909 (2013).
- Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Spagou, K., et al. Hydrophilic interaction chromatography coupled to MS for metabonomic/metabolomic studies. J Sep Sci. 33 (6-7), 716-727 (2010).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant physiol. 162 (3), 1290-1310 (2013).
- Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytol. 196 (4), 1098-1108 (2012).
- Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. Plant J. 70, 972-982 (2012).
- Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. Plant J. 81 (3), 529-536 (2015).
- Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLoS Biol. 13 (2), 1002053 (2015).
- Kueger, S., Steinhauser, D., Willmitzer, L., Giavalisco, P. High-resolution plant metabolomics: from mass spectral features to metabolites and from whole-cell analysis to subcellular metabolite distributions. Plant J. 70 (1), 39-50 (2012).
