Summary
En protokol til omfattende ekstraktion af lipider, metabolitter og proteiner fra biologiske væv under anvendelse af en prøve er præsenteret.
Abstract
Forståelse af komplekse biologiske systemer kræver måling, analyse og integration af flere sammensatte klasser af levende celle, som regel bestemmes af transkriptomiske, proteomiske, metabolomiske og lipidomiske målinger. I denne protokol introducerer vi en simpel metode til reproducerbar ekstraktion af metabolitter, lipider og proteiner fra biologiske væv under anvendelse af en enkelt alikvot pr. Prøve. Ekstraktionsmetoden er baseret på et methyl tert -butylether: methanol: vandsystem til væske: flydende opdeling af hydrofobe og polære metabolitter i to ublandbare faser sammen med udfældningen af proteiner og andre makromolekyler som en fast pellet. Denne metode tilvejebringer derfor tre forskellige fraktioner af specifik molekylær sammensætning, som er fuldt kompatible med almindelige højtydende 'omics' teknologier såsom væskekromatografi (LC) eller gaskromatografi (GC) koblet til massespektrometre. Selv om metoden var initIalt udviklet til analyse af forskellige plantevævsprøver har det vist sig at være fuldt kompatibel til udvinding og analyse af biologiske prøver fra systemer, der er så forskellige som alger, insekter og pattedyrvæv og cellekulturer.
Introduction
Systembiologi, der opstod i midten af det sidste århundrede 1 og blev fremmet ved storskalaanalysen af genomiske og transkriptomiske datasæt 2 , 3 , har udviklet sig til en ny og uundværlig tilgang til analysen af komplekse biologiske systemer 4 , 5 . Hovedformålet med systembiologi er at dechiffrere komponentinteraktionerne og afhængighederne i biologiske systemer og at broere forbindelsen mellem genotyper, deres realisering, molekylære transformationer og resulterende fænotyper. Derfor er integrationen af omfattende datasæt, der er produceret af de forskellige analysemetoder i stor skala, nemlig genomics, transcriptomics, metabolomics, lipidomics og proteomics og deres beregningsanalyse blevet en forudsætning for beskrivelse og forståelse af komplekse biologiske systemer.
Bas Redegør for den enorme kemiske mangfoldighed og kompleksitet af biologiske komponenter i ethvert levende system, afhænger produktionen af store og omfattende 'omics'-datasæt stærkt på kvaliteten af den anvendte ekstraktionsmetode 9 . Ud over kvaliteten af ekstraktionsmetoden er metoden økonomi vigtig; Dette betyder, at det ville være ønskeligt at opnå så meget molekylær information fra så lidt prøveindgang som muligt. Ofte kan prøve mængder være begrænsende, og derfor er det yderst ønskeligt at anvende en ekstraktionsmetode, som kan udlede så mange molekylære klasser fra en enkelt ekstraktion af en given prøve. Dette betyder, at i stedet for at anvende flere specialiserede ekstraktionsmetoder til ekstraktion af forskellige sammensatte klasser fra forskellige prøvealikvoter af den samme prøve anvendes en sekventiel ekstraktionsmetode, som fraktionerer de molekylære bestanddele i en enkelt alikvot i forskellige molekylfraktioner.
Den fælles metode anvendt til disse fraktionerede ekstraktionsmetoder er baseret på tofase-lipidekstraktionsmetoden fra Folch et al., Udviklet i 1957 10. Denne fremgangsmåde er baseret på en chloroform: methanol / vandopdeling af polære og hydrofobe metabolitter og var Beregnet til oprydning og afkompleksprøver til højkvalitets lipidanalyse. Med udviklingen af multi-omics-systembiologi blev Folch-metoden yderligere trinvist forbedret ved at anvende den til prøveopdeling af proteiner og polære metabolitter og lipider til Gas- og væskekromatografi-baserede metabolomikker og lipidomika af polære og hydrofobe forbindelser ud over væskekromatografi-baserede proteomika 11 , 12 , 13 , 14. Desværre er alle disse fremgangsmåder afhængige af en chloroformbaseret ekstraktionsmetode, som ikke alene Fører til den uønskede foRation af proteinpelleten som en interfase mellem den polære og lipidfasen, men som også er et uønsket opløsningsmiddel fra et grønt kemiperspektiv 15 , 16 . Opløsningsmidlet methyl- tert -butylether (MTBE) overvinder imidlertid begge disse ovennævnte problemer og er en egnet erstatning for chloroform. På baggrund af disse krav besluttede vi at etablere en MTBE: methanol: vandbaseret ekstraktionsmetode, som opfylder alle ovennævnte specifikationer og derfor fungerer som et ideelt udgangspunkt for omfattende multi-omics analyse 16 . Denne protokol styrer brugeren trin for trin gennem den enkle, hurtige og reproducerbare arbejdsgang i prøvepræparatet, herunder fejlfinding af almindeligt observerede problemer. Endvidere vil vi kort introducere eksemplariske analytiske data fra ultrapræstationsvæskekromatografi-massespektrometri (UPLC-MS) -basEd lipidomics, metabolomics og proteomics profilering fra plantevævsprøver. Selv om de givne eksempler er afledt af 50 mg af en Arabidopsis thaliana leafvævsprøve , er denne protokol blevet anvendt til adskillige andre biologiske prøver og væv, herunder alger 17 , 18 , insekter 19 og pattedyrsceller, organer og væv 20 , 21 , 22 . Omfanget af den præsenterede ekstraktionsprotokol er at tilvejebringe en klar og detaljeret beskrivelse af forudvindingsprøvehåndteringen og selve udvindingsproceduren. Selvom vi giver tre korte eksempler på analytisk anvendelse, kan vi få detaljerede oplysninger om den forud- og postanalytiske datahåndtering fra vores tidligere publikationer 16 , 23 , 24 ,
Protocol
Forsigtig : Methanol (MeOH) og methyl tert -butylether (MTBE), der anvendes under udvinding, er brandfarlige og kan ved længere tids påvirkning og / eller kontakt, åndedræts-, øjen- eller hudirritation. Behør dem kun omhyggeligt i en gashætte og brug de relevante sikkerhedsprocedurer under ekstraktionen (lab coat, sikkerhedsbriller, handsker osv. ). Flydende kvælstof og tøris, der anvendes i flere trin i denne protokol, kan forårsage alvorlige forbrændinger ved længerevarende hudkontakt. Håndter dem omhyggeligt ved at bære beskyttelseshandsker og briller. Brugere kan bruge forskellige kemikalier, reagenser eller interne standarder til prøveanalyse, hvoraf nogle kan være giftige. Se venligst de relevante kemikaliesikkerhedsdatablade for alt anvendt materiale.
1. Indsamling og høstning af biologiske prøver
- Forbered mærket høstrør.
BEMÆRK: Høst biologiske prøver i mærket, 2 ml, rundbundet, sikkert stedK mikrocentrifugerør indeholdende to 5 mm diameter metalboller til vævshomogenisatoren. - Forbered en fyldt flydende nitrogen dewar.
- Høst den biologiske prøve og snavse vævet i flydende nitrogen. Udfør dette trin så hurtigt som muligt inden for få sekunder for at undgå metaboliske forandringer induceret ved sår.
Bemærk: Til demonstration skal du bruge rosetblade fra 30 dage gamle vildtype Arabidopsis thaliana (Col-0) dyrket på jord under lange dage. - Opbevar de høstede prøver på tøris til kortvarige pauser eller opbevar dem ved -80 ° C i længere perioder.
2. Slibning og vævsforstyrrelse
- Forkøl rørholderne af vævshomogenisatoren i flydende nitrogen i mindst 10 minutter. Hvis en vævshomogenisator ikke er tilgængelig, skal du bruge rene og forkølede mørtel og pistler.
- Tag prøverne fra frysen med flydende nitrogen, tøris eller -80 ° C, og læg dem i den forkøledeRørholdere.
- Sæt rørholderne hurtigt i vævshomogenisatoren.
- Slib det biologiske materiale til et fint og homogent pulver. Brug 20 Hz i 1 min til blade.
Bemærk; Homogeniseringstid og -hastighed kan varieres afhængigt af vævet, så sørg for at prøven homogeniseres i et fint pulver, og at dette pulver holdes frosset ved hvert trin i homogeniseringen. - Tag de biologiske prøver fra rørholderne og hold dem frosne indtil yderligere ekstraktion.
3. Vejning af væv
- Brug en analytisk balance med tilstrækkelig præcision til de nødvendige prøve mængder.
- Forbered et mærket 2 ml rundbundet, sikker låsemikrocentrifugerør.
- Forkøl rørene og spatlerne i flydende nitrogen.
- Aliquot den krævede mængde vævspulver ind i 2 ml sikker lås mikrocentrifugerøret.
Forsigtig: Undgå eventuel afrimning af plantematerialet ved at minimere den tid der tages til wLige prøverne. - Ret de aliquotede prøver umiddelbart efter vejning til flydende nitrogen.
- Optag for hver prøve den nøjagtige vægt. Brug 10-50 mg ± 10% for de fleste plantevæv.
- Opbevar de aliquotede prøver ved -80 ° C indtil yderligere ekstraktion.
4. Reagensopsætning
- Brug en ekstraktionsblanding af methyl tert -butylether (MTBE) / methanol (MeOH).
- Til fremstilling af 100 ml ekstraktionsopløsningsmiddel tilsættes 75 ml MTBE til 25 ml MeOH for at gøre en blanding af MTBE: MeOH (3: 1, vol / vol).
- Tilføj interne standarder for normalanalysen efter analytiske behov. Typisk tilsættes 50 μl 1,2-diheptadecanoyl- sn -glycero-3-phosphocholin (1 mg / ml i chloroform) som en intern standard for UPLC-MS-baseret lipidanalyse under tilsætning af 50 μl 13 C sorbitol ( 1 mg / ml i vand) som interne standarder for den GC-MS-baserede analyse af primæremetabolitter. Interne standarder for UPLC-MS-baseret metabolitanalyse er 50 μl corticosteron (1 mg / ml i methanol) og 25 μl ampicillin (1 mg / ml i methanol).
- Overfør opløsningsmidlet til en ren glasflaske, der blev skyllet med MTBE: MeOH-blanding.
- Opbevar ekstraktionsblandingen i op til 1 uge ved 4 ° C.
BEMÆRK: Gem ikke ekstraktionsblandingen i længere perioder for at opretholde reproducerbare resultater.
- For at fremkalde faseseparation anvendes vand (H20) / methanol (MeOH).
- Til fremstilling af 100 ml H20: MeOH tilsættes 75 ml H20 til 25 ml MeOH for at gøre H20: MeOH (3: 1, vol / vol).
- Overfør opløsningsmidlet til en ren glasflaske, der blev skyllet med H20: MeOH-blanding. Dette opløsningsmiddel kan opbevares i flere uger ved stuetemperatur.
5. Ekstraktion af prøver
- Forkøl ekstraktionen mIxtur (MTBE: MeOH, 3: 1, vol / vol) til -20 ° C ved anvendelse af et flydende kølesystem eller en -20 ° C fryser.
- Tag de alikvoterede prøver ud en efter en, og tilsæt 1 ml af den forkølede ekstraktionsblanding til hvert prøverør. Forsigtig: Udfør dette trin hurtigt på grund af MTBE's lave viskositet.
- Bland straks på en hvirvelblander, indtil vævet er godt homogeniseret i ekstraktionsblandingen.
BEMÆRK: Dette trin er meget vigtigt, da det er nødvendigt at udfælde proteinerne og inaktivere deres enzymatiske aktiviteter. - Inkuber alle prøverne på en orbital shaker ved 100 rpm i 45 minutter ved 4 ° C.
- Sonikere prøverne i 15 minutter i et isafkølet sonikationsbad.
6. Fraktionering ved faseseparation
- Tilsæt 650 μl H20: MeOH (3: 1, vol / vol) til hvert prøverør.
- Bland godt ved vortexing i 1 min.
- Centrifuger prøverne med en hastighed på 20.000 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
BEMÆRK: Efter dette trin er der to ublandbare væskefaser med en fast pellet i bunden af røret.
Forsigtig: Håndter rørene omhyggeligt for at undgå blanding af de to væskefaser og undgå at forstyrre den udfældede pellet.
7. Aliquoting af polære og hydrofobe fraktioner
- Overfør 500 μl af opløsningsmidlet fra den øvre lipidholdige fase til et mærket 1,5 ml mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: De alikvoterede lipidprøver kan koncentreres direkte til øjeblikkelig UPLC-MS analyse (trin 8.1) eller opbevares i adskillige uger ved -80 ° C. - Når først 500 μL er fjernet fra prøven, fjern den resterende lipidfase ved hjælp af en 200 μl pipette.
- Overfør 400 μL af opløsningsmidlet fra den nedre fase (polære og semipolare metabolitter) i et mærket 1,5 ml mikrocentrifugerør. De alikvoterede polære prøver kan koncentreres direkte til øjeblikkelig UPLC-MS analyse (trin 8.2) eller opbevares foR adskillige uger ved -80 ° C.
- Tag en yderligere alikvot på 200 μL for at udføre yderligere analyser, fx gaschromatografibaseret metabolitanalyse som beskrevet dyrebart 16 .
- Fjern resten af vandfasen ved pipettering af overskydende volumen.
- Vask det opnåede protein, stivelsen, cellevægspelleten med 500 μL methanol ved grundigt vortexing den i 1 min.
- Centrifuger prøverne med en hastighed på 10.000 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
- Udfør proteinekstraktion og fordøjelse (trin 11) eller stivelse / cellevægsanalyse som beskrevet tidligere 16 .
BEMÆRK: Hvis de ikke anvendes straks, kan disse pellets opbevares i flere uger ved -80 ° C.
8. Koncentration og opbevaring af fraktioner
- Inddamp opløsningsmidlet fra lipidprøver (fra trin 7.1) i enten en vakuumkoncentrator uden opvarmning (i 1-2 timer) eller anvend fortrinsvis en nitrOgen flow evaporator for at undgå oxidative modifikationer af lipiderne.
BEMÆRK: Tørrede prøver skal analyseres straks. For opbevaring, lad prøver i MTBE-opløsning, helst i glasflasker (trin 7.1). - Inddamp opløsningsmidlet fra de vandige prøver (fra trin 7.3 eller 7.4) natten over i en vakuumkoncentrator uden opvarmning. BEMÆRK: De tørrede prøver kan opbevares i flere uger ved -80 ° C før analyse.
9. Analyse af lipider ved anvendelse af UPLC-MS 24
- Genopløs de tørrede lipidfraktioner (fra trin 8.1) i 400 μl acetonitril: 2-propanol (7: 3, vol / vol).
- Overfør tilstrækkelig væske til glasflasker og hætte tæt.
- Sæt glasflaskerne i en afkølet autosampler (4 ° C).
- Injicer 2 μL pr. Prøve og adskiller lipiderne på en reverseret fase (RP) C 8 kolonne, der holdes ved 60 ° C ved anvendelse af et UPLC-system, der kører ved en strømningshastighed på 400 μl / min.
- Brug mobilenFaser beskrevet i tabel 1 til kromatografisk adskillelse.
- Accepter massespektrene i positiv og negativ ioniseringsfunktion ved hjælp af et egnet MS-instrument, der dækker massespektret mellem 150 og 1500 m / z.
10. Analyse af polære og semipolære metabolitter ved anvendelse af UPLC-MS 25 .
- Genopløs polarfasen (fra trin 8.2) i 200 μl UPLC-klasse methanol: vand (1: 1, vol / vol).
- Overfør tilstrækkelig væske til glasflasker og hætte tæt.
- Sæt glasflaskerne i en afkølet autosampler (4 ° C).
- Injicer 2 μL fra hver prøve og adskille metabolitterne på en RPC 18- søjle holdt ved 40 ° C ved anvendelse af et UPLC-system, der kører ved en strømningshastighed på 400 μl / min.
- Brug de mobile faser til chromatografisk adskillelse med parametrene angivet i tabel 2 .
- Få fuld scannings massespektre i positiv og negativ ioniseringsmodus osEt passende massespektrometer dækker et massespektrum mellem 50 og 1500 m / z.
11. Proteinekstraktion, fordøjelse og analyse 16
- Res suspender den vaskede protein / stivelse / cellevægspelleten (fra trin 7.8) i 200 μl af den valgte proteinekstraktionsbuffer. Bemærk: Vi bruger urinstof / thiourinstofbuffer (5 M urea, 2 mM thiourinstof, 15 mM DTT, 2% CHAPS og protease- og phosphataseinhibitorer) 27 .
- Sonikere prøverne i 10 minutter i et isafkølet sonicbad.
- Inkuber prøver i 30 minutter på en orbital shaker (100 rpm) ved stuetemperatur.
- Centrifuger de opløste proteiner ved 10.000 x g i 5 minutter.
- Saml protein supernatanten i et nyt rør.
- Bestem proteinkoncentrationen fra den opsamlede supernatant 28 .
- Fordel 50 μg protein i opløsning med en valgfri protokol. Brug typisk Trypsin / Lys-C mix accordiNg til brugsanvisningen.
- Efter fordøjelsen udføres afsaltning af peptiderne forud for massespektrometri ved anvendelse af C18-trintip og eluerer de fordøjede peptider 29 .
- Koncentrer prøverne til nær tørhed i en vakuumkoncentrator uden opvarmning.
- Re-suspendere prøverne i passende puffer (f.eks. 5% acetonitril, 0,5% myresyre) og analysere peptidblandingerne af LC-MS / MS ved anvendelse af et højopløsningsmassespektrometer forbundet med et nano-LC-system.
BEMÆRK: I det eksempelvise proteomikdatasæt, der er præsenteret i denne protokol, anvendte vi en gradient som beskrevet i tabel 3 . - Indstil massespektrometeret ved hjælp af en top 15-strategi, hvor en fuld scanning (FS) blev efterfulgt af op til 15 dataafhængige MS / MS-scanninger til følgende parametre: FS'en var i massespektret 200-2000 m / z ved En opløsning på 70.000 med en målværdi på 3x10 6 ioner. Få de dataafhængige MS / MS-scanninger af højere-enhedenRgy kollisional dissociation (HCD). Indstil målværdierne for MS / MS til 1e 5 ioner, med en maksimal ionfyldstid på 50 ms, et isoleringsvindue på 4,0 m / z, normaliseret kollisionsenergi (NCE) på 30% og et underfyldningsforhold på 1%. Mål MS / MS-ionerne ved en opløsning 17.500, og den dynamiske udelukkelse blev sat til 60 s.
Representative Results
Omfattende multi-omics datasæt er uvurderlige for forståelse af komplekse biologiske systemer. Strategien for et vellykket biologisk eksperiment starter normalt fra et meningsfuldt eksperimentelt design, forsøgsopsætning og ydeevne efterfulgt af prøveindsamling, ekstraktion, analytisk dataindsamling, rå databehandling, statistisk dataanalyse, identifikation af relevant metabolit og biologisk datafortolkning Herunder vejkortlægning og visualisering ( figur 1 ).
I den ekstraktionsprotokol, der er introduceret her, fokuserer vi på prøveopsamlings-, behandlings- og udtrækningsstrinene, som er afbildet i det detaljerede arbejdsprocesoversigt i figur 2 . Til demonstrationsformål blev 50 mg Arabidopsis bladvæv valgt. Dette materiale blev høstet, malet og ekstraheret, inden det blev underkastet treEksempler på analytiske UPLC-MS platforme, der tilvejebringer data, som kan anvendes til målrettet og ikke-målrettet lipidomisk, metabolomisk og proteomisk analyse. Figur 2 og 6 indeholder desuden repræsentative billeder af, hvordan ekstraktionsopløsningsmidlet under normale forhold skal se ud. Derudover er eksempler på prøver, der indeholder overskydende mængder af udfældede makromolekyler (proteiner og stivelse) og prøver med uhensigtsmæssig prøvehomogenisering vist ( figur 3 ). Fejlfinding for disse to almindelige problemer er givet kortfattet i figur 3, men det er også diskuteret mere detaljeret i vores tidligere publikation 16 .
Figur 4 og 5 beskriver eksempler på tre analytiske kromatogrammer afledt af lipidet, den polære / semI-polære metabolitter og proteinanalyser. Lipider, som blev taget fra den øvre MTBE-fase ( figur 2 ), blev analyseret ved reversfase (RP) C8 ultrapræstationsvæskekromatografi koblet til højopløsningsmassespektrometri. Lipider kan erhverves ved hjælp af positive og negative MS ioniseringsmåder ( Figur 4 , øvre rude) 16 , 24 .
Polære og semipolære primære og sekundære metabolitter blev analyseret fra den polære (vand / methanol) fase ( figur 2 ) ved revers fase (RP) C18 UPLC-MS 25 . Den illustrerede metode ved anvendelse af reversfasekromatografi er yderst kompatibel med analysen af semipolære metabolitter (nemlig metabolitter fra plant sekundær metabolisme), som kan analyseres ved anvendelse af positive og negative ioniseringsformer i MS( Figur 4 , nederste rude) 16 . Flere hydrofile metabolitter fra denne fraktion (sukkerarter, polære aminosyrer etc.), som ikke viser god retention på det omvendte fase materiale, kan analyseres ved hjælp af andre analytiske metoder, såsom GC-MS 16 eller hydrofil væskekromatografi 30 .
Proteinerne, der blev hentet fra den faste pellet i bunden af ekstraktionsrøret ( fig. 2 ) blev fordøjet og analyseret ved opløsning ved anvendelse af skudkanon LC-MS ( figur 5 ), mens protokollen til udvinding af stivelses- og cellevæg Materiale kan hentes fra vores tidligere offentliggjorte protokol 16 .
Sammenfattende er der mere end 200 lipidarter, 50 annoterede semipolære metabolitter og flere tusinde proteinerNs kan rutinemæssigt identificeres fra prøver af den type, der anvendes i vores eksempel. Derudover viste metoden bred anvendelighed ved anvendelse af forskellige væv, organer og cellekulturmateriale ( figur 6 ).
Figur 1: Generel Workflow for storskala ikke-målrettet Omics-analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Prøveforberedelse og ekstraktionsarbejdsstrøm til analyse af lipider, metabolitter og proteiner fra en enkelt alikvot af en biologisk prøve.Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 : Illustrative eksempler på almindeligt observerede problemer ved anvendelse af tofase-partitioneringsekstraktionsprotokoller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : Repræsentative kromatogrammer af lipid- og semipolare metabolitter fra Arabidopsis thaliana-bladeekstrakter . Base-topkromatogramS af lipider (øvre rude) og semipolære metabolitter (nederste rude) analyseret i positiv ioniseringsfunktion 16 . Kakediagrammerne i øverste højre hjørne af hvert kromatogram viser antallet af identificerede lipider og metabolitter tildelt til forskellige kemiske klasser. Chl, chlorophylls; DAG, diacylglycerid; DGDG, digalactosyldiacylglycerol; FA, fedtsyre; LysoPC, lysophosphatidylcholin; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, phosphatidylcholin; PE, phosphatidylethanolamin; PG, phosphatidylglycerol; PI, phosphatidylinositol; PS, phosphatidylserin; SP, sphingolipid; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol; TAG, triacylglycerid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5
Cirkeldiagrammet i øverste højre hjørne angiver antallet af identificerede proteiner, der er tildelt forskellige biologiske processer 16 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6 : Repræsentative ekstraktionseksempler af forskellige vævstyper fra Wild-type Arabidopsis thaliana .
Alle prøver blev ekstraheret under anvendelse af 50 mg frisk vægt fra de angivne væv."> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
| Tid (min) | % Buffer A til buffer B | |
| 0 til 1 min | 45% A | Buffer A: 1% 1 M NH4-acetat, 0,1% eddikesyre i UPLC MS grade vand |
| 1 til 4 min | Lineær gradient fra 45% A til 25% A | Buffer B: 1% 1M NH4-acetat, 0,1% eddikesyre i acetonitril / isopropanol 7: 3, (v: v) |
| 4 til 12 min | Lineær gradient fra 25% A til 11% A | Flowhastighed 400 μl / min |
| 12 til 15 minutter | Lineær gradient fra 11% A til 0% A | Injektionsvolumen 2 μl |
| 15 til 19,5 min | Vask kolonnen i 4,5 min med 0% A | |
| Sæt tilbage til 45% A | ||
| 19,51 til 24 min | Equilibrere med 45% A |
Tabel 1: Gradientparametre til RP-UPLC-adskillelse af lipider. RP, omvendt fase. UPLC, ultrapræstationsvæskekromatografi.
| Tid (min) | % Buffer A til buffer B | |
| 0 til 1 min | 99% A | Buffer A: 0,1% myresyre i vand af UPLC-kvalitet |
| 1 til 11 minutter | Lineær gradient fra 99% A til 60% A | Buffer B: 0,1% myresyre i UPLC grad acetonitril |
| 11 til 13 min | Lineær gradient fra 60% A til 30% A | Flowhastighed 4001 L / min |
| 13 til 15 minutter | Lineær gradient fra 30% A til 1% A | Injektionsvolumen 2 μl |
| 15 til 16 min | Vask kolonnen i 1 minut med 1% A | |
| 16 til 17 min | Lineær gradient fra 1% A til 99% A | |
| 17 til 20 min | Equilibrere i 3 minutter ved 99% A |
Tabel 2: Gradientparametre til RP-UPLC-adskillelse af polære og semipolare metabolitter. RP, omvendt fase. UPLC, ultrapræstationsvæskekromatografi.
| Tid (min) | % Buffer B til buffer A | |
| 0 til 5 min | Lineær gradient fra 0 til 10% | Buffer A: 0,1% myresyre i vand af UPLC-kvalitet |
| 5 til 80 min | Lineær gradient fra 10% til 40% | Buffer B: 0,1% myresyre i 60% acetonitril af UPLC-kvalitet |
| 80 til 85 min | Lineær gradient fra 40% til 60% | Flowhastighed 300 nL / min |
| 85 til 86 min | Lineær gradient fra 60% til 95% | Injektionsvolumen 5 μl |
| 86 til 91 min | Vask kolonne i 5 minutter med 95% | |
| 91 til 92 min | Lineær gradient fra 95% til 0% | |
| 93 til 110 min | Equilibrere kolonnen i 17 minutter ved 0% |
Tabel 3: Gradientparametre for nano-LC-adskillelse af peptider. LC, væskekromatografi.
Discussion
I denne artikel beskriver og illustrerer vi en enkel og meget anvendelig ekstraktionsprotokol til omfattende lipidomisk, metabolomisk og proteomanalyse fra en enkelt 50 mg bladprøve. Metoden har tidligere været anvendt i flere undersøgelser, som er blevet offentliggjort i forskellige artikler 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 Og viste sig, ud over sin straight-forwardWorkflow og høj anvendelighed er robuste og reproducerbare.
De her tilvejebragte ansøgninger viser nogle rutinemetoder til indledende screening af en kompleks biologisk prøve. Disse illustrerede storskala metabolomiske og lipidomiske datasæt kan give fuldstændig information om de brede eller specifikke ændringer i metabolisme af det analyserede biologiske system, mens dataene opnået ved analyse af proteiner giver indsigt i kvantitative (overflod) og kvalitative (modifikationer ) Ændringer af enzymer, strukturelle proteiner eller transkriptionsfaktorer (TF'er), der styrer cellulære funktioner og maskiner. Følgelig har integrative omics-data potentialet til at afsløre initial information om mulige ændringer induceret af genetiske eller biotiske og / eller abiotiske forstyrrelser af et biologisk system ved at belyse molekylære ændringer af forskellige molekyler associeret med specifikke metaboliske veje eller cellulære processer.
SelvfølgeligPå lang sigt er det helt afgørende for en vellykket systembiologianalyse at maksimere antallet af analyserede og annoterede molekylære enheder, hvilket muliggør overvågning af cellulære funktioner og aktiviteter så fuldstændigt som muligt. Til dette formål kunne de opnåede fraktioner anvendes i tillæg til forskellige analytiske metoder, der målretter mod yderligere forbindelser eller sammensatte klasser ( figur 4 ).
Når det er sagt, må det nævnes, at den globale analysestrategi for de opnåede data kan følges ved to forskellige strategier: På den ene side har vi lagt vægt på belysningen af cellulære funktioner ved kvantificering af kendte forbindelser. På den anden side er mange af de målte metabolitter og lipider endnu ikke kendt eller annoteret. Disse ikke-annoterede sammensatte målinger indeholder også masser af meningsfuld information, som kan anvendes ved statistiske metoder til klassificering eller diskrimination bEtween grupper eller behandlinger 20 , 21 , 22 .
Alligevel skal disse ukendte forbindelser, især dem der er relevante for gruppeklassifikation eller betjening som biomarkører, identificeres. Denne identifikationsproces er desværre ganske kedelig og kan ikke opnås uden yderligere analytiske målinger eller strategier 38 . Som det fremgår af figur 4 er antallet af ikke-annoterede forbindelser ganske højt (faktisk langt størstedelen). Ikke desto mindre, som nævnt ovenfor, kan disse kromatografiske toppe håndteres inden for dataanalysen, og derfor kan signifikant berørte enheder belyses og underkastes yderligere identifikationsstrategier.
Sammenfattende kan vi konkludere, at den her indførte protokol giver flere fordele for eksperimentelle systembiologi såvel som for klassisk statistisk applikationtioner.
For det første reduceres variationen mellem de forskellige eksperimentelle datasæt (lipider, metabolitter, proteiner), da alle fraktioner ekstraheres fra en enkelt prøve, da hvert datasæt er afledt fra den samme prøvealikvot. Dette fører klart til den øgede sammenlignelighed af de opnåede resultater.
For det andet er metoden let skalerbar og gør den derfor meget kompatibel med små til store prøve mængder. Vi bruger rutinemæssigt 10-100 mg vævsprøver, men vellykkede lipidomiske undersøgelser er også blevet udført på så lidt som 20 arabidopsisfrø 31 . Især kompatibiliteten med små prøve mængder gør denne metode gældende, hvis der er begrænsede mængder biologiske væv eller prøver. Selv om der foreligger tilstrækkeligt prøvemateriale, giver den her beskrevne metode den fordel at anvende disse prøver i et større antal eksperimentelle replikater i stedet for digSyng dem for forskellige udvindingsprocedurer. Dette giver mulighed for en bedre og raffineret statistisk data analyse.
For det tredje, da fremgangsmåden er baseret på en væske-væskefraktionering af polære og ikke-polære molekyler, tilvejebringer det i modsætning til simple enfase-ekstraktionsmetoder ( fx metanolekstraktioner) et signifikant de-kompleksdannelsestrin i proceduren. Denne effektive prøve-de-kompleksdannelse fører til en delvis oprensning af de individuelle fraktioner som følge af adskillelsen af kemisk interfererende molekyler fra hinanden. Følgelig giver den kemiske partitioneringsproces ikke kun en praktisk fordel for systematisk alikvotering af de ekstraherede prøver i forskellige kemiske klasser, men forbedrer også de enkelte analytiske målinger, da det fjerner forurenende forbindelser fra de forskellige fraktioner. Det kan klart ses, at især lipiderne, der er opdelt i den organiske fase, og som normalt påvirkerKromatografisk analyse af polære forbindelser vil være næsten fuldstændig fraværende fra den polære fraktion. Det samme gælder for analysen af de hydrofobe lipider, som vil blive udarmet af de polære forbindelser. Udover rensningen af polære og ikke-polære forbindelser fra hinanden nedbryder og samler vi proteiner og andre makromolekyler fra prøven, som ikke kun tilvejebringer en separat fraktion, der kan anvendes til protein-, stivelse- og cellevægsanalyse 16 , men også Fører til en renere prøve inden for de enkelte fraktioner. Dette er især relevant, da det er kendt, at tilstedeværelsen af store makromolekyler fører til skade eller i det mindste kortere levetid for de analytiske søjler.
Sidst men ikke mindst er den beskrevne MTBE-ekstraktionsmetode, der er baseret på det mindre farlige og mere fordelagtige chloroform-erstatningsmiddel 15 , allerede blevet vist ved flere undersøgelser fra vores gruppe for at være meget applIcability for forskellige biologiske prøver fra planter 16 , alger 17 , 18 , flyver 19 men også adskillige pattedyrvæv, organer eller celler 20 , 21 , 22 .
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
MS understøttes af et fuldt ph.d.-stipendium fra GERLS-DAAD-programmet. Vi vil gerne takke Dr. Andrew Wiszniewski for korrekturlæsning og kommentere manuskriptet. Vi er meget taknemmelige for alle medlemmerne af Giavalisco-labet på Max-Planck Institut for Molekylærfysiologi, Golm, Tyskland for deres hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Equipment | |||
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Tissue grinding mixer mill | Retsch, Mixer Mill MM 300 | 20.746.0001 | |
| Mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464-1EA | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| 2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| 1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| MS system | Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany). | ||
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system | Thermo-Fisher, Bremen, Germany | Analysis of peptides |
References
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J Physiol. 117 (4), 500-544 (1952).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Yang, M. Q., et al. The emerging genomics and systems biology research lead to systems genomics studies. BMC Genomics. 15, Suppl 11 1 (2014).
- Sheth, B. P., Thaker, V. S. Plant systems biology: insights, advances and challenges. Planta. 240 (1), 33-54 (2014).
- Ideker, T., Galitski, T., Hood, L. A new approach to decoding life: Systems biology. Annu Rev Genom Hum G. 2, 343-372 (2001).
- Somvanshi, P. R., Venkatesh, K. V. A conceptual review on systems biology in health and diseases: from biological networks to modern therapeutics. Syst Synth Biol. 8 (1), 99-116 (2014).
- Oliver, S. G., Winson, M. K., Kell, D. B., Baganz, F. Systematic functional analysis of the yeast genome. Trends Biotechnol. 16 (9), 373-378 (1998).
- Tweeddale, H., Notley-McRobb, L., Ferenci, T. Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli, as revealed by global metabolite pool ("metabolome") analysis. J Bacteriol. 180 (19), 5109-5116 (1998).
- Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical analysis : PCA. 21 (1), 4-13 (2010).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Weckwerth, W., Wenzel, K., Fiehn, O. Process for the integrated extraction, identification and quantification of metabolites, proteins and RNA to reveal their co-regulation in biochemical networks. Proteomics. 4 (1), 78-83 (2004).
- Wienkoop, S., et al. Integration of metabolomic and proteomic phenotypes: analysis of data covariance dissects starch and RFO metabolism from low and high temperature compensation response in Arabidopsis thaliana. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1725-1736 (2008).
- Valledor, L., et al. A universal protocol for the combined isolation of metabolites, DNA, long RNAs, small RNAs, and proteins from plants and microorganisms. Plant J. 79 (1), 173-180 (2014).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1 (3), (2016).
- Alfonsi, K., et al. Green chemistry tools to influence a medicinal chemistry and research chemistry based organisation. Green Chem. 10 (1), 31-36 (2008).
- Salem, M. A., Juppner, J., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. Protocol: a fast, comprehensive and reproducible one-step extraction method for the rapid preparation of polar and semi-polar metabolites, lipids, proteins, starch and cell wall polymers from a single sample. Plant Methods. 12, 45 (2016).
- Hemme, D., et al. Systems-wide analysis of acclimation responses to long-term heat stress and recovery in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 26 (11), 4270-4297 (2014).
- Sharma, D. K., et al. UPLC-MS analysis of Chlamydomonas reinhardtii and Scenedesmus obliquus lipid extracts and their possible metabolic roles. J Appl Phycol. 27 (3), 1149-1159 (2015).
- Delgado, R., Munoz, Y., Pena-Cortes, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Bozek, K., et al. Organization and evolution of brain lipidome revealed by large-scale analysis of human, chimpanzee, macaque, and mouse tissues. Neuron. 85 (4), 695-702 (2015).
- Khrameeva, E. E., et al. Neanderthal ancestry drives evolution of lipid catabolism in contemporary Europeans. Nat Commun. 5, 3584 (2014).
- Bozek, K., et al. Exceptional evolutionary divergence of human muscle and brain metabolomes parallels human cognitive and physical uniqueness. PLoS Biol. 12 (5), 1001871 (2014).
- Krueger, S., Steinhauser, D., Lisec, J., Giavalisco, P. Analysis of subcellular metabolite distributions within Arabidopsis thaliana leaf tissue: a primer for subcellular metabolomics. Methods Mol Biol. 1062, 575-596 (2014).
- Hummel, J., et al. Ultra performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry for the analysis of plant lipids. FrontPlant Sci. 2, 54 (2011).
- Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. Plant J. 68 (2), 364-376 (2011).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. Plant J. 73 (6), 897-909 (2013).
- Giavalisco, P., et al. Proteome analysis of Arabidopsis thaliana by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry. Proteomics. 5 (7), 1902-1913 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Spagou, K., et al. Hydrophilic interaction chromatography coupled to MS for metabonomic/metabolomic studies. J Sep Sci. 33 (6-7), 716-727 (2010).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in Arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Watanabe, M., et al. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant physiol. 162 (3), 1290-1310 (2013).
- Lambers, H., et al. Proteaceae from severely phosphorus-impoverished soils extensively replace phospholipids with galactolipids and sulfolipids during leaf development to achieve a high photosynthetic phosphorus-use-efficiency. New Phytol. 196 (4), 1098-1108 (2012).
- Degenkolbe, T., et al. Differential remodeling of the lipidome during cold acclimation in natural accessions of Arabidopsis thaliana. Plant J. 70, 972-982 (2012).
- Bromke, M. A., et al. Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry for fatty acid profiling. Plant J. 81 (3), 529-536 (2015).
- Li, N., et al. FAX1, a novel membrane protein mediating plastid fatty acid export. PLoS Biol. 13 (2), 1002053 (2015).
- Kueger, S., Steinhauser, D., Willmitzer, L., Giavalisco, P. High-resolution plant metabolomics: from mass spectral features to metabolites and from whole-cell analysis to subcellular metabolite distributions. Plant J. 70 (1), 39-50 (2012).
