Summary
Ett protokoll för omfattande extraktion av lipider, metaboliter och proteiner från biologiska vävnader med ett prov presenteras.
Abstract
Förståelse av komplexa biologiska system kräver mätning, analys och integration av flera föreningsklasser av levande celler, vanligtvis bestämda av transkriptomiska, proteomiska, metabolomiska och lipidomiska mätningar. I detta protokoll introducerar vi en enkel metod för reproducerbar extraktion av metaboliter, lipider och proteiner från biologiska vävnader med en enda alikvot per prov. Extraktionsmetoden baseras på ett metyl tert -butyleter: metanol: vattensystem för vätska: vätskepartitionering av hydrofoba och polära metaboliter i två oblandbara faser tillsammans med utfällning av proteiner och andra makromolekyler som en fast pellets. Denna metod ger därför tre olika fraktioner av specifik molekylär komposition, vilka är fullständigt kompatibla med vanics-teknologier med hög genomströmning, såsom vätskekromatografi (LC) eller gaskromatografi (GC) kopplad till masspektrometrar. Även om metoden var initIalt utvecklad för analys av olika vävnadsprover har det visat sig vara fullständigt kompatibel för extraktion och analys av biologiska prover från system som är så olika som alger, insekter och däggdjursvävnader och cellkulturer.
Introduction
Systembiologi, som uppstod i mitten av förra seklet 1 och avancerade genom storskalig analys av genomiska och transkriptomiska dataset 2 , 3 , har utvecklats till ett nytt och oumbärligt tillvägagångssätt för analys av komplexa biologiska system 4 , 5 . Huvudsyftet med systembiologi är att dechiffrera komponentinteraktionerna och beroenden i biologiska system och att överbrygga länken mellan genotyper, deras realisering, molekylära transformationer och resulterande fenotyper. Följaktligen har integrationen av omfattande dataset, som framställts av de olika storskaliga analysmetoderna, nämligen genomics, transcriptomics, metabolomics, lipidomics and proteomics och deras beräkningsanalys, blivit en förutsättning för beskrivning och förståelse av komplexa biologiska system.
Bas På grund av den enorma kemiska mångfalden och komplexiteten hos biologiska komponenter i vilket levande system som helst, bygger produktionen av stora och omfattande omics-datasatser starkt på kvaliteten på den använda extraktionsmetoden 9 . Utöver kvaliteten på extraktionsmetoden är metodens ekonomi viktig. Detta innebär att det vore önskvärt att få så mycket molekylär information från så lite provinmatning som möjligt. Ofta kan provmängder vara begränsande och därför är det mycket önskvärt att använda en extraktionsmetod som kan härleda så många molekylära klasser från en enda extraktion av ett givet prov. Detta innebär att istället för att använda flera specialiserade extraktionsmetoder för extraktion av olika föreningsklasser från olika provalikvoter av samma prov används en sekventiell extraktionsmetod som fraktionerar de molekylära beståndsdelarna i en enda alikvot i olika molekylfraktioner.
Den gemensamma metoden som används för dessa fraktionerade extraktionsmetoder är baserad på tvåfas-lipid-extraktionsmetoden från Folch et al., Utvecklad 1957 10. Denna metod är baserad på en kloroform: metanol / vattenfördelning av polära och hydrofoba metaboliter och var Avsedda att rengöra och avkomplexa prover för högkvalitativ lipidanalys. Med utvecklingen av biomikrobiosystembiologi, blev Folch-metoden ytterligare stegvis förbättrad genom att använda den för provpartitionering av proteiner och polära metaboliter och lipider för Gas- och vätskekromatografibaserad metabolomik och lipidomik av polära och hydrofoba föreningar, förutom vätskekromatografibaserade proteomics 11 , 12 , 13 , 14. Olyckligtvis är alla dessa metoder beroende av en kloroformbaserad extraktionsmetod som inte bara Leder till den oönskade foRation av proteinpelleten som ett mellanfas mellan polär- och lipidfasen men som också är ett oönskat lösningsmedel från ett grönt kemiperspektiv 15 , 16 . Emellertid överväger lösningsmedlet metyl- tert -butyleter (MTBE) båda dessa ovannämnda problem och är en lämplig ersättning för kloroform. Baserat på dessa krav bestämde vi oss för att etablera en MTBE: metanol: vattenbaserad extraktionsmetod som uppfyller alla ovannämnda specifikationer och fungerar därför som en idealisk utgångspunkt för omfattande multi-omics-analys 16 . Detta protokoll guidar användaren steg för steg genom det enkla, snabba och reproducerbara arbetsflödet i provberedningen, inklusive felsökning av vanliga problem. Vidare kommer vi kort att introducera exempel på analytiska data från ultraprestandad vätskekromatografi-masspektrometri (UPLC-MS) -basEd lipidomics, metabolomics och proteomics profilering från vävnadsprover. Trots att de givna exemplen härrör från 50 mg av ett Arabidopsis thaliana-bladvävnadsprov , har detta protokoll använts för flera andra biologiska prover och vävnader, inklusive alger 17 , 18 , insekter 19 och däggdjursceller, organ och vävnad 20 , 21 , 22 . Omfattningen av det presenterade extraktionsprotokollet är att tillhandahålla en tydlig och detaljerad beskrivning av för-extraktionsprovhanteringen och själva extraktionsproceduren. Trots att vi ger tre korta exempel på analytisk tillämpning, kan vi få detaljerade uppgifter om för- och postanalytisk datahantering från våra tidigare publikationer 16 , 23 , 24 ,
Protocol
Varning : Metanol (MeOH) och metyl tert -butyleter (MTBE), som används vid extraktion, är brandfarliga och kan vid långvarig exponering och / eller kontakt, andnings-, ögon- eller hudirritation. Var vänlig hantera dem noggrant i en avluftningsdosa och använd lämpliga säkerhetsförfaranden under extraktionen (labbrock, skyddsglasögon, handskar etc. ). Flytande kväve och torris, som används i flera steg i detta protokoll, kan orsaka svåra brännskador vid långvarig hudkontakt. Vänligen hantera dem försiktigt med skyddshandskar och glasögon. Användare kan använda olika kemikalier, reagenser eller interna standarder för provanalys, varav några kan vara giftiga. Var god undersök relevanta kemikaliesäkerhetsdatablad för allt material som används.
1. Samling och höstning av biologiska prov
- Förbered märkta skördarör.
OBS! Här skörbi biologiska prover i märkt, 2 mL, rundbottnat, säkert lokK-mikrocentrifugrör innehållande två 5 mm diameter metallbollar för vävnadshomogenisatorn. - Förbered en fylld flytande kvävedewar.
- Skörda det biologiska provet och fäst vävnaden i flytande kväve. Utför detta steg så fort som möjligt inom några sekunder för att undvika metaboliska förändringar som orsakas av sår.
Obs! Använd dem med rosett från 30-dagars vildtyp Arabidopsis thaliana (Col-0) som odlas på jorden under långa dagar. - Håll de skörda proven på torris för kortvariga raster eller förvara dem vid -80 ° C under längre perioder.
2. Slipning och vävnadsstörning
- Förkyl rörhållarna i vävnadshomogenisatorn i flytande kväve under minst 10 min. Om en vävnadshomogenisator inte är tillgänglig, använd rena och förkylda morter och pistlar.
- Ta provet från vätskekväve, torris eller -80 ° C frys och placera dem i den förkyldaRörhållare.
- Snabbt sätt rörhållarna i vävnadshomogenisatorn.
- Mala det biologiska materialet i ett fint och homogent pulver. Använd 20 Hz i 1 min för löv.
Notera; Homogeniseringstid och hastighet kan varieras beroende på vävnaden, se till att provet homogeniseras i ett fint pulver och att detta pulver hålls fryst vid varje steg i homogeniseringen. - Ta de biologiska proverna från rörhållarna och håll dem frysta tills vidare extraktion.
3. Vägning av vävnader
- Använd en analytisk balans med tillräcklig precision för de nödvändiga provmängderna.
- Förbered ett märkt 2 ml runda botten säkerhetslås mikrocentrifugrör.
- Förkyla rören och spatlerna i flytande kväve.
- Aliquot den önskade mängden vävnadspulver i 2 ml säkerhetslåsmikrocentrifugröret.
Varning: Undvik eventuell avfrostning av växtmaterialet genom att minimera tiden som tas till wVid proverna. - Återlämna alikvotproverna omedelbart efter vägning till flytande kväve.
- Spela in för varje prov den exakta vikten. Använd 10-50 mg ± 10% för de flesta vävnader.
- Förvara de alikvoterade proverna vid -80 ° C tills vidare extraktion.
4. Reagens Setup
- Använd en extraktionsblandning av metyl- tert -butyleter (MTBE) / metanol (MeOH).
- För framställning av 100 ml extraktionslösningsmedel tillsätt 75 ml MTBE till 25 ml MeOH för att göra en blandning av MTBE: MeOH (3: 1, vol / vol).
- Lägg till interna standarder för efteranalysens normalisering enligt analytiska behov. Typiskt tillsätt 50 μl 1,2-diheptadecanoyl- sn- glycero-3-foskokolin (1 mg / ml i kloroform) som en intern standard för UPLC-MS-baserad lipidanalys under tillsats av 50 ^ il 13 C sorbitol ( 1 mg / ml i vatten) som interna standarder för GC-MS-baserad analys av primärtmetaboliter. Interna standarder för UPLC-MS-baserad metabolitanalys är 50 μl kortikosteron (1 mg / ml i metanol) och 25 μl ampicillin (1 mg / ml i metanol).
- Överför lösningsmedlet till en ren glasflaska som sköljdes med MTBE: MeOH-blandning.
- Förvara extraktionsblandningen i upp till 1 vecka vid 4 ° C.
OBS: Förvara inte extraktionsblandningen under längre perioder för att upprätthålla reproducerbara resultat.
- För att inducera fasseparation använd vatten (H2O) / metanol (MeOH).
- För framställning av 100 ml H2O: MeOH tillsätt 75 ml H20 till 25 ml MeOH för att göra H2O: MeOH (3: 1, vol / vol).
- Överför lösningsmedlet till en ren glasflaska som sköljdes med H2O: MeOH-blandning. Detta lösningsmedel kan lagras i flera veckor vid rumstemperatur.
5. Extraktion av prov
- Förkylning av extraktionen mIxtur (MTBE: MeOH, 3: 1, vol / vol) till -20 ° C med användning av ett vätskekylsystem eller en -20 ° C frys.
- Ta ut alikvotproverna en efter en och tillsätt 1 ml av den förkylda extraktionsblandningen till varje provrör. Varning: Utför detta steg snabbt på grund av MTBEs låga viskositet.
- Blanda omedelbart på en virvelblandare tills vävnaden är väl homogeniserad i extraktionsblandningen.
OBS! Detta steg är mycket viktigt, eftersom det är nödvändigt att fälla ut proteinerna och inaktivera deras enzymatiska aktiviteter. - Inkubera alla proverna på en orbitalskakare vid 100 varv per minut i 45 minuter vid 4 ° C.
- Sonikera proverna i 15 minuter i ett iskyldt sonikationsbad.
6. Fraktionering genom fasavskiljning
- Tillsätt 650 μl H20: MeOH (3: 1, vol / vol) till varje provrör.
- Blanda väl med vortexing i 1 min.
- Centrifugera proverna med en hastighet av 20 000 x g under 5 min vid 4 ° C.
ANMÄRKNING: Efter detta steg finns två oblandbara vätskefaser med en fast pellets i rörets botten.
Varning: Hantera rören försiktigt för att undvika blandning av de båda vätskefaserna och undvik att störa den utfällda pelleten.
7. Aliquoting av polära och hydrofoba fraktioner
- Överför 500 μl av lösningsmedlet från den övre lipidhaltiga fasen till ett märkt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
OBS: De alikvoterade lipidproverna kan koncentreras direkt för omedelbar UPLC-MS-analys (steg 8.1) eller lagras i flera veckor vid -80 ° C. - När 500 μL avlägsnats från provet, avlägsna den återstående lipidfasen med en 200 pl pipett.
- Överför 400 μL av lösningsmedlet från den nedre fasen (polära och semipolära metaboliter) till ett märkt 1,5 ml mikrocentrifugrör. De alikvoterade polära proven kan koncentreras direkt för omedelbar UPLC-MS-analys (steg 8.2) eller lagrad foR flera veckor vid -80 ° C.
- Ta en extra alikvot på 200 μL för att utföra ytterligare analys, t.ex. gaskromatografibaserad metabolitanalys som beskrivs värdefullt 16 .
- Avlägsna återstoden av vattenfasen genom pipettering av överskottsvolymen.
- Tvätta det erhållna proteinet, stärkelsen, cellväggspelleten med 500 μl metanol genom att vortexa den noggrant under 1 minut.
- Centrifugera proverna med en hastighet av 10 000 x g under 5 min vid 4 ° C.
- Utför proteinutvinning och digestion (steg 11) eller stärkelse / cellvägganalys som beskrivits tidigare 16 .
OBS: Om de inte används omedelbart kan dessa pellets förvaras i flera veckor vid -80 ° C.
8. Koncentration och lagring av fraktioner
- Indunstar lösningsmedlet från lipidprover (från steg 7.1) i antingen en vakuumkoncentrator utan upphettning (i 1-2 timmar) eller använd företrädesvis en nitrOgenflödesindunstare för att undvika oxidativa modifieringar av lipiderna.
OBS: Torkade prov ska analyseras omedelbart. För förvaring, lämna prov i MTBE-lösning, helst i glasflaskor (steg 7.1). - Indunstar lösningsmedlet från de vattenhaltiga proven (från steg 7.3 eller 7.4) över natten i en vakuumkoncentrator utan uppvärmning. OBS: de torkade proven kan förvaras i flera veckor vid -80 ° C före analys.
9. Analys av lipider med användning av UPLC-MS 24
- Åter suspendera de torkade lipidfraktionerna (från steg 8.1) i 400 | il acetonitril: 2-propanol (7: 3, vol / vol).
- Överför tillräcklig vätska till glasflaskor och keps tätt.
- Sätt in glasflaskorna i en kyld autosampler (4 ° C).
- Injicera 2 μL per prov och separera lipiderna i en kolumn med omvänd fas (RP) C 8 hållen vid 60 ° C med användning av ett UPLC-system som körs vid en flödeshastighet av 400 | il / min.
- Använd mobilenFaser som beskrivs i tabell 1 för kromatografisk separation.
- Förvärva massspektra i positivt och negativt joniseringsläge med hjälp av ett lämpligt MS-instrument som täcker massområdet mellan 150 och 1500 m / z.
10. Analys av polära och semipolära metaboliter med användning av UPLC-MS 25 .
- Re-suspendera polärfasen (från steg 8.2) i 200 | il UPLC-grad metanol: vatten (1: 1, vol / vol).
- Överför tillräcklig vätska till glasflaskor och keps tätt.
- Sätt in glasflaskorna i en kyld autosampler (4 ° C).
- Injicera 2 μL från varje prov och separera metaboliterna på en RPC 18 kolonn hållen vid 40 ° C med användning av ett UPLC-system som körs vid en flödeshastighet av 400 | il / min.
- Använd mobilfaserna för kromatografisk separation med parametrarna i Tabell 2 .
- Skaffa fullständiga scanmasspektra i positivt och negativt joniseringsläge ossIngående en lämplig masspektrometer som täcker ett massintervall mellan 50 och 1500 m / z.
11. Protein extraktion, digestion och analys 16
- Re-suspendera det tvättade proteinet / stärkelse / cellväggspelleten (från steg 7.8) i 200 | il av den önskade proteinutvinningsbufferten. Obs! Vi använder urea / tioureabuffert (5 M urea, 2 mM tiourea, 15 mM DTT, 2% CHAPS och proteas och fosfatasinhibitorer) 27 .
- Sonikera proverna i 10 minuter i ett iskyldt sonikbad.
- Inkubera prov i 30 minuter på en orbitalskakare (100 rpm) vid rumstemperatur.
- Centrifugera de upplösta proteinerna vid 10 000 x g under 5 min.
- Samla proteinsupernatanten i ett nytt rör.
- Bestäm proteinkoncentrationen från den uppsamlade supernatanten 28 .
- Digestera 50 μg protein i lösning med ett valfritt protokoll. Använd normalt Trypsin / Lys-C mix accordiNg till bruksanvisningen.
- Efter matsmältning, utför avsaltning av peptiderna före masspektrometri med användning av C18-stegtips och eluera de uppdelade peptiderna 29 .
- Koncentrera proven till nära torrhet i en vakuumkoncentrator utan uppvärmning.
- Återupptag proverna i lämplig laddningsbuffert (t ex 5% acetonitril, 0,5% myrsyra) och analysera peptidblandningarna med LC-MS / MS med användning av en massupplösning med hög upplösning kopplad till ett nano-LC-system.
OBS! I den exemplifierande proteomikdatasatsen som presenteras i detta protokoll använde vi en gradient som beskrivs i Tabell 3 . - Ange masspektrometern med hjälp av en topp 15-strategi, där en fullständig genomsökning (FS) följdes av upp till 15 databeroende MS / MS-skanningar, till följande parametrar: FS var i massintervallet 200-2000 m / z vid En upplösning på 70 000 med ett målvärde på 3 x 10 6 joner. Skaffa databeroende MS / MS-skanningar av högre-enRgy kollision dissociation (HCD). Ange målvärdena för MS / MS till 1e 5 joner, med en maximal jonfyllningstid på 50 ms, ett isoleringsfönster på 4,0 m / z, normaliserad kollisionsenergi (NCE) på 30% och ett underfyllnadsförhållande på 1%. Mät MS / MS-joner vid en upplösning 17.500 och den dynamiska uteslutningen sattes till 60 s.
Representative Results
Omfattande multi-omics dataset är ovärderliga för förståelse av komplexa biologiska system. Strategin för ett framgångsrikt biologiskt experiment börjar vanligtvis från en meningsfull experimentell design, experimentuppställning och prestanda följt av provinsamling, extraktion, analytisk datainköp, rå databehandling, statistisk dataanalys, identifiering av relevant metabolit och biologisk data tolkning Inklusive vägkartläggning och visualisering ( Figur 1 ).
I det extraktionsprotokoll som introduceras här fokuserar vi på provuppsamlings-, behandlings- och extraktionsstegen som beskrivs i den detaljerade arbetsflödesöversikten i Figur 2 . För demonstrationsändamål valdes 50 mg Arabidopsis bladvävnad. Detta material skördades, maldes och extraherades innan det underkastades treExemplifierande analytiska UPLC-MS-plattformar, som tillhandahåller data som kan användas för målinriktad och icke-målad lipidomisk, metabolomisk och proteomanalys. Figurerna 2 och 6 innefattar dessutom representativa bilder av hur utvinningslösningsmedlet under normala förhållanden skulle se ut. Dessutom visas exempel på prover som innehåller överdrivna mängder av utfällda makromolekyler (proteiner och stärkelse) och prover med olämplig provhomogenisering ( Figur 3 ). Felsökningen för dessa två vanliga problem ges kortfattat i Figur 3, men det diskuteras mer detaljerat i vår tidigare publikation 16 .
Figurerna 4 och 5 beskriver exempel på tre analytiska kromatogram härledda från lipiden, den polära / semanI-polära metaboliter och proteinanalyser. Lipider, vilka togs från den övre MTBE-fasen ( Figur 2 ), analyserades genom reversfas (RP) C8 ultraprestanda-vätskekromatografi kopplad till massuppspektrometri med hög upplösning. Lipider kan förvärvas med hjälp av positiva och negativa MS-joniseringslägen ( Figur 4 , övre rutan) 16 , 24 .
Polära och halvpolära primära och sekundära metaboliter analyserades från den polära (vatten / metanol) -fasen ( Figur 2 ) genom omvänd fas (RP) C18 UPLC-MS 25 . Den illustrerade metoden med användning av reversfas-kromatografi är mycket kompatibel med analysen av semipolära metaboliter (nämligen metaboliter från sekundärmetabolism i växten) som kan analyseras med användning av positiva och negativa joniseringslägen i MS( Figur 4 , nedre rutan) 16 . Mer hydrofila metaboliter från denna fraktion (sockerarter, polära aminosyror etc.), som inte visar god retention på det omvända fasmaterialet, kan analyseras med andra analysmetoder såsom GC-MS 16 eller hydrofil vätskekromatografi 30 .
Proteinerna, som hämtades från den fasta pelleten i botten av extraktionsröret ( Figur 2 ), upplöses och löses i lösning med användning av skottpistol LC-MS ( Figur 5 ), medan protokollet för extraktion av stärkelse och cellvägg Material kan erhållas från vårt tidigare publicerade protokoll 16 .
Sammanfattningsvis, mer än 200 lipidarter, 50 annoterade halvpolära metaboliter och flera tusen proteinerNs kan rutinmässigt identifieras från prover av den typ som används i vårt exempel. Dessutom visade metoden stor tillämpbarhet med användning av olika vävnader, organ och cellodlingsmaterial ( Figur 6 ).
Figur 1: Allmänt arbetsflöde för storskalig oriktad omicsanalys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Provberedning och extraktions arbetsflöde för analys av lipider, metaboliter och proteiner från en enda alikvot av en biologisk prov.Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 : Illustrativa exempel på vanligt observerade problem med användning av tvåfas-partitionerings extraktionsprotokoll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : Representativa kromatogram av lipid och semipolära metaboliter från Arabidopsis thaliana Blad Extracts. Bas-toppkromatogramS av lipider (övre rutan) och halvpolära metaboliter (nedre rutan) analyserade i positivt joniseringsläge 16 . Kakediagrammen i övre högra hörnet av varje kromatogram visar antalet identifierade lipider och metaboliter som tilldelas olika kemiska klasser. Chl, klorofyller; DAG, diacylglycerid; DGDG, digalaktosyldiacylglycerol; FA, fettsyra; LysoPC, lysofosfatidylkolin; MGDG, monogalaktosyldiacylglycerol; PC, fosfatidylkolin; PE, fosfatidyletanolamin; PG, fosfatidylglycerol; Pi, fosfatidylinositol; PS, fosfatidylserin; SP, sfingolipid; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol; TAG, triacylglycerid. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5
Sirkeldiagrammet i övre högra hörnet indikerar antalet identifierade proteiner som tilldelas olika biologiska processer 16 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6 : Representativa extraktionsexempel på olika vävnadstyper från vildtyps Arabidopsis thaliana .
Alla prover extraherades med användning av 50 mg färskvikt från de angivna vävnaderna."> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Tid (min) | % Buffert A till buffert B | |
| 0 till 1 min | 45% A | Buffert A: 1% 1 M NH4-acetat, 0,1% ättiksyra i UPLC MS-grad vatten |
| 1 till 4 min | Linjär gradient från 45% A till 25% A | Buffert B: 1% 1 M NH4-acetat, 0,1% ättiksyra i acetonitril / isopropanol 7: 3, (v: v) |
| 4 till 12 min | Linjär gradient från 25% A till 11% A | Flödeshastighet 400 pl / min |
| 12 till 15 min | Linjär gradient från 11% A till 0% A | Injektionsvolym 2 μL |
| 15 till 19,5 min | Tvätta kolonnen i 4,5 min med 0% A | |
| Ställ tillbaka till 45% A | ||
| 19,51 till 24 min | Equilibrera med 45% A |
Tabell 1: Gradientparametrar för RP-UPLC-separation av lipider. RP, omvänd fas. UPLC, ultra-prestanda vätskekromatografi.
| Tid (min) | % Buffert A till buffert B | |
| 0 till 1 min | 99% A | Buffert A: 0,1% myrsyra i vatten av UPLC-kvalitet |
| 1 till 11 min | Linjär gradient från 99% A till 60% A | Buffert B: 0,1% myrsyra i UPLC grad acetonitril |
| 11 till 13 min | Linjär gradient från 60% A till 30% A | Flödeshastighet 4001; L / min |
| 13 till 15 min | Linjär gradient från 30% A till 1% A | Injektionsvolym 2 μL |
| 15 till 16 min | Tvätta kolonnen i 1 min med 1% A | |
| 16 till 17 min | Linjär gradient från1% A till 99% A | |
| 17 till 20 min | Ekvilibrera i 3 minuter vid 99% A |
Tabell 2: Gradientparametrar för RP-UPLC-separation av polära och halvpolära metaboliter. RP, omvänd fas. UPLC, ultra-prestanda vätskekromatografi.
| Tid (min) | % Buffert B till buffert A | |
| 0 till 5 min | Linjär gradient från 0 till 10% | Buffert A: 0,1% myrsyra i vatten av UPLC-kvalitet |
| 5 till 80 min | Linjär gradient från 10% till 40% | Buffert B: 0,1% myrsyra i 60% acetonitril UPLC-kvalitet |
| 80 till 85 min | Linjär gradient från 40% till 60% | Flödeshastighet 300 nL / min |
| 85 till 86 min | Linjär gradient från 60% till 95% | Injektionsvolym 5 μl |
| 86 till 91 min | Tvätta kolonn i 5 min med 95% | |
| 91 till 92 min | Linjär gradient från 95% till 0% | |
| 93 till 110 min | Ekvilibrera kolonnen i 17 minuter vid 0% |
Tabell 3: Gradientparametrar för Nano-LC-separation av peptider. LC, vätskekromatografi.
Discussion
I denna artikel beskriver vi och illustrerar ett enkelt och mycket tillämpligt extraktionsprotokoll för omfattande lipidomisk, metabolomisk och proteomanalys från ett enda 50 mg bladprov. Metoden har tidigare använts i flera studier, vilka har publicerats i olika artiklar 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 Och bevisat, förutom att det är rakt framåtArbetsflöde och hög användbarhet är robusta och reproducerbara.
De här angivna applikationerna visar några rutinmetoder för inledande screening av ett komplext biologiskt prov. Dessa illustrerade storskaliga metabolomiska och lipidomiska dataset kan tillhandahålla fullständig information om de breda eller specifika förändringarna i metabolism av det analyserade biologiska systemet, medan data som erhållits från analysen av proteiner, ger insikter i kvantitativa (överflöd) och kvalitativa (modifieringar ) Förändringar av enzymer, strukturella proteiner eller transkriptionsfaktorer (TFs) som styr cellulära funktioner och maskiner. Följaktligen har integrativa omics-data potentialen att avslöja initial information om möjliga förändringar som induceras av genetiska eller biotiska och / eller abiotiska störningar av ett biologiskt system, genom att belysa molekylära förändringar av olika molekyler associerade med specifika metaboliska vägar eller cellulära processer.
SjälvklartPå lång sikt är det ganska viktigt för en framgångsrik systembiologianalys att maximera antalet analyserade och annoterade molekylära enheter, vilket möjliggör övervakning av cellulära funktioner och aktiviteter så fullständigt som möjligt. För detta ändamål kan de erhållna fraktionerna appliceras i tillägg till olika analytiska metoder, riktade mot ytterligare föreningar eller föreningsklasser ( Figur 4 ).
Med detta sagt måste det nämnas att den globala analysstrategin för de erhållna data kan följas av två olika strategier: å ena sidan har vi betonat belysningen av cellulära funktioner genom kvantifiering av kända föreningar. Å andra sidan är många av de uppmätta metaboliterna och lipiderna ännu inte kända eller annoterade. Dessa, men icke-annoterade, sammansatta mätningar innehåller också mycket meningsfull information som kan användas av statistiska metoder för klassificering eller diskriminering bEtweengrupper eller behandlingar 20 , 21 , 22 .
Fortfarande måste dessa okända föreningar, särskilt de som är relevanta för gruppklassificering eller betjäning som biomarkörer, identifieras. Denna identifieringsprocess är tyvärr ganska tråkig och kan inte uppnås utan ytterligare analytiska mätningar eller strategier 38 . Som framgår av Figur 4 är antalet icke-antecknade föreningar ganska höga (faktiskt den stora majoriteten). Ändå, som nämnts ovan, kan dessa kromatografiska toppar hanteras inom dataanalysen och därför kan signifikant drabbade enheter belysas och utsättas för ytterligare identifieringsstrategier.
Sammanfattningsvis kan vi dra slutsatsen att det här introducerade protokollet ger flera fördelar för experimentell systembiologi såväl som för klassisk statistisk applikationations.
För det första, eftersom alla fraktioner extraheras från ett enda prov, reduceras variationen mellan de olika experimentella datasætten (lipider, metaboliter, proteiner) betydligt, eftersom varje dataset härrör från samma provalikvot. Detta leder tydligt till ökad jämförbarhet av de erhållna resultaten.
För det andra är metoden lätt skalbar och gör den därför mycket kompatibel med små till stora provmängder. Vi använder rutinmässigt 10-100 mg vävnadsprover, men framgångsrika lipidomiska studier har också utförts på så lite som 20 Arabidopsis-frön 31 . Speciellt kompatibiliteten med små provmängder gör denna metod tillämplig om begränsade mängder biologiska vävnader eller prover är tillgängliga. Även om tillräckligt med provmaterial är tillgängligt, erbjuder metoden som presenteras här fördelen att använda dessa prover i ett större antal experimentreplikat istället för digSjunga dem för olika utvinningsförfaranden. Detta möjliggör en bättre och raffinerad statistisk dataanalys.
För det tredje, eftersom förfarandet är baserat på en flytande-vätskefraktionering av polära och icke-polära molekyler, tillhandahåller det, i motsats till enkla enfasutsugningsmetoder ( t ex metanolekstraktioner) ett signifikant de-komplexbildningssteg i proceduren. Denna effektiva provdekomplexering leder till en partiell rening av de individuella fraktionerna på grund av separationen av kemiskt störande molekyler från varandra. Följaktligen ger den kemiska partitionsprocessen inte bara en praktisk fördel för systematisk alikvotering av de extraherade proven i olika kemiska klasser men förbättrar också de individuella analytiska mätningarna eftersom det avlägsnar förorenande föreningar från de olika fraktionerna. Det är tydligt att vi kan observera att speciellt lipiderna, vilka är partitionerade till den organiska fasen och som vanligtvis påverkarKromatografisk analys av polära föreningar kommer nästan att vara frånvarande från polarfraktionen. Detsamma gäller för analysen av de hydrofoba lipiderna, vilka kommer att vara utarmade av de polära föreningarna. Förutom rening av polära och nonpolära föreningar från varandra, bryter vi ut och samlar proteiner och andra makromolekyler från provet, vilket inte bara ger en separat fraktion, vilken kan användas för protein, stärkelse och cellvägganalys 16 , men också Leder till ett renare prov inom de enskilda fraktionerna. Detta är särskilt relevant, eftersom det är känt att närvaron av stora makromolekyler leder till skada eller åtminstone kortare livslängd hos de analytiska kolumnerna.
Sist men inte minst har den beskrivna MTBE-extraktionsmetoden, som bygger på det mindre farliga och fördelaktiga kloroformutbyteslösningsmedlet 15 , redan visats av flera studier från vår grupp, att vara allmänt tillämpligIcability för olika biologiska prover från växter 16 , alger 17 , 18 , flyger 19 men också flera däggdjursvävnader, organ eller celler 20 , 21 , 22 .
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
MS stöds av ett fullt PhD-stipendium från GERLS-DAAD-programmet. Vi vill tacka Dr Andrew Wiszniewski för korrekturläsning och kommentera manuskriptet. Vi är mycket tacksamma för alla medlemmar av Giavalisco-labbet på Max-Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Golm, Tyskland för deras hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Equipment | |||
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Tissue grinding mixer mill | Retsch, Mixer Mill MM 300 | 20.746.0001 | |
| Mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464-1EA | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| 2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| 1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| MS system | Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany). | ||
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system | Thermo-Fisher, Bremen, Germany | Analysis of peptides |
References
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J Physiol. 117 (4), 500-544 (1952).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Yang, M. Q., et al. The emerging genomics and systems biology research lead to systems genomics studies. BMC Genomics. 15, Suppl 11 1 (2014).
- Sheth, B. P., Thaker, V. S. Plant systems biology: insights, advances and challenges. Planta. 240 (1), 33-54 (2014).
- Ideker, T., Galitski, T., Hood, L. A new approach to decoding life: Systems biology. Annu Rev Genom Hum G. 2, 343-372 (2001).
- Somvanshi, P. R., Venkatesh, K. V. A conceptual review on systems biology in health and diseases: from biological networks to modern therapeutics. Syst Synth Biol. 8 (1), 99-116 (2014).
- Oliver, S. G., Winson, M. K., Kell, D. B., Baganz, F. Systematic functional analysis of the yeast genome. Trends Biotechnol. 16 (9), 373-378 (1998).
- Tweeddale, H., Notley-McRobb, L., Ferenci, T. Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli, as revealed by global metabolite pool ("metabolome") analysis. J Bacteriol. 180 (19), 5109-5116 (1998).
- Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical analysis : PCA. 21 (1), 4-13 (2010).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Weckwerth, W., Wenzel, K., Fiehn, O. Process for the integrated extraction, identification and quantification of metabolites, proteins and RNA to reveal their co-regulation in biochemical networks. Proteomics. 4 (1), 78-83 (2004).
- Wienkoop, S., et al. Integration of metabolomic and proteomic phenotypes: analysis of data covariance dissects starch and RFO metabolism from low and high temperature compensation response in Arabidopsis thaliana. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1725-1736 (2008).
- Valledor, L., et al. A universal protocol for the combined isolation of metabolites, DNA, long RNAs, small RNAs, and proteins from plants and microorganisms. Plant J. 79 (1), 173-180 (2014).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1 (3), (2016).
- Alfonsi, K., et al. Green chemistry tools to influence a medicinal chemistry and research chemistry based organisation. Green Chem. 10 (1), 31-36 (2008).
- Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
- Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
- Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. J Appl Phycol. 27 (3), 1149-1159 (2015).
- Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
- Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nat Commun. 5, 3584 (2014).
- Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLoS Biol. 12 (5), 1001871 (2014).
- Krueger, S., Steinhauser, D., Lisec, J., Giavalisco, P. Analysis of subcellular metabolite distributions within Arabidopsis thaliana leaf tissue: a primer for subcellular metabolomics. Methods Mol Biol. 1062, 575-596 (2014).
- Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. FrontPlant Sci. 2, 54 (2011).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. Plant J. 68 (2), 364-376 (2011).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. Plant J. 73 (6), 897-909 (2013).
- Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Spagou, K., et al. Hydrophilic interaction chromatography coupled to MS for metabonomic/metabolomic studies. J Sep Sci. 33 (6-7), 716-727 (2010).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant physiol. 162 (3), 1290-1310 (2013).
- Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytol. 196 (4), 1098-1108 (2012).
- Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. Plant J. 70, 972-982 (2012).
- Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. Plant J. 81 (3), 529-536 (2015).
- Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLoS Biol. 13 (2), 1002053 (2015).
- Kueger, S., Steinhauser, D., Willmitzer, L., Giavalisco, P. High-resolution plant metabolomics: from mass spectral features to metabolites and from whole-cell analysis to subcellular metabolite distributions. Plant J. 70 (1), 39-50 (2012).
